Summary
Una tecnica di soffiatura occidentale ad altissima velocità viene sviluppata migliorando la cinetica del legame antigene-anticorpo attraverso la tecnologia di drenaggio e rifornimento ciclico (CDR) in combinazione con un agente che migliora l'immunoreazione.
Abstract
Una macchia occidentale (nota anche come immunoblot) è un metodo canonico per la ricerca biomedica. È comunemente usato per determinare la dimensione relativa e l'abbondanza di proteine specifiche e le modifiche delle proteine post-traslazionali. Questa tecnica ha una ricca storia e rimane ampiamente utilizzata per la sua semplicità. Tuttavia, la procedura di gonfiore occidentale richiede notoriamente ore, anche giorni, per essere completata, con un collo di bottiglia critico che sono i lunghi tempi di incubazione che ne limitano la produttività. Questi passaggi di incubazione sono necessari a causa della lenta diffusione degli anticorpi dalla soluzione sfusa agli antigeni immobilizzati sulla membrana: la concentrazione di anticorpi vicino alla membrana è molto inferiore alla concentrazione di massa. Qui presentiamo un'innovazione che riduce drasticamente questi intervalli di incubazione migliorando il legame dell'antigene attraverso il drenaggio ciclico e il rifornimento (CDR) della soluzione anticorpale. Abbiamo anche utilizzato una tecnologia di miglioramento dell'immunoreazione per preservare la sensibilità del saggio. Una combinazione del metodo CDR con un agente di miglioramento dell'immunoreazione commerciale ha aumentato il segnale di uscita e ridotto sostanzialmente il tempo di incubazione degli anticorpi. La macchia occidentale ad altissima velocità risultante può essere eseguita in 20 minuti senza alcuna perdita di sensibilità. Questo metodo può essere applicato alle macchie occidentali utilizzando sia il rilevamento chemiluminescente che fluorescente. Questo semplice protocollo consente ai ricercatori di esplorare meglio l'analisi dell'espressione proteica in molti campioni.
Introduction
Una macchia occidentale (nota anche come immunoblot) è una tecnica potente e fondamentale in un'ampia gamma di discipline scientifiche e cliniche. Questa tecnica è usata per esaminare la presenza, l'abbondanza relativa, la massa molecolare relativa e le modifiche post-tras traslizionali delle proteine1. Combinato con l'analisi digitale delle immagini, questo metodo può analizzare in modo affidabile l'abbondanza di proteine e modificheproteiche 2. Sebbene la macchia occidentale sia eseguita regolarmente, è un metodo dispendioso in termini di tempo e manodopera. Sono necessarie lunghe incubazioni dell'anticorpo con membrane. Qui descriviamo una modifica del metodo di incubazione che supera questa limitazione senza sacrificare la sensibilità.
Durante l'incubazione della membrana, gli anticorpi galleggiano in soluzione mentre gli antigeni vengono immobilizzati sulla membrana. A causa della loro elevata affinità, il tasso di legame degli anticorpi all'antigene è più veloce della diffusione degli anticorpi dalla soluzione sfusa alla membrana. In questo modo si crea un "livello di esaurimento" a bassa concentrazione (Figura 1). Potrebbero essere necessario ore prima che anticorpi più distanti raggiungano la membrana attraverso la diffusione passiva, che è il principale fattore responsabile dei lunghi tempi di incubazione in questa tecnica. Questo effetto è chiamato limitazione del trasporto di massa (MTL)3. È stato proposto che il drenaggio ripetitivo e il rifornimento della soluzione contenente anticorpi possano interrompere lo strato di esaurimento e superare l'MTL4. Qui, abbiamo ideato una tecnica unica che implementa questo concetto ciclico di drenaggio e rifornimento (CDR) per diminuire l'effetto dell'MTL in un tradizionale protocollo di soffiatura occidentale e ridurre notevolmente il periodo di incubazione richiesto.
Al fine di mantenere la sensibilità di rilevamento con un breve tempo di incubazione, abbiamo fatto uso di una tecnologia di miglioramento dell'immunoreazione che accelera la reazione antigene-anticorpo, migliorando così il rapporto segnale-rumore5. Molti agenti di miglioramento dell'immunoreazione disponibili in commercio (IRE) sono costituiti da 2 componenti (soluzione 1 e 2, vedi Tabella dei materiali). La composizione proprietaria o il meccanismo d'azione dell'IRE non è stato divulgato, ma abbiamo precedentemente scoperto che IRE ha diminuito la costante di dissociazione tra l'antigene e l'anticorpo nei test di legame in fase solida, indicando che una maggiore affinità è, almeno in parte, responsabile dell'effetto di miglioramento dell'IRE6. La combinazione di CDR e IRE produce un protocollo western blotting ad altissima velocità che riduce l'intero tempo di procedura senza sacrificare la sensibilità.
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Protocol
1. SDS-PAGE e trasferimento a una membrana PVDF
- Eseguire SDS-PAGE per separare le proteine in base alle dimensioni relative.
NOTA: Qualsiasi sistema di gel commerciale o fatto in casa va bene. Si prega di seguire il protocollo del produttore. - Trasferire proteine separate da un gel su una membrana PVDF.
NOTA: Sono adatti metodi di trasferimento comuni (trasferimento semi-secco o umido). Si prega di seguire il protocollo del produttore.
2. Blocco delle membrane PVDF
- Incubare le membrane in apposita tampone di blocco per 1 h con agitazione a temperatura ambiente.
NOTA: A seconda dell'anticorpo primario e del sistema di rilevamento, deve essere selezionato un buffer di blocco appropriato. Ad esempio, i bloccanti più tipici sono BSA, latte secco non grasso, caseina e polimeri sintetici commerciali. PBS e/o TBS con 0,1% Tween20 sono i buffer più comunemente utilizzati. Questo passaggio di blocco può essere fatto durante la notte a 4 °C.
3. Incubazione con anticorpo primario
- Preparare una soluzione agente-1 per il miglioramento dell'immunoreazione al 10% (IRE-1) con acqua distillata. Vortice bene.
- Preparare l'anticorpo primario diluito con il 10% di IRE-1. Mescolare delicatamente e accuratamente.
- Se si utilizza una membrana più grande (4 cm x 8 cm - 8 cm x 8 cm), aggiungere 8 ml della soluzione anticorpale in tubi di centrifuga conica da 50 ml. Se si utilizza una membrana più piccola (2 cm x 8 cm - 4 cm x 8 cm), aggiungere 3 ml della soluzione anticorpale in un tubo di polipropilene a fondo rotondo da 14 ml(tabella dei materiali).
- Raccogliere la membrana PVDF con una pinzetta e drenare brevemente la soluzione di blocco. Inserire la membrana PVDF in questo tubo con le dita guantate e assicurarsi che l'intera membrana aderisca alla parete del tubo. Quando la membrana PVDF viene inserita in un tubo, affrontare il "lato proteico" della membrana che era originariamente a contatto con il gel verso l'interno. Chiudere saldamente il cappuccio.
- Inserire il tubo da 50 ml in una bottiglia di vetro per il forno di ibridazione.
NOTA: Quando per questa incubazione vengono utilizzati tubi da 14 ml, inserire un tubo da 14 ml nel tubo da 50 mL, utilizzando un paio di supporti ad anello di plastica per mantenere la camera d'aria al centro del tubo da 50 ml. - Accendere il forno di ibridazione.
- Incubare la membrana con rotazione di 6 giri/min per almeno 5 minuti.
NOTA: Assicurarsi che la membrana aderisca alla parete in ogni momento e che il tubo (interno) sia orizzontale per coprire la membrana con la soluzione anticorpale in modo uniforme. Calibrare la diluizione dell'anticorpo e il tempo di incubazione prima dell'esperimento effettivo.
4. Lavaggio a membrana
- Interrompere la rotazione.
- Rimuovere con cura la membrana PVDF dal tubo con una pinzetta e posizionare la membrana in un contenitore con 50 ml di PBS-T.
- Risciacquare brevemente la membrana con PBS-T.
- Risciacquare la membrana nel contenitore con acqua distillata fino a quando non compaiono bolle. Questo per rimuovere la maggior parte dell'anticorpo.
- Trasferire la membrana PVDF dal contenitore allo spinner per insalate che contiene 250 mL di PBS-T.
- Posizionare il cestello del filtro nello spinner. Assicurarsi che il coperchio sia stato messo su in modo sicuro.
- Attivare lo spinner ed eseguito per circa 20-30 s.
- Scartare la soluzione e sciacquare brevemente l'interno dello spinner con acqua distillata.
- Aggiungere nuovamente 250 mL di PBS-T nello spinner.
- Ripetere i passaggi 4.6 e 4.7.
5. Incubazione con l'anticorpo secondario
- Preparare una soluzione agente-2 che migliora l'immunoreazione al 10% (IRE-2) con acqua distillata. Vortice bene.
- Preparare l'anticorpo secondario diluito con il 10% di IRE-2. Mescolare delicatamente e accuratamente.
- Selezionare il volume della soluzione anticorpale e del tubo come indicato al passaggio 3.3.
- Raccogliere la membrana PVDF con una pinzetta e scolare brevemente la soluzione. Inserire la membrana PVDF nel tubo come indicato al passaggio 3.4.
- Inserire il tubo da 50 ml in una bottiglia di vetro per il forno di ibridazione.
- Accendere il forno di ibridazione.
- Incubare la membrana con rotazione di 6 giri/min per almeno 5 minuti. Assicurarsi che la membrana aderisca alla parete in ogni momento e che il tubo (interno) sia orizzontale per coprire uniformemente la membrana con la soluzione anticorpale.
NOTA: Calibrare il tempo di incubazione prima dell'esperimento effettivo. Quando l'anticorpo secondario è coniugato fluorescentmente, eseguire l'incubazione al buio.
6. Lavaggio a membrana
- Seguire i passaggi da 4.1 a 4.10.
7. Acquisizione di immagini
- Rilevamento chemiluminescente
- Posizionare un pezzo di pellicola flessibile semi-trapianto (10 cm x 15 cm) su una superficie piana.
- Mescolare 2 componenti del substrato chemiluminescente in un tubo da 5 ml.
- Trasferire immediatamente 1,5 mL del substrato misto nella pellicola flessibile semi-trapianto e posizionarla su di essa. Quindi, trasferire il resto della soluzione di substrato sulla membrana.
- Incubare la membrana PVDF con il substrato misto su un film flessibile semitrasparente per 1 minuto.
- Raccogliere la membrana PVDF con una pinzetta e drenare brevemente la soluzione del substrato.
- Incastro la membrana tra un paio di pellicole di trasparenza.
- Acquisire l'immagine in modalità chemiluminescente.
- Rilevamento fluorescente
- Raccogliere la membrana PVDF con una pinzetta e scolare brevemente la soluzione.
- Incastro la membrana tra un paio di pellicole di trasparenza.
- Acquisire l'immagine in modalità fluorescente.
NOTA: I passaggi 7.1 e 7.2 devono essere eseguiti in prossimità della macchina per immagini per garantire la massima sensibilità. - Quando il segnale di fondo è alto, eseguire una fase di lavaggio in un contenitore con 80-100 mL di PBS-T: risciacquo di 10 minuti 3 volte per l'anticorpo primario e risciacquo di 5 minuti 6 volte per l'anticorpo secondario.
NOTA: Sia gli anticorpi primari che secondari diluiti con soluzioni IRE al 10% possono essere utilizzati fino a 8-10 volte senza perdita di sensibilità6. La soluzione deve essere mantenuta a 4 °C per un massimo di 1 mese.
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Representative Results
Questo esempio illustra l'efficacia del metodo CDR insieme alla tecnologia di immunoenhancing sulla macchia occidentale. L'incubazione statica è stata eseguita su un film flessibile semitrasparente in cui le membrane PVDF sono state incubate con la soluzione anticorpale, mentre l'incubazione CDR era in un forno di ibridazione da tubi rotanti che contenevano le membrane e la soluzione anticorpale (Movie). La figura 2 ha mostrato quantità di antigene e anticorpo, rispettivamente, necessarie per il rilevamento chemiluminescente su macchie occidentali. Sia nelle incubazioni statiche che in quella CDR, l'uso della soluzione IRE ha aumentato la sensibilità: L'IRE ha ridotto la quantità più bassa di lisati cellulari (antigene) necessaria per rilevare la ß-actina da 2,2 μg a 1,1 μg in condizioni statiche e ulteriormente ridotta da 1,1 μg a 0,275 μg utilizzando CDR (Figura 2A). Analogamente, la concentrazione minima di anticorpo anti-6x His tag è stata abbassata da 100 ng/mL a 50 ng/mL in condizioni statiche e da 100 ng/mL a 12,5 ng/mL in condizioni CDR(figura 2B). L'incubazione CDR per 5 minuti o 10 minuti ha drasticamente abbassato il limite di rilevamento rispetto all'incubazione statica (60 minuti con anticorpi primari e 30 minuti con anticorpi secondari). Infine, la combinazione di CDR con IRE ha rivelato una sensibilità superiore sulla macchia occidentale (0,275 μg di lisati cellulari per il rilevamento della ß-actina e 12,5 ng/mL di anticorpo anti-6x La sua etichetta) anche in questo brevissimo periodo di incubazione.
Nel secondo esempio viene illustrata la corretta applicazione di questo metodo a una macchia occidentale con rilevamento fluorescente (Figura 3). Il rilevamento fluorescente, a differenza del rilevamento chemiluminescente, ha la capacità unica di rilevare più bersagli sulla stessa macchia contemporaneamente senza privare / sondare gli anticorpi. (La sua) 6 AP taggati e ß-actina nei lisati cellulari sono stati rilevati contemporaneamente utilizzando un fluorofore a due colori. L'incubazione cdr con IRE non solo ha accelerato il rilevamento, ma ha anche aumentato la sensibilità, con conseguente smascheramento della degradazione di (His)6 AP taggato (Figura 3A).
Figura 1: Illustrazione schematica del metodo di drenaggio ciclico (CDR).
(A) Uno strato di esaurimento vicino alla membrana si forma rapidamente in condizioni statiche quando una sonda ha un'alta affinità per l'antigene ma una capacità limitata di diffondersi attraverso la soluzione. Pertanto, il viaggio della sonda verso la membrana diventa un passo limitante della velocità e lunghi tempi di incubazione compensano la limitazione del trasferimento di massa. (B) Metodo CDR ruotando il tubo mentre la membrana aderisce alla parete elimina lo strato di esaurimento e reintegra la stessa soluzione di sonda per mantenere costante la concentrazione della sonda vicino alla membrana. Questa cifra è stata modificata da Higashi etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: (A) Diverse quantità di 293 lisati cellulari (diluizioni seriali 1:2 da 8,8 μg/corsia) sono state separate da SDS-PAGE, seguite dal trasferimento a una membrana PVDF e dal blocco con latte scremato al 5% in PBS-T. La macchia è stata sondata con anticorpo anti-ß-actina del topo (diluizione 1:3.000). (B) Dopo la separazione dei mezzi condizionati derivati da 293 cellule trasfette con pAPTAG5 (GenHunter) contenente la fosfatasi alcalina secreta (His)6 taggata (AP, 8 x 10-14 mol/corsia), le proteine sono state trasferite alle membrane PVDF. Ogni membrana è stata sottoposta a macchia occidentale con diverse concentrazioni di anticorpo anti-6x His tag (1:2 diluizioni seriali da 400 ng/mL). Le membrane sono state immagini come una singola immagine e le linee tratteggiate indicano il bordo delle singole membrane. Questa cifra è stata modificata da Higashi etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rilevamento simultaneo di più bersagli su una macchia occidentale mediante rilevamento fluorescente e CDR in combinazione con IRE.
Diverse quantità di lisati (diluizioni seriali 1:2 da 10 μg/corsia) da 293 cellule trasfette con pAPTAG5 sono state separate e trasferite su una membrana PVDF. Dopo aver bloccato con il buffer di blocco per il rilevamento fluorescente (BFD) per 1 h, la macchia è stata sondata con anticorpi anti-6X La sua etichetta e anti ß-actina, seguita da IRDye 800CW capra anti-coniglio IgG e IRDye 680RD capra anti-topo IgG. A: anticorpi diluiti con soluzione IRE al 10% in condizioni CDR, B: anticorpi diluiti con BFD contenente lo 0,1% di Tween20 in condizioni statiche. A causa della maggiore sensibilità con la combinazione CDR e IRE, è stata osservata la degradazione di (His)6 AP taggato. Questa cifra è stata modificata da Higashi etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Illustrazione schematica di una macchia occidentale CDR migliorata e ad altissima velocità rispetto a un metodo statico tradizionale.
Questa cifra è stata modificata da Higashi etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Western blot è una tecnica analitica ampiamente utilizzata per rilevare proteine specifiche che è stata sviluppata ~ 40 annifa 7,8. Da allora, la tecnica ha continuato ad evolversi, con successive innovazioni che migliorano la sensibilità, la velocità e la quantificazionedella tecnica 2,9,10,11,12,13. Il protocollo di soffiatura occidentale ad altissima velocità avanzato qui presentato apporta diversi miglioramenti sostanziali alla tecnica esistente. Riduciamo i tempi di incubazione senza sacrificare la sensibilità abbassando la soglia di rilevamento con IRE. Non sono necessarie attrezzature speciali o costose: la rotazione di un tubo in un forno di ibridazione è sufficiente per superare l'MTL. L'innovazione chiave è che la CDR elimina efficacemente il livello di esaurimento nel saggio. Sebbene un apparato di coltura a rulli sia comunemente utilizzato per ridurre il volume della soluzione, il potenziale di questo metodo per superare l'MTL e ridurre i tempi di incubazione non è stato illustrato. A causa della drastica riduzione del tempo complessivo per l'intera procedura (Figura 4), è possibile ottenere quantità molto più elevate di dati western blot al giorno quando le membrane bloccate sono in mano, il che è quasi impossibile farlo con un tradizionale protocollo western blotting. Va notato che l'incubazione della membrana su uno shaker a piattaforma a dondolo equivale all'incubazionestatica 4,6. Il risciacquo delle membrane PVDF in uno spinner commerciale per insalate domestico con un grande volume di soluzione di lavaggio riduce anche la durata della procedura (Figura 4).
L'uso riuscito di questo protocollo si basa sull'ottimizzazione della diluizione degli anticorpi con soluzione IRE e tempo di incubazione. All'inizio dei saggi si raccomanda un'ampia gamma di titolazioni anticorpali, poiché la CDR in combinazione con l'IRE aumenta sostanzialmente la sensibilità(figura 2). Il tempo di incubazione è un altro fattore da considerare. Quando si hanno buoni risultati western western con incubazione di 1 h con anticorpi primari in condizioni statiche, il tempo di incubazione potrebbe essere ridotto a 5-10 minuti in condizioni CDR in generale. Quando è necessaria l'incubazione notturna con anticorpi primari, ad esempio, deve essere valutato un tempo di incubazione CDR leggermente più lungo (30 min - 6 h). Anche il tempo di diluizione e incubazione con anticorpi secondari è fondamentale. Le incubazioni superiori a 30 minuti in condizioni CDR di solito danno uno sfondo più elevato. Pertanto, è necessaria un'attenta titolazione di anticorpi secondari con fino a 30 minuti di incubazione CDR. Quando il segnale di fondo è alto dopo un'attenta titolazione degli anticorpi, devono essere eseguite ampie fasi di lavaggio (risciacquo di 10 minuti 3 volte per l'anticorpo primario e risciacquo di 5 minuti 6 volte per l'anticorpo secondario in un contenitore con 80-100 mL di soluzione di lavaggio).
La qualità dei dati western blot spesso dipende dagli anticorpi utilizzati. Quando abbiamo avuto un anticorpo difficile utilizzato per la macchia occidentale, i marcatori proteici a volte mostravano segnali sostanziali anche dopo un'attenta titolazione degli anticorpi e un lavaggio esivo. Poiché abbiamo notato che il metodo CDR con IRE tende ad aumentare il legame non specifico, l'aggiunta di reagenti bloccanti (come latte scremato e altri) in diluenti anticorpali può migliorare il rapporto segnale-rumore14. È un passo di screening che richiede molto tempo, ma vale la pena provarlo.
La macchia occidentale è diventata importante per le applicazioni quantitative2. Una semiquantitazione può essere eseguita con il rilevamento chemiluminescente. La procedura qui presentata si applica allo stripping e al ri-sondaggio a tal fine6. Grazie a una gamma dinamica più ampia, il rilevamento fluorescente è l'opzione migliore. Con questo protocollo, il rilevamento fluorescente fornisce un intervallo dinamico lineare per l'analisiquantitativa 6. Vale la pena ricordare che il tempo di incubazione cdr con rilevamento fluorescente sembra più lungo di quello con il rilevamento chemiluminescente.
La macchia occidentale ha una vasta gamma di applicazioni e rimane un metodo universale per studiare l'abbondanza di proteine, le interazioni proteina-proteina e le modifiche post-traslittazionali. Ad esempio, gli anticorpi anti-carboidrati possono essere facilmente utilizzati per la macchia occidentale con questo protocollo14. Poiché una varietà di moieties di carboidrati espresse sulla superficie esterna di virali, batterici e fugus sono specifiche dell'agente patogeno, sono obiettivi inestimabili per il riconoscimento degli agenti patogeni e la diagnosi di malattie infettive. Pertanto, l'applicazione di questo semplice protocollo potrebbe avere un impatto su molte aree di indagine, radendo ore di tempo di attesa non solo per esperimenti ma anche immunodiagnostici clinici che si basano sulla tecnologia western blotting.
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Disclosures
Gli autori non hanno dichiarato interessi concorrenti direttamente pertinenti al contenuto di questo articolo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Divisione di Ricerca Intramurale, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. è stato supportato dal Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, e H.N. e K.Y. erano di Valor e V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
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