Summary
在这里，我们描述了在3D悬架培养中系统地培养表皮球体的协议。本协议具有广泛的应用，用于各种上皮组织类型和几个人类疾病和条件的建模。
Abstract
表皮调节障碍是各种人类疾病和疾病的节点，包括慢性伤害、炎症和超过 80% 的人类癌症。作为衬里组织，皮肤上皮经常受到损伤，并通过获得修复受损组织所需的细胞可塑性进行进化适应。多年来，我们已作出若干努力，利用体外和体外细胞模型研究上皮可塑性。然而，这些努力在回顾上皮细胞可塑性各个阶段的能力方面受到限制。我们在这里描述一个从原发性新生儿角膜细胞中生成3D表皮球体和表皮球体衍生细胞的协议。本协议概述了表皮球体培养物在功能上模拟角膜细胞生成可塑性不同阶段的能力，并表明表皮球体重新镀层可以丰富异质正常人类角膜细胞 （NHKc） 培养物，用于具有增强茎状特征的特异性基因细胞 6hi/EGFRlo 角细胞亚聚变。我们的报告描述了用于研究皮肤角膜可塑性和表皮再生的高吞吐量系统的开发和维护。
Introduction
哺乳动物分层上皮是所有生物系统中最复杂的上皮结构，经常受到损伤和伤害。作为一种保护性组织，分层上皮已经进化产生复杂而有效的组织损伤反应。受伤后，这些细胞必须激活血统可塑性程序，使它们能够迁移到受伤地点，并进行修复1，2，3。这种多方面反应发生在几个连续步骤中，这些步骤仍然鲜为人知。
研究上皮再生复杂过程的一个主要障碍在于缺乏高吞吐量模型系统，这些模型系统可以在细胞再生的指定阶段捕获动态细胞活动。虽然在体内小鼠模型提供了有关伤口愈合的见解，并最密切地概括了人类再生过程，但它们的发展需要付出艰苦的努力和巨大的成本，限制了它们的吞吐能力。因此，迫切需要建立系统，以便能够在高吞吐量尺度上对人类上皮组织再生进行功能性研究。
近年来，已作出若干努力，以应付可扩展性的挑战。这通过大量创新的体外和前体内细胞模型的扩展来观察，这些模型与体内再生环境紧密结合。这包括芯片上的器官4、球体5、器官6和有机培养7方面的进步。这些基于3D的基于细胞的系统各有优势，并具有独特的实验局限性。迄今为止，球形培养仍然是最具成本效益和广泛使用的3D细胞培养模型。虽然一些报告表明，球形培养物可用于研究皮肤干细胞特征，但这些研究主要用动物组织8、9或皮肤成纤维细胞10进行，几乎没有报告能彻底描述人类表皮球体培养物的再生特性。在此协议中，我们详细介绍了正常人类角膜细胞 （NHKc） 表皮球体培养物的功能发展、文化和维护。我们同样描述了该系统在体外模拟表皮再生和角膜细胞干细胞可塑性的顺序阶段的效用。
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Protocol
南卡罗来纳大学（UofSC）IRB审查了收集和处理皮肤标本和隔离人类角膜细胞的规程，并将其归类为"不涉及人类受试者的研究"，因为包皮标本是在常规外科手术（新生儿男孩的割礼）期间产生的手术丢弃物，完全缺乏识别信息。UofSC生物安全委员会还定期审查和批准该议定书，所有实验室人员都接受了实验室生物安全培训。所有程序均按照UofSC的安全和道德标准进行。
1. 新生儿前皮组织人类角膜细胞的分离与培养
- 将 0.1 M HEPES 缓冲器添加到 500 mL KSFM 介质，并将其调整为 7.2 的 pH 值，从而准备洗涤介质。在 500 mL 真空滤清器（0.22 μm 孔径大小）中消毒介质。MCDB 153-LB 基底介质也可用作替代 KSFM 的洗涤解决方案。
- 在层压流罩中，用 5 mL 的洗涤介质在 50 mL 圆锥管中清洗新生儿前皮。重复两次。
- 转移洗前皮到无菌的佩特里菜。使用手术刀和钳子，刮掉皮肤层的脂肪和松散的结缔组织。在 50 mL 圆锥形管中用 5 mL 的洗涤介质重新洗涤前皮。
- 将包皮表皮侧放在一个6井板中，其中含有在洗涤介质中稀释的2mL脱脂酶（50 U/mL）。
- 将板转移到孵化器 4 小时（37 °C，5%CO 2，95% 湿度）。
- 从孵化器中取出前皮，在无菌条件下将其转移到培养皿中。使用细尖钳子，将表皮与真皮层分离。
- 将表皮放入 15 mL 圆锥管中，其中包含 2 mL 的 0.25% 的 Trypsin-EDTA。使用 5 mL 血清管，机械地粉碎漂浮的表皮。在 37 °C 下孵育 15 分钟，周期性涡流为每 5 分钟 5 秒。
- 孵化后，加入2mL大豆试丁普辛抑制剂，通过管道混合，以中和试丁石。
- 离心电池悬架2分钟在450×g，然后8分钟在250×g。
- 用钳子清除漂浮的碎屑，小心不要将细胞颗粒移开。小心地从细胞颗粒中吸出超高纳坦。
- 在 12 mL 的完整 KSFM- scm 介质和 10 厘米盘中的板中重新使用颗粒。孵化盘过夜（37 °C，5% CO2，95% 湿度）。
- 第二天，使用吸气移液器取出介质，代之以12mL完整的KSFM-scm。
- 为了保持正常人类角膜细胞（NHKc）培养物的最佳生长，通过细胞1：5的第10天，以防止细胞达到80%以上的汇合。
2. 在体外生成皮肤表皮球培养物
- 在 50 mL 玻璃瓶中加入 2.5 克阿加罗斯到 50 毫升 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）中，准备 5% 的葡萄糖混合物。液体循环下的高压灭菌瓶。允许冷却到室温。
- 要准备盘子，将装有阿加罗斯溶液的冷却玻璃瓶放入装满 200 毫升去离子水 （dH2O） 的 1 L 塑料烧杯中。在研究级微波炉中熔化藻糖混合物长达2分钟，通过轻轻地将瓶子侧向倾斜，每60秒混合一次。
警告：在微波炉中熔化铜会导致烧瓶容器变得非常热，导致压力积聚。每 30s 释放一次压力积累。佩戴适当的防护装备，防止受伤。 - 加入3 mL融化的5%阿加罗斯到12 mL KSFM-scm预温到42°C，最终浓度为1%的玫瑰（wt/vol）。
可选：预加热血清移液器和移液器提示，以防止软糖过早聚合。 - 使用多通道移液器（图 1A）将 1% 的 agar 中的 200 μL 快速移液器混合到 96 井圆底板的单独井中。将板材在 25 °C 的无菌环境中留置 4 小时，使阿加罗斯完全聚合。
注：实验可以在这里停止，第二天继续。聚合玫瑰板可在 37 °C 至 24 h 或 4 °C 下保持，使用准胶片包装密封时可保持高达 48 小时。使用前，在加湿的孵化器中加热板至 37 °C 至少 1 小时。 - 通过在 2 mL 的 PBS 中吸气介质和洗涤细胞来形成球形 NHKc。吸气PBS，在洗涤细胞中加入2mL的0.25%的特普辛-EDTA。在 37 °C 下孵育 5 分钟，或直到所有细胞完全分离。将2mL大豆特普辛抑制剂加入板中，将板中的细胞洗掉，制成15mL管。离心机在 250 x g 为 5 分钟。
- 在 1 mL 的 PBS 中重新使用弹丸。使用锥蓝色染色器和血细胞计或自动细胞计数器对细胞生存能力进行量化。
- Aliquot 2 x 104 NHKc 在 100 μL 的 KSFM-scm 和种子到以前准备的 96 井圆底板的个别井。孵化板过夜（37 °C，5% CO2，95% 湿度）。
- 使用倒置相对比显微镜，分析种子，以形成表皮球。
注：来自正常人类角膜细胞的人类表皮球在3D悬浮培养中可保持可行，最高可达96小时，但细胞存活率显著降低（图2）。
3. 表皮球体重新电镀检测
- 24-48小时后，3D表皮球形成，添加4ml预温KSFM-scm到6厘米的菜。使用宽孔 1 mL 移液器尖端将单个球体转移到板上，确保不会将其拆开。或者，使用无菌剃须刀刀片加宽 1 mL 移液器尖端以切割尖端。
- 在一夜之间孵育板（37 °C，5% CO2，95% 湿度）。
- 分析种子球体以附着在板的底部，并观察使用倒置相对比显微镜（图3）传播细胞。通过轻轻去除板内 2 mL 的介质，并缓慢地将 2 mL 新鲜 KSFM-scm 介质添加到板中，每 96 小时喂取一次电池。
- 通道球体衍生 （SD） NHKc 一旦它们达到 70-80% 的汇流，并继续选择的检测。经常监测SD-NHKc，以防止细胞在培养中达到完全汇合，因为这会导致过早分化和细胞生长停止（图3E-F）。
- 表皮球体重新镀质检测模型角膜细胞介导伤口修复，通过捕捉表皮再生可塑性的每个关键顺序阶段：a） 家常维持，b） 分化停止/逆转 c） 应力谱移动性，和 d） 组织恢复 （图 1B：表2）。这种测定也可用于产生细胞群的有机性木筏培养或模型HPV介导肿瘤，如我们以前的工作11，12证明。
4.3D荧光细胞跟踪
- 在 6 厘米的盘中，转染球体形成的 2D 单层 NHKc 培养物，带有 1 μg 的 pMSCV-IRES-EGFP 质粒载体，携带增强的绿色荧光蛋白 （eGFP） 基因。孵化板过夜（37 °C，5%CO 2，95%湿度）显微镜（图4A）。
注：在无血清无抗生素条件下完成转染非常重要。 - 在不去除转染混合物的情况下，在细胞中加入2mL预制KSFM-scm。孵化板过夜（37 °C，5% CO2，95% 湿度）。
- 用3兆升预制KSFM-scm从板状和饲料细胞中吸气所有蒸发所有传播介质。评估荧光显微镜的FITC通道下存在EGFP表达细胞。
- 通道和种子 2 x 104 EGFP 感染细胞到以前准备的 96 井圆底板的单独井中。孵化板过夜（37 °C，5% CO2，95% 湿度）。在荧光显微镜的FITC通道下可视化和监控EGFP负球体细胞运动（图4B-C）。
- 电镀后 24 小时，在 6 厘米的盘子中加入 3 mL 预制 KSFM- scm。使用宽孔 1 mL 移液器尖端将单个球体转移到板上，确保不会将其拆开。孵化板过夜（37 °C，5% CO2，95% 湿度）。
- 使用荧光显微镜观察和分析传播的 SD-NHKcEGFP。 通过轻轻去除板内的介质 2 mL 并缓慢地将 2 mL 新鲜 KSFM-scm 介质添加到板中，每 96 小时喂取细胞。
- 收获 SD-NHKCEGFP 用于 FACS 隔离或选择的测定。
5. FACS 对球体衍生（SD）亚种群的特征
- 通过通过在 2 mL 的 PBS 中吸气旧介质和洗涤单元，通过传道 SD-NHKc 和相应的自体 2D 单层培养物。取出PBS，在洗涤的细胞中加入2mL的0.25%的特普辛-EDTA。在 37 °C 下孵育 5 分钟，或直到所有细胞完全分离。
- 将2mL大豆特普辛抑制剂加入板中，将细胞转移到15mL管中。离心机在 250 x g 为 5 分钟。
- 在 1 mL 的 PBS 中重新使用颗粒。使用试穿蓝色和血细胞计的自动细胞计数器量化细胞生存能力。
- Aliquot 100 μL 包含 0.1-4 x 106 NHKc 电池到 1.5 mL 微中心管。将管子放在冰上，在黑暗的环境中，通过关闭层罩内的明亮灯光创建。
- 在管中加入 2 μL FITC 结合的抗集成蛋白 +6 和 2 μL PE 结合抗EGFR，实现 1：50 稀释。准备一个没有添加抗体的管子，作为未染色的控制。在黑暗中或在 4 °C 下在冰上孵育管子 30 分钟。使用珠子或皮肤SCC线可以作为正控，因为皮肤SCC细胞表达的集成蛋白+6和EGFR水平升高。
- 使用选择的流细胞仪使用适当的激光进行流细胞学分析。
- 使用负控和正控件来建立闸门。对集成体+6hi/EGFRlo 细胞的亚群进行排序;这些是表皮干细胞分数。Integrin+6hi/EGFRhi 细胞是增殖祖细胞分数。集成物β6lo/EGFRhi 细胞是承诺的祖细胞分数（图4D）。排序 FACS 管应包含至少 1 mL 的冰冷 KSFM- scm。
- 通过将每个分类管的内容转移到一个 15 mL 圆锥管中，其中包含 PBS 中分拣细胞体积的 10 倍，来测试分拣细胞子群的增殖能力。注：重要的是要删除所有细胞连接到边缘通过管道的墙壁的分拣FACS管（s）几次，因为角蛋白细胞经常可以粘附在那里。
- 离心机 15 mL 管在 250 x g 5 分钟。去除超高颗粒，在12mL的KSFM-scm中再悬浮颗粒。将再悬浮的细胞转移到6厘米的板中，并在一夜之间孵育（37°C，5%CO2，95%湿度）。
- 第二天，取出盘子中的介质，加入8ml预热KSFM-scm. 孵化在37°C，5%CO 2，95%湿度。每3天用12mL介质重新喂养细胞，直到70-80%的汇流（图4E）。
6. 基础干细胞标记物表皮球的免疫荧光和染色
- 将表皮球转移到涂有多赖氨酸的覆盖唇上。允许 SD-NHKc 传播至 75% 的汇流。
- 在 PBS （4 °C） 中清洗细胞两次，每次 5 分钟。
- 在室温下用 4% 的副甲醛 （PFA） 修复细胞 20 分钟。
- 在1%甘氨酸中用0.5%的特里顿X-100渗透细胞。在室温下使用 0.5% BSA 和 5% 山羊血清 30 分钟块。
- 在 4 °C 的隔夜阻断溶液中，用抗体对 P63 （1：200） 和细胞角蛋白 14 （1：200） 孵育样品。
- 用含有Tween 20（PBST）的PBS（4°C）洗三次，然后用FITC-和Alexa 568-结合二级抗体（1：1000稀释）孵化。
- 安装细胞前用4'，6-二二苯丙酸酯（DAPI）（1：5000稀释）的污渍核。
- 使用具有荧光能力的显微镜观察具有FITC和PE激光线（图4F）的细胞。
7. 表皮球文化的转录分析
- 设置低通道NHKc培养物的三重板，以分离RNA可以从单层、球形和球体衍生培养物中分离出来自同一自体细胞线的培养物。
- 池 3-5 相应的表皮球成 1.5 mL 微中心管。单独收获自体 SD-NHKc 和 2D 单层培养物。
- 将总RNA与所有三组隔离。
- 用总RNA的 1 μg 执行反向转录。
- 使用 cDNA 执行实时 PCR，使用 GAPDH 作为内部控制（表 1）。
- 通过阿加罗斯凝胶电泳（2% v/v）验证放大器产品尺寸。
注：使用全基因组微阵菌分析对表皮球培养物进行全转录分析，将总RNA与单个NHKc捐赠者的群文化以及同一捐赠者的相应SD-NHKc隔离开来，各进行六次复制。 - 使用生物分析仪评估RNA质量，以实现至少 9.0 到 9.1 的RNA 完整性数字 （RIN）。
- 通过放大和生物化总RNA样本进行微阵列实验。
- 使用含有 T7 RNA 聚合酶促进序列的 NNN 随机引物将每个样本总RNA的 100 ng 反向转录到 ds-cDNA 中。
- 将 T7 RNA 聚合酶添加到 cDNA 样本中以放大 RNA，然后将 RNA 复制到 ss-cDNA 中。使用 Rnase H 降低多余的 RNA。
- 碎片 sscDNA 分子和标签与生物素。
- 在 45 °C 下放大标记的样品 16 小时。
- 使用杂交烤箱和洗涤和染色套件混合样品。
- 清洗和染色混合阵列。
- 使用系统和计算机工作站扫描阵列。
- 完成阵列扫描后，将探针单元强度 （CEL） 文件导入表达控制台软件，并使用库文件和强健多芯片分析 （RMA） 算法在基因级别进行处理，以生成 CHP 文件。
- 在确认表达控制台内的数据质量后，将包含每个探头的 log2 表达信号的 CHP 文件导入转录组分析软件，使用单向主题间差异分析分析细胞类型特定转录响应。
8. 评估 SD-NHKc 殖民地形成效率
- 当细胞达到70-80%的汇流时，从板块中吸气介质。在 PBS （4 °C） 中清洗细胞三次，每次 5 分钟。
- 用 3 mL 的 100% 甲醇 （4 °C） 修复细胞 15 分钟。在 PBS 中洗三次，每次 5 分钟。
- 3 mL 10% Giemsa 中的污渍细胞，持续 30 分钟。在 PBS 中洗三次，每次 5 分钟。让细胞在一夜之间晾干。
- 第二天分析殖民地的形成，并量化获得的殖民地数量
9. 确定 SD-NHKc 人口翻倍
- 通过在 2mL PBS 中吸气旧介质和洗涤单元，通过传道 SD-NHKc 和相应的自体 2D 单层培养物。取出 PBS 并将 2 mL 0.25% 的 Trypsin-EDTA 添加到洗涤的细胞中。孵育5分钟或直到所有细胞完全分离（37°C，5%CO 2，95%湿度）。
- 将2mL大豆特普辛抑制剂加入板中，将细胞转移到15mL管中。
- 离心机在 250 x g 为 5 分钟。
- 取出超高颗粒，在 12 mL 的 KSFM-scm 中重新使用颗粒。
- 低密度 1-2 x 104 NHKc 的种子细胞进入单独的 10 厘米菜肴，并在一夜之间孵育（37 °C，5% CO2，95% 湿度）。
- 第二天用 8 mL KSMF - scm 喂盘。每4天喂一次，直到至少25%的汇流，然后每2天喂一次。
- 连续通过细胞1：5在60厘米的盘子，直到细胞增殖能力耗尽。通过尝试蓝色染色来量化细胞的生存能力。使用公式确定每个段落的人口翻倍：日志（N/N0）/日志2，其中N表示每个通道获得的细胞总数，N0 表示实验开始时镀的细胞数。
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Representative Results
在皮肤表皮球测定过程中，NHKc培养物被播种在96井板的玫瑰涂层井中（图1A）。球形形成细胞应在48小时内自我聚集。使用标准倒置相对比显微镜，可尽早在 24 小时评估自体球体形成。皮肤表皮球的形成和重新电镀检测模型表皮组织再生的各个阶段（图1B）。图2显示了在3D培养中对表皮球体形成能力进行测定的各种NHKc菌株的高分辨率图像。检查细胞是否形成密集的球形聚合非常重要，因为这是自发球形形成的标志。我们发现有必要使用超过2×104细胞，以确保适当的自发聚集。非球形细胞聚集，如在菌株图2A中看到，不被认为是足够的表皮球形成。在 2D 单层培养物中电镀非球形形成细胞悬浮很少导致可行的 NHKc 细胞生长。然而，在二维培养中电镀表皮球会导致小尺寸的活性NHKc（图3）的扩散。表皮球和SD-NHKc的图像可以使用标准倒置相对比显微镜进行查看和监测。重要的是保持这些文化低于100%的汇流，因为这会大大阻碍他们的成长和干细胞状态的文化（图3E-F）。表皮球体形成过程可以通过荧光速器对细胞进行透气（图4A-C）在单细胞水平上进行功能跟踪。在最佳条件下，主要富含SD-NHKc培养物的角蛋白细胞亚种是Tetegrin+6hi/EGFRlo细胞。这些细胞通常占所有SD-NHKc培养物的25%左右，并且很容易被FACS隔离（图4D）。但是，必须建立前侧散射区 （FSC-A） 和侧散射区 （SSC-A） 闸门，以排除双面 （图 4D）。通过对表皮干细胞标记表达（如基底细胞角蛋白14（K14）和肿瘤蛋白63（P63）（图4F）的免疫荧光染色分析，可以进一步描述这种干细胞状角细胞亚群。表2）。
图1：3D悬架中NHKc表皮球的培养。 （A） 表皮球体重新电镀检测的原理图表示，改编自 11。（B） 在表皮球体重新电镀检测的每一个顺序步骤中，NHKc 培养物、表皮球体和 SD-NHKc 的代表相对比图像。缩放栏 = 100 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：评估皮肤表皮球生长。（A） 在浮动3D悬架中6个单个球体非成形和（B）球形形成NHKc菌株的图像。（C） 使用不同数量的 NHKc. （D） 利用浮动 3D 悬浮培养中不同数量的 NHKc 获得的平均表皮球大小的表皮球数定量获得的表皮球。条表示标准偏差。缩放栏 = 100 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：生长球体衍生文化。（A） SD-NHKc单层培养物在2D塑料培养物中重新镀电后传播的时间过程相对比成像 24h、（B） 48 h、（C） 72h 和 （D） 96 小时。（E） SD-NHKc 培养物分别在 80% 汇流和 （F） 100% 汇流 15 天和 20 天后重新镀在 2D 塑料培养物中。缩放栏 = 100 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：球体衍生（SD）亚种群的特征。（A） Woappi等人描述的体外表皮球的3D细胞跟踪测定示意图。（B） EGFP 表达表皮球 2 h 和 （C） 24 小时后播种在 3D 培养。（D） SD-NHKc 亚群的荧光激活细胞分拣 （FACS）。大约1/4的细胞应该是集成+6 hi/EGFRlo。（E） 英特格林+6hi/EGFRlo亚聚居产生角蛋白细胞。（F） Integrin+6hi/EGFRlo细胞中基底上皮干细胞标记表达的免疫荧光染色分析。缩放栏 = 50 μm.请单击此处查看此图的较大版本。
| 引数序列 （5'-3'） | ||
| 基因名称 | 前进引数 | 反向引数 |
| 阿尔德1 | 卡奇卡卡塔克塔克特克 | 克泰克特克塔格加塔格 |
| 埃格夫尔 | 阿格卡加加塔卡查克 | 阿加加卡塔卡奇 |
| 盖普德 | 加格加加特 · 切克卡特卡特 | 格特克特克特克特卡特克特卡特克 |
| K14 | 特加格克查特加格 | 加特加特加加 |
| KI-67 | 阿克克特克塔卡特卡格 | 卡加西卡特塔克特格特格特加 |
| KLF4 | 卡卡卡特加格加特克特克 | 卡格特卡加加特格特加 |
| TP63 | 加加加加加特加加克 | 阿加加格特加特加特格特格 |
| β-阿克廷 | 卡特格塔格特克塔克 | 克切塔特克特卡奇加特 |
| \N TP63 | 阿格特格塔克特加亚特加特克 | 卡格卡特加加塔克 |
表1。概述用于检测新生儿角膜细胞可塑性的选定基因的 PCR 引物序列。
| 文化条件 | 相位对比外观 | 免疫染色 | 法克斯分析 | 转录签名 | |
| 家居维护 | 2D 单层 | 小尺寸的细胞< 30 μm | K14， P63 | ITG+6美德/EGFP梅德 | 表皮维护 （K14， P63， IVL， K10） |
| 差异化停止/反转 | 3D 球形 | 紧凑型多细胞聚合> 50 μm | K14， P63， Ki-67 | 不适用 | 除差异化： NANOG， SOX2， OCT4， KLF4， K14， P63， Ki-67 |
| 应力血统移动性 | 3D 到 2D 球形附件 | 从球体边缘扩散小细胞（< 20μm） | K14， P63， Ki-67 | ITG+6hi/EGFP梅德 | 皮肤细胞增殖：K14、K16、K17、Ki-67 |
| 组织恢复 | 3D 到 2D 球体单层 | 将小细胞传播< 20 μm | K14， P63， IVL | ITG+6hi/EGFPlo 和 ITG+6hi/EGFPhi | 表皮的形成： K14， IVL， FLG |
表2。表皮球体重新镀化检测表型和分子特征的策略。
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Discussion
3D球形培养系统的使用在评估细胞干细胞方面具有广泛的效用。这些系统已被证明可以增强组织干细胞的富集性，然而它们对人类表皮干细胞研究的效用却被有限的探索。在这里，我们描述了一种利用3D培养技术丰富人类角膜细胞干细胞的策略。在这个系统中，NHKc 被培养为自组装多细胞球体悬浮物，由几个角膜细胞亚型组成，这些亚型悬浮在含有 KSFM-scm 的玫瑰床上。此协议的设置对时间很敏感，因为 agar 在室温下会快速聚合。预热血清移液器、微管尖、agar/细胞混合管以及介质至 42 °C 可显著减少过早聚合。我们观察到，在将 agar/介质混合加入油井后不久将 96 井板置于 4 °C 中，可以大大加快聚合速度，并确保 Agar 垫足够坚固，足以随后播种细胞。在聚合过程中，保持板）水平非常重要，因为酸性/介质混合的聚合性差将导致细胞在软性醋中播种或生长，使检测无效。
本协议还概述了在 2D 单层培养物中传播表皮球以生成类似干细胞的球体衍生细胞的策略。表皮球体重新电镀检测丰富了干细胞样的子群的集成蛋白+6hi/EGFRlo角蛋白细胞。这些细胞可用于研究表皮重建，牛皮病，或细胞肿瘤11，12，14。Integrin®6hi/EGFRlo角蛋白细胞也可以很容易地被FACS分离，其特征是免疫荧光染色。在进行此类实验时，我们发现使用未分类的自体 2D 单层细胞作为对照组很有帮助。
总之，本报告表明，人类表皮球体在 体外重新镀定角膜细胞再生可塑性模型，因为它捕获了再生的四个阶段：家居维持、分化逆转、应力谱移动和组织恢复。然而，基于 agar 的球体自我组装的一个限制是，并非所有的 NHKc 污渍都能够自发形成球体。悬空滴法15 是克服这一挑战和迫使诱导多细胞球体形成的一个很好的替代策略。这种测定也可以与肌肉、频闪或免疫细胞进行复用，以进一步深入了解各种细胞群对表皮再生的贡献。这将是有趣的探索，如果添加马特里格尔到阿加可以提高表皮圈的生存和效力。
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Disclosures
作者没有财务关系可以披露。
Acknowledgments
UofSC医学院仪器资源设施（IRF）提供了成像和细胞分拣设备以及技术援助。这项工作部分得到了赠款1R21CA201853的支持。MCF 和 IRF 从 NIH 赠款 P20GM103499（SC INBRE）获得部分支持。MCF 还获得 NIH 赠款 P20GM109091 的支持。Yvon Woappi 部分得到了 NIH 赠款 2R25GM06652626-06A1 （PREP） 和 R25GM076277 （IMSD） 的支持，以及 UofSC 格蕾丝·乔丹·麦克法登教授项目奖学金的支持。杰拉尔丁·埃泽卡和贾斯汀·韦尔塞利诺在UofSC获得NIH赠款2R25GM066526-10A1（PREP）的支持。肖恩·布洛斯在UofSC获得2016年麦哲伦学者奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
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