Summary
En ultra-høyhastighets vestlig blotting teknikk er utviklet ved å forbedre kinetikk av antigen-antistoff binding gjennom syklisk drenering og etterfylling (CDR) teknologi i forbindelse med en immunoreaction styrkemiddel.
Abstract
En vestlig flekk (også kjent som en immunoblot) er en kanonisk metode for biomedisinsk forskning. Det er ofte brukt til å bestemme den relative størrelsen og overflod av spesifikke proteiner samt post-translasjonelle protein modifikasjoner. Denne teknikken har en rik historie og forblir i utbredt bruk på grunn av sin enkelhet. Imidlertid tar den vestlige blotting prosedyren berømt timer, selv dager, å fullføre, med en kritisk flaskehals er de lange inkubasjonstidene som begrenser gjennomstrømningen. Disse inkubasjonstrinnene er nødvendige på grunn av langsom diffusjon av antistoffer fra bulkløsningen til immobiliserte antigener på membranen: antistoffkonsentrasjonen nær membranen er mye lavere enn bulkkonsentrasjonen. Her presenterer vi en innovasjon som dramatisk reduserer disse inkubasjonsintervallene ved å forbedre antigenbindingen via syklisk drenering og etterfylling (CDR) av antistoffløsningen. Vi benyttet også en immunoreaction styrke teknologi for å bevare følsomheten av analysen. En kombinasjon av CDR-metoden med et kommersielt immunoreaksjonsfremmende middel økte utgangssignalet og reduserte antistoffinkubasjonstiden betydelig. Den resulterende ultra-høyhastighets vestlige blot kan oppnås i 20 minutter uten tap i følsomhet. Denne metoden kan brukes på vestlige flekker ved hjelp av både chemiluminescent og fluorescerende deteksjon. Denne enkle protokollen gjør det mulig for forskere å bedre utforske analysen av proteinuttrykk i mange prøver.
Introduction
En vestlig flekk (også kjent som en immunoblot) er en kraftig og grunnleggende teknikk på tvers av et bredt spekter av vitenskapelige og kliniske disipliner. Denne teknikken brukes til å undersøke tilstedeværelsen, relativ overflod, relativ molekylær masse og post-translasjonelle modifikasjoner av proteiner1. Kombinert med digital bildeanalyse kan denne metoden pålitelig analysere overflod av proteiner og proteinmodifikasjoner2. Selv om vestlig flekk utføres rutinemessig, er det en tidkrevende og arbeidsintensiv metode. Lange inkubasjoner av antistoffet med membraner er nødvendig. Her beskriver vi en endring av inkubasjonsmetoden som overvinner denne begrensningen uten å ofre følsomhet.
Under inkubasjon av membranen flyter antistoffer i oppløsning mens antigener immobiliseres på membranen. På grunn av deres høye affinitet er frekvensen av antistoffbinding til antigenet raskere enn diffusjonen av antistoffer fra bulkløsningen til membranen. Dette skaper et lavt konsentrasjons "uttømmingslag" (figur 1). Det kan ta timer for fjernere antistoffer å nå membranen via passiv diffusjon, som er den viktigste faktoren som er ansvarlig for lange inkubasjonstider i denne teknikken. Denne effekten kalles massetransportbegrensningen (MTL)3. Det har blitt foreslått at repeterende drenering og etterfylling av antistoffholdig løsning kan forstyrre uttømmingslaget og overvinne MTL4. Her har vi utviklet en unik teknikk som implementerer dette sykliske drenerings- og etterfyllingskonseptet (CDR) for å redusere effekten av MTL i en tradisjonell vestlig blottingprotokoll og forkortes bemerket å forkorte den nødvendige inkubasjonsperioden.
For å opprettholde deteksjonsfølsomheten med kort inkubasjonstid, benyttet vi oss av en immunoreaksjonsfremmende teknologi som akselererer antigen-antistoffreaksjonen, og dermed forbedrer signal-til-støy-forholdet5. Mange kommersielt tilgjengelige immunoreaction forsterkende midler (IRE) består av 2 komponenter (løsning 1 og 2, se materialtabell). Den proprietære sammensetningen eller virkningsmekanismen til IRE har ikke blitt avslørt, men vi har tidligere funnet ut at IRE reduserte dissosiasjonskonstanten mellom antigenet og antistoffet i solide fasebindende analyser, noe som indikerer økt affinitet er, i hvert fall delvis, ansvarlig for den forsterkende effekten av IRE6. Kombinasjonen av CDR med IRE gir en ultra-høyhastighets vestlig blottingprotokoll som reduserer hele prosedyretiden uten å ofre følsomhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SDS-PAGE og overføre til en PVDF membran
- Utfør SDS-PAGE for å skille proteiner basert på relativ størrelse.
MERK: Ethvert kommersielt eller hjemmelaget gelsystem er greit. Følg produsentens protokoll. - Overfør separerte proteiner fra en gel til en PVDF-membran.
MERK: Vanlige overføringsmetoder (semi-tørr eller våt overføring) er egnet. Følg produsentens protokoll.
2. Blokkering av PVDF membraner
- Inkuber membranene i passende blokkeringsbuffere i 1 time med agitasjon ved romtemperatur.
MERK: Avhengig av det primære antistoff- og deteksjonssystemet, bør det velges en passende blokkeringsbuffer. For eksempel er de mest typiske blokkerene BSA, fettfri tørr melk, casein og kommersielle syntetiske polymerer. PBS og/eller TBS med 0,1 % Tween20 er de mest brukte bufferne. Dette blokkeringstrinnet kan gjøres over natten ved 4 °C.
3. Inkubasjon med primært antistoff
- Forbered 10% immunoreaction forsterkende agent-1 løsning (IRE-1) med destillert vann. Vortex godt.
- Forbered det fortynnede primære antistoffet med 10% IRE-1. Bland det forsiktig og grundig.
- Hvis du bruker en større membran (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm), tilsett 8 ml antistoffoppløsning i 50 ml koniske sentrifugerør. Hvis du bruker en mindre membran (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm), tilsett 3 ml antistoffoppløsning i 14 ml polypropylenrør i rundbunn (Materialsegraf).
- Plukk opp PVDF-membranen med pinsett og tøm blokkeringsløsningen kort. Sett PVDF-membranen inn i dette røret med hanskefingre og sørg for at hele membranen fester seg til veggen på røret. Når PVDF membranen settes inn i et rør, vender du "proteinsiden" av membranen som opprinnelig var i kontakt med gelen innover. Lukk hetten tett.
- Sett 50 ml røret inn i en glassflaske for hybridiseringsovnen.
MERK: Når 14 ml rør brukes til denne inkubasjonen, setter du inn et 14 ml rør i 50 ml-røret, ved hjelp av et par plastringholdere for å holde det indre røret i midten av 50 ml-røret. - Slå på hybridiseringsovnen.
- Inkuber membranen med 6 rpm rotasjon i minst 5 min.
MERK: Pass på at membranen holder seg til veggen til enhver tid, og at (indre) røret er horisontalt for å dekke membranen med antistoffoppløsningen jevnt. Kalibrer fortynningen av antistoffet og inkubasjonstiden før selve eksperimentet.
4. Membranvask
- Stopp rotasjonen.
- Fjern forsiktig PVDF-membranen fra røret med pinsett, og legg membranen i en beholder med 50 ml PBS-T.
- Skyll membranen kort med PBS-T.
- Skyll membranen i beholderen med destillert vann til det ikke vises bobler. Dette er for å fjerne flertallet av antistoffet.
- Overfør PVDF-membranen fra beholderen til salatspinneren som inneholder 250 ml PBS-T.
- Legg silkurven i spinneren. Kontroller at lokket er satt på riktig måte.
- Aktiver spinneren og kjør den i ca 20-30 s.
- Kast oppløsningen og skyll innsiden av spinneren kort med destillert vann.
- Legg til 250 ml PBS-T i spinneren igjen.
- Gjenta trinn 4.6 og 4.7.
5. Inkubasjon med sekundært antistoff
- Forbered 10% immunoreaction forsterkende agent-2 løsning (IRE-2) med destillert vann. Vortex godt.
- Forbered det fortynnede sekundære antistoffet med 10% IRE-2. Bland det forsiktig og grundig.
- Velg volumet på antistoffløsningen og røret som angitt i trinn 3.3.
- Plukk opp PVDF-membranen med pinsett og tøm oppløsningen kort. Sett PVDF-membranen inn i røret som angitt i trinn 3.4.
- Sett 50 ml røret inn i en glassflaske for hybridiseringsovnen.
- Slå på hybridiseringsovnen.
- Inkuber membranen med 6 rpm rotasjon i minst 5 min. Pass på at membranen holder seg til veggen til enhver tid, og at (indre) røret er horisontalt for å jevnt dekke membranen med antistoffløsningen.
MERK: Kalibrer inkubasjonstiden før selve eksperimentet. Når det sekundære antistoffet er fluorescerende konjugert, utfør inkubasjonen i mørket.
6. Membranvask
- Følg trinn 4.1 til 4.10.
7. Bildeanskaffelse
- Kjemiluminescerende deteksjon
- Plasser et stykke halvtransplantasjon fleksibel film (10 cm x 15 cm) på en flat overflate.
- Bland 2 komponenter i det kjemiluminescerende substratet i et 5 ml rør.
- Overfør umiddelbart 1,5 ml av det blandede substratet til den halvtransplantasjonsfærbare filmen og plasser PVDF-membranen på den. Deretter overfører du resten av substratløsningen til membranen.
- Inkuber PVDF-membranen med det blandede substratet på en halvgjennomsiktig fleksibel film i 1 min.
- Plukk opp PVDF-membranen med pinsett og tøm substratløsningen kort.
- Smør membranen mellom et par gjennomsiktighetsfilmer.
- Få bildet under chemiluminescent modus.
- Fluorescerende deteksjon
- Plukk opp PVDF-membranen med pinsett og tøm oppløsningen kort.
- Smør membranen mellom et par gjennomsiktighetsfilmer.
- Hent bildet under fluorescerende modus.
MERK: Trinn 7.1 og 7.2 skal utføres i nærheten av bildemaskinen for å sikre maksimal følsomhet. - Når bakgrunnssignalet er høyt, utfør et vasketrinn i en beholder med 80-100 ml PBS-T: 10 min skyll 3 ganger for det primære antistoffet og 5 min skyll 6 ganger for det sekundære antistoffet.
MERK: Både primære og sekundære antistoffer fortynnet med 10% IRE-løsninger kan brukes opptil 8-10 ganger uten tap avfølsomhet 6. Oppløsningen skal oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette eksemplet illustrerer effekten av CDR-metoden sammen med immunoenhancing teknologi på vestlige blot. Statisk inkubasjon ble utført på en halvgjennomsiktig fleksibel film hvor PVDF membraner ble inkubert med antistoffløsningen, mens CDR-inkubasjon var i en hybridiseringsovn ved å rotere rør som inneholdt membranene og antistoffløsningen (Movie). Figur 2 viste henholdsvis mengder antigen og antistoff som var nødvendig for kjemiluminescerende deteksjon på vestlige flekker. Ved både statiske og CDR-inkubasjoner økte bruken av IRE-oppløsning følsomheten: IRE reduserte den laveste mengden cellelylater (antigen) som trengs for å oppdage ß-actin fra 2,2 μg til 1,1 μg under statiske forhold og ytterligere redusert fra 1,1 μg til 0,275 μg ved hjelp av CDR (figur 2A). Tilsvarende ble minimumskonsentrasjonen av anti-6x Hans tag antistoff senket fra 100 ng / ml til 50 ng / ml under statiske forhold og fra 100 ng / ml til 12,5 ng / ml under CDR tilstand (figur 2B). CDR inkubasjon i enten 5 min eller 10 min dramatisk senket deteksjonsgrensen sammenlignet med statisk inkubasjon (60 min med primære og 30 min med sekundære antistoffer). Til slutt, kombinasjonen av CDR med IRE avslørte overlegen følsomhet på den vestlige blot (0.275 μg av cellelylater for ß-actin deteksjon og 12,5 ng / ml anti-6x Hans tag antistoff) selv innenfor denne ekstremt korte inkubasjonsperioden.
Det andre eksemplet viser vellykket anvendelse av denne metoden til en vestlig flekk med fluorescerende deteksjon (figur 3). Fluorescerende deteksjon, i motsetning til chemiluminescent deteksjon, har den unike evnen til å oppdage flere mål på samme blot samtidig uten stripping / re-sondering antistoffer. (Hans) 6 merket AP og ß-actin i cellelylatene ble samtidig oppdaget ved hjelp av en tofarget fluorofor. CDR inkubasjon med IRE ikke bare akselerert deteksjon, men også økt følsomhet, noe som resulterer i avsløring av nedbrytning av (Hans)6 merket AP (Figur 3A).
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av den sykliske dreneringsfyllende metoden (CDR).
(A)Et uttømmingslag i nærheten av membranen dannes raskt under statiske forhold når en sonde har høy affinitet for antigenet, men en begrenset evne til å spre seg gjennom løsningen. Dermed blir reisen av sonden til membranen et hastighetsbegrensende trinn og lange inkubasjonstider kompenserer for masseoverføringsbegrensning. (B) CDR-metoden ved å rotere røret mens membranen fester seg til veggen eliminerer uttømmingslaget og fyller den samme sondeløsningen for å holde sondekonsentrasjonen nær membranen konstant. Dette tallet er endret fra Higashi et al.6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: (A) Ulike mengder 293 cellelylater (1:2 seriell fortynninger fra 8,8 μg/lane) ble skilt av SDS-PAGE, etterfulgt av overføring til en PVDF-membran og blokkering med 5 % skummet melk i PBS-T. Flekken ble undersøkt med mus anti-ß-actin antistoff (1:3,000 fortynning). (B)Etter separasjon av besmittede medier avledet fra trans infiserte 293 celler med pAPTAG5 (GenHunter) som inneholder utskilles (Hans)6 tagget alkalisk fosfatase (AP, 8 x 10-14 mol / lane), proteiner ble overført til PVDF membraner. Hver membran ble utsatt for vestlig flekk med forskjellige konsentrasjoner av anti-6x Hans tag antistoff (1:2 seriell fortynninger fra 400 ng / ml). Membranene ble avbildet som et enkelt bilde og stiplede linjer indikerer grensen til individuelle membraner. Dette tallet er endret fra Higashi et al.6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Samtidig påvisning av flere mål på en vestlig flekk ved hjelp av fluorescerende deteksjon og CDR i forbindelse med IRE.
Ulike mengder lysater (1:2 seriell fortynning fra 10 μg/lane) fra 293 celler som ble transfisert med pAPTAG5 ble separert og overført til en PVDF-membran. Etter blokkering med blokkeringsbufferen for fluorescerende deteksjon (BFD) i 1 time, ble flekken undersøkt med anti-6X Hans tag og anti ß-actin antistoffer, etterfulgt av IRDye 800CW geit anti-kanin IgG og IRDye 680RD geit anti-mus IgG. A: antistoffer fortynnet med 10% IRE-oppløsning under CDR-tilstand, B: antistoffer fortynnet med BFD som inneholder 0,1% Tween20 under statisk tilstand. På grunn av høyere følsomhet med CDR og IRE kombinasjon, ble nedbrytningen av (Hans)6 merket AP sett. Dette tallet er endret fra Higashi et al.6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skjematisk illustrasjon av en forbedret og ultrahøy CDR-vestlige flekk sammenlignet med en tradisjonell statisk metode.
Dette tallet er endret fra Higashi et al.6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Western blot er en mye brukt analytisk teknikk for å oppdage spesifikke proteiner som ble utviklet ~ 40 år siden7,8. Siden da har teknikken fortsatt å utvikle seg, med påfølgende innovasjoner som forbedrer følsomheten, hastigheten og kvantitetenav teknikken 2,9,10,11,12,13. Den forbedrede ultra-høyhastighets vestlige blotting protokollen som presenteres her gjør flere betydelige forbedringer i den eksisterende teknikken. Vi reduserer inkubasjonstiden uten å ofre følsomhet ved å senke registreringsterskelen med IRE. Ingen spesiell eller kostbart utstyr er nødvendig: rotere et rør i en hybridisering ovn er tilstrekkelig til å overvinne MTL. Den viktigste innovasjonen er at CDR effektivt eliminerer uttømmingslaget i analysen. Selv om et roller-kulturapparat ofte brukes for å redusere volumet av løsningen, har potensialet i denne metoden for å overvinne MTL og redusere inkubasjonstider ikke blitt illustrert. På grunn av den drastiske reduksjonen av den totale tiden for hele prosedyren (Figur 4), kan mye høyere mengder vestlige blotdata per dag oppnås når de blokkerte membranene er i ens hånd, noe som er nesten umulig å gjøre det med en tradisjonell vestlig blotting protokoll. Det bør bemerkes at inkubasjon av membranen på en gyngeplattform shaker tilsvarer statisk inkubasjon4,6. Skylling av PVDF membraner i en husholdning kommersiell salat spinner med et stort volum av vaskeløsning reduserer også varigheten av prosedyren (Figur 4).
Vellykket bruk av denne protokollen er avhengig av optimalisering av antistofffortynning med IRE-løsning og inkubasjonstid. Et bredt spekter av antistofftitrering anbefales i begynnelsen av analysene siden CDR i forbindelse med IRE øker følsomheten betydelig (figur 2). Inkubasjonstid er en annen faktor som skal vurderes. Når man har gode vestlige blot resultater med 1 t inkubasjon med primære antistoffer under statiske forhold, kan inkubasjonstiden reduseres til 5-10 min under CDR-forhold generelt. Når inkubasjon over natten er nødvendig med primære antistoffer for eksempel, bør en litt lengre CDR inkubasjonstid (30 min - 6 h) evalueres. Fortynning og inkubasjonstid med sekundære antistoffer er også kritiske. Inkubasjoner større enn 30 min under CDR forhold gir vanligvis høyere bakgrunn. Dermed er forsiktig titrering av sekundære antistoffer nødvendig med opptil 30 min CDR inkubasjon. Når bakgrunnssignalet er høyt etter forsiktig titrering av antistoffer, bør omfattende vasketrinn (10 min skyll 3 ganger for primærantistoffet og 5 min skyll 6 ganger for det sekundære antistoffet i en beholder med 80-100 ml vaskeløsning) utføres.
Kvaliteten på de vestlige flekkdataene avhenger ofte av antistoffene som brukes. Når vi hadde et vanskelig antistoff som ble brukt til vestlig flekk, viste proteinmarkører noen ganger betydelige signaler selv etter forsiktig antistofftitrering og omfattende vasking. Siden vi la merke til at CDR-metoden med IRE har en tendens til å øke den ikke-spesifikke bindingen, kan tillegg av blokkering av reagenser (som skummet melk og andre) i antistoffdiluenter forbedre signal-til-støy-forholdet14. Det er et tidkrevende screeningtrinn, men det er verdt å prøve.
Den vestlige flekken har blitt viktig for kvantitative anvendelser2. En semi-kvantisering kan utføres med chemiluminescent deteksjon. Prosedyren som presenteres her gjelder for stripping og re-sondering til dette formål6. På grunn av et bredere dynamisk område er fluorescerende deteksjon det beste alternativet. Med denne protokollen gir fluorescerende deteksjon et lineært dynamisk område for kvantitativ analyse6. Det er verdt å nevne at CDR inkubasjonstid med fluorescerende deteksjon virker lengre enn det med chemiluminescent deteksjon.
Den vestlige flekken har et bredt spekter av applikasjoner og er fortsatt en universell metode for å studere proteinoverflod, protein-proteininteraksjoner og post-translasjonelle modifikasjoner. For eksempel kan anti-karbohydrat antistoffer enkelt brukes til vestlig flekk med denne protokollen14. Siden en rekke karbohydratgaeties uttrykt på den ytre overflaten av virale, bakterielle og fugus er patogenespesifikke, er de uvurderlige mål for patogengjenkjenning og diagnose av smittsomme sykdommer. Dermed kan anvendelsen av denne enkle protokollen påvirke mange etterforskningsområder, barberingstimer med ventetid ikke bare for eksperimenter, men også klinisk immunodiagnostics som er avhengige av vestlig blottingteknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklært ingen konkurrerende interesser direkte relevant for innholdet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Division of Intramural Research, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. ble støttet av Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, og H.N. og K.Y. var av Valor og V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
