Summary
Het prikken van de basale kop van de zwarte peperplant is een korte en tijdbesparende methode om deze te beschadigen. Hier hebben we gedetailleerde stappen gegeven met een video voor het infecteren van zwarte peperplanten.
Abstract
Piper nigrum L. (zwarte peper) is een typische houtachtige wijnstok die een economisch belangrijk kruidengewas is over de hele wereld. De productie van zwarte peper wordt aanzienlijk beïnvloed door wortelrotziekte veroorzaakt door Phytophthora capsici, die de ontwikkeling van de industrie ernstig heeft beïnvloed als een "choke point" -probleem. Het moleculair genetische mechanisme van resistentie in zwarte peper is echter onduidelijk, wat leidt tot langzame vooruitgang in de ontwikkeling van nieuwe zwarte pepervariëteiten. Een effectieve inenting en nauwkeurig bemonsteringssysteem voor Phytophthora capsici op zwarte peperplanten is essentieel voor het bestuderen van deze plant-pathogeen interactie. Het belangrijkste doel van deze studie is om een gedetailleerde methodologie aan te tonen waarbij de basale kop van zwarte peper wordt ingeënt met Phytophthora capsici, terwijl het ook een referentie biedt voor de inenting van houtachtige wijnstokken. De basale kop van de zwarte peperplant werd geprikt om het te beschadigen, en myceliale pellets bedekten de drie gaten om het vocht vast te houden, zodat de ziekteverwekker de plant goed kon infecteren. Deze methode biedt een betere manier om de instabiliteit op te lossen die wordt veroorzaakt door traditionele inentingsmethoden, waaronder bodemdruppel of worteldimpeling. Het biedt ook een veelbelovend middel voor het bestuderen van het werkingsmechanisme tussen planten en andere bodemgedragen plantenpathogenen in de precisieveredeling van de landbouw.
Introduction
Zwarte peper (Piper nigrum L.) is een houtachtige klimmer en een van de belangrijkste kruidengewassen. Het staat bekend als de "King of Spices"1 en wordt geteeld in meer dan 40 landen en regio's in Azië, Afrika en Latijns-Amerika. Phytophthora wortelrot is de meest verwoestende ziekte van zwarte peper en wordt veroorzaakt door de oomycete Phytophthora capsici. Deze ziekteverwekker infecteert ook cucurbits, aubergines, chilipepers en tomaten 2,3. Met zwarte peper kan soms een heel gewas worden gedecimeerd door deze ziekte. De uitbreiding van paprikaplantgebieden is beperkt als gevolg van de onbeschikbaarheid van resistente variëteiten, wat de ontwikkeling van de Chinese zwarte peperindustrie aanzienlijk heeft belemmerd. Een effectieve inenting en een nauwkeurig bemonsteringssysteem voor Phytophthora capsici op zwarte peperplanten zijn essentieel voor het bestuderen van deze plant-pathogeen interactie.
De identificatie en screening van resistentie in kiemplasmabronnen is de basisvereiste voor onderzoek naar de pathogeniciteit van de ziekteverwekker en de veredeling en het gebruik van resistente variëteiten. Een veel gebruikte aanpak is het gebruik van een verscheidenheid aan identificatiemethoden op basis van plantensoorten en pathogene groepen. De huidige identificatiemethoden omvatten populatie-identificatie, individuele identificatie, orgaanidentificatie, weefselidentificatie, celidentificatie, biochemische identificatie en moleculaire identificatie, die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld 4,5. Op deze gebieden is succes geboekt, maar er zijn ook veel problemen. Het maakt niet uit welke methode wordt gekozen, de basisvereisten voor het identificeren van plantresistentie zijn consistent, inclusief duidelijke doelstellingen, betrouwbare resultaten en methoden die eenvoudig, snel en gemakkelijk te standaardiseren zijn. Dit principe moet ook worden gevolgd bij de identificatie van zwarte peperresistentie.
In natuurlijke veldomstandigheden kan de identificatie van ziekteresistentie worden beïnvloed door vele omgevingsfactoren. Daarom werd voorgesteld om losse bladeren en geïrrigeerde wortels in het laboratorium te gebruiken om ziekteresistentie te identificeren. Jonge bladeren van gezonde planten werden in vitro in het laboratorium ingeënt en het zieke bladerengebied werd gemeten door de ziekteverwekker in te enten om de ziekteresistentie van planten te identificeren6. In vitro bladinenting kan echter alleen worden gebruikt voor algemene resistentie-identificatie en niet voor moleculaire interactiestudies. Desondanks presenteert de ziekteresistente status zich vaak in de geïrrigeerde wortelinenting, waardoor onzekerheid ontstaat in de vervolgstudie van moleculaire veredeling voor ziekteresistentie. Daarom zijn snelle en eenvoudige detectiemethoden binnenshuis essentieel. Deze studie heeft tot doel een methode te bieden voor resistentie-identificatie in het laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van zwarte pepersnijplanten op infectie
- Neem een vijfknoopssnede, ongeveer 40 cm lang met een diameter van 0,5 cm, van een gezonde en krachtig groeiende orthotrope tak van zwarte peper met behulp van een gedesinfecteerd snoeimes of snoeischaar. Snoei de onderste drie knopen van de plagiotrope takken, waarbij de bovenste twee knopen met ongeveer 10 bladeren intact blijven.
- Bereid bewortelingssubstraat met grond en dierlijke mest (koeienmest of schapenmest) in een verhouding van 1:1. Autoclaaf het bewortelingssubstraat bij 121 °C gedurende 20 min.
- Steek de stekken in het bewortelingssubstraat onder een hoek van ongeveer 50°, waarbij de derde knoop net het oppervlak van het substraat en de okselknop op dit knooppunt boven het substraat raakt.
OPMERKING: De tas die hier wordt gebruikt, heeft de volgende afmetingen: hoogte van 40-60 cm, diameter van 25-30 cm. - Giet 10-20 L water over de wortels van de plant. Plaats de stekken in een kas met 90% schaduw bij een temperatuur van 25-30 °C voor beworteling en groei.
2. Vermeerdering van Phytophthora capsici (P. capsici)
OPMERKING: Een voorraad Phytophthora capsici-cultuur wordt bijgehouden in het gewasbeschermingslaboratorium van het Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academie voor Tropische Landbouwwetenschappen7.
- Borstel en reinig de aardappelknollen onder stromend leidingwater en snijd vervolgens 200 g aardappelen in blokjes van 1 cm3. Doe een deel van de blokjes in een bekerglas met 800 ml dubbel gedestilleerd water (ddH2O) en kook gedurende 20 minuten.
- Filter de bouillon door dubbel gaas met behulp van zwaartekrachtfiltratie. Bereid aardappeldextrose-agar (PDA) door 20 g dextrose en 15 g agar aan het filtraat toe te voegen en het volume tot 1 l te vullen met ddH2O. Autoclaaf het mengsel bij 121 °C gedurende 20 min8.
- Giet 20 ml van de gesteriliseerde PDA in vloeibare vorm in een ronde petrischaal met een diameter van 9 cm in een laminaire luchtstroomkap. Laat de PDA-platen met deksels 's nachts open in de laminaire luchtstroomkap als middel om condensatie te voorkomen.
- Gebruik een inentingslus om mycelia op te pikken van Phytophthora capsici-voorraad in een reageerbuis. Plaats het entmateriaal met de myceliale kant in contact met de PDA in een petrischaaltje.
3. Infectie van zwarte peper
- Incubatie
- Identificeer een gebied 5 cm boven het substraatoppervlak en in de buurt van de wortels op de stengel voor inenting.
- Snijd een schijf van mycelia met een diameter van 0,5 cm aan de groeirand van de Phytophthora capsici-cultuur op PDA uit in een petrischaal met behulp van een stopboorder.
- Beschadig de steel met een spuitnaald en maak drie gaten in een driehoekig patroon op het geselecteerde inentingsgebied. Bedek elk gat met een myceliale schijf. Plaats de gaten dicht bij elkaar om ervoor te zorgen dat het gewonde gebied volledig bedekt is met de myceliale schijven.
- Bedek de myceliale schijven met gesteriliseerde bevochtigde wattenschijfjes als middel om uitdroging te voorkomen. Bind de pad op de steel met een polyethyleen strip om de positie van de enterende schijven te behouden.
OPMERKING: Na 8 uur na inenting werden de geënte gaten zwart en de laesie breidde zich uit naarmate de tijd verstreek. De bladeren werden geel en vielen af en de geënte plant stierf 7-10 dagen na inenting. Er ontwikkelden zich geen laesies in de controleplanten. De meeste genen kwamen na inenting met Phytophthora capsici anders tot expressie in vergelijking met de controlegroep. Histopathologische analyse van de geïnfecteerde weefsels toonde aan dat Phytophthora capsici koloniseerde in het xyleem.
- Bemonster de interessante plantaardige materialen en bewaar bij -80 °C in vloeibare stikstof voor gebruik in volgende onderzoeken.
OPMERKING: Vloeibare stikstof, plastic zakken, markeerstiften, takkenschaar en andere materialen werden voorafgaand aan de experimenten voorbereid. - Nadat de specifieke plantaardige materialen zijn bemonsterd voor gebruik, autoclaaft u alle resterende plantaardige materialen, overgebleven Phytophthora capsici-cultuur en kweekmedium en alle instrumenten en laboratoriumartikelen die bij dit inentingswerk zijn gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de symptomen van zwarte peperbladeren na P. capsici-inenting . Figuur 2 toont de symptomen van zwarte peperstengels na P. capsici inenting. De ziekteverwekker infecteerde de zwarte peper aan de basale stengel; symptomen zoals bladverkleuring, verwelking, xyleembruining en vaatverduistering die geleidelijk verschijnen. Figuur 3 toont de meeste genen die na inenting met Phytophthora capsici anders tot expressie komen in vergelijking met de controlegroep. Figuur 4 heeft aangetoond dat Phytophthora capsici in het xyleem is gekoloniseerd door de histopathologische analyse van geïnfecteerde weefsels.
Figuur 1: De symptomen van zwarte peperbladeren na P. capsici inenting7. CK: controlegroep; Ingeënt: na inenting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het symptoom van zwarte peperstengels na P. capsici inenting7. Ingeënt: na inenting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gedetailleerde expressieprofielen van de genen in de zwarte peperwortels. Foutbalken in de cijfers geven de standaardfout van expressieniveaus van drie biologische replicaties aan. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 en 48 op de x-as verwijzen naar respectievelijk 8, 12, 24 en 48 uur op de controle en 8, 12, 24 en 48 uur, na inenting met P. capsici. De y-as vertegenwoordigt het relatieve expressieniveau in vergelijking met ubiquitine. Elke kolom vertegenwoordigt de gemiddelde waarde plus SD (standaarddeviatie) van drie biologische replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histopathologische analyse van geïnfecteerde weefsels. De vergelijking tussen toluidineblauwe O-kleuring alleen (linkerkolom) en katoenblauw en safranine O dubbele kleuring (rechterkolom) (20X). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werd de basale kop geprikt om schade aan te richten en een effectief inentingssysteem in de zwarte peperplant te bieden. Myceliale pellets bedekten vervolgens de drie gaten om vocht vast te houden en de ziekteverwekker in staat te stellen de plant goed te infecteren. Na inenting werden de bladeren geel en vielen af en stierven de geënte planten. Er ontwikkelden zich geen laesies in de controleplanten. De meeste genen kwamen na inenting met Phytophthora capsici anders tot expressie in vergelijking met de controlegroep. Schimmelziekten zijn verantwoordelijk voor structurele en fysiologische aandoeningen in een aanzienlijk aantal gewassen, wat leidt tot verminderde productiviteit en economische verliezen voor hun producenten. Structurele studies met behulp van histologische technieken over de wijze van penetratie en kolonisatie van plantenweefsels door schimmels geven een gedetailleerde indicatie van de interacties tussen de ziekteverwekker en het plantenweefsel. Deze studies hebben belangrijke aspecten onthuld om de eenwieler van ziekten te helpen begrijpen. Histopathologische analyse van geïnfecteerde weefsels toonde Phytophthora capsici gekoloniseerd in het xyleem. Deze methode biedt een beter middel om de instabiliteit op te lossen die wordt veroorzaakt door traditionele inentingsmethoden, waaronder bodemdruppel of worteldimpeling. Een effectieve inenting en nauwkeurig bemonsteringssysteem voor Phytophthora capsici op zwarte peperplanten zijn essentieel voor het bestuderen van deze plant-pathogeen interactie. Het biedt ook een veelbelovend middel voor het bestuderen van het werkingsmechanisme tussen planten en andere bodemgedragen plantenpathogenen in de precisieveredeling van de landbouw.
Tegelijkertijd vertegenwoordigt dit protocol een efficiëntere manier om referentie te bieden voor de incubatie van houtachtige wijnstokken. In eerdere studies werden pathogenen ingeënt door worteldipping met sporensuspensies gekweekt in V8 medium9. Het duurt 7 dagen voordat de sporensuspensie klaar is, terwijl het gebruik van PDA om Phytophthora capsici te kweken slechts 5 dagen duurt. De PDA-plaat werd verzegeld met behulp van doorlatende chirurgische tape als een middel om besmetting door andere bacteriën en schimmels te voorkomen. De culturen werden op kamertemperatuur gehouden. De methode die in dit onderzoek wordt gebruikt, kan meer tijd besparen en sneller worden uitgevoerd. Zwarte peper is een houtachtige wijnstok met veel suikers en fenolen10, en de zoösporen geproduceerd door Phytophthora capsici komen over het algemeen voor in de bodem, waardoor het moeilijk is om zwarte peperranken te infecteren en infectie-instabiliteit in de wortelte veroorzaken 11. Dit protocol biedt betere resultaten, waardoor een sterke interactie tussen wijnstokplanten en bodempathogenen mogelijk is. De detectie van het dynamische proces tussen planten en ziekteverwekkers is zichtbaar en handig.
De irrigerende wortelmethode is snel en tijdbesparend, maar een probleem blijft onopgelost voor zwarte peper. Phytophthora capsici is een bodempathogeen dat over het algemeen plantenwortels infecteert via sporangia en zoösporen12. In de natuur kan de sporangia zich verspreiden via regen en irrigatie. Zodra de zoösporen aan het plantenoppervlak vastzitten, kunnen de kiembuizen zich snel ontwikkelen en het plantenweefsel binnendringen, wat resulteert in infectie13,14. Dit kan onzekerheid veroorzaken dat het kiezen van schimmeldraden als infectiebron vergelijkbaar zal zijn met de sporensuspensie. De methode die in deze studie wordt gebruikt, begint met het prikken van de basale kop van de zwarte peperplant om deze te beschadigen. Het beschadigde gebied wordt dan bedekt met Phytophthora capsici en vocht wordt vastgehouden, waardoor de ziekteverwekker de plant goed kan infecteren. Deze methode is beter in het oplossen van de instabiliteit veroorzaakt door traditionele inentingsmethoden, waaronder bodemdruppel of worteldimpeling. Het is ook een veelbelovende methode voor het bestuderen van het werkingsmechanisme tussen planten en andere bodemgedragen plantenpathogenen in de landbouwprecisieveredeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door het National Key R&D Program of China (2020YFD1001200), het China Agriculture Research System (CARS-11), het specifieke onderzoeksfonds van The Innovation Platform for Academicians of Hainan Province (YSPTZX202154), de Natural Science Foundation van de provincie Hainan in China (321RC652) en de Natural Science Foundation of China (nr. 31601626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
- Gordo, S. M., et al. High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome. BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).
- Leonian, L. H. Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov. Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).
- Ding, X., et al. Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease. Frontiers in Plant Science. 6, 830 (2015).
- Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa. Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).
- Altier, N. A., Thies, J. A. Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method. Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).
- Pratt, R. G., Rowe, D. E. Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling. Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).
- Hao, C., et al. De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici. BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).
- Dong, C., et al. Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides. Bio-protocol. 8 (23), 3099 (2018).
- English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae. Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).
- Chatterjee, S., et al. Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans). Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).
- Pfender, W. F. Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil. Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).
- Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence. HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Hardham, A., Gubler, F. Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube. Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).
