Summary
Denne prosedyren beskriver en oversettbar progressiv lastet løpehjulmotstandstreningsmodell hos mus. Den primære fordelen med denne motstandstreningsmodellen er at den er helt frivillig, og dermed reduserer stress for dyrene og belastningen på forskeren.
Abstract
Tidligere utviklede gnagermotstandsbaserte treningsmodeller, inkludert synergistisk ablasjon, elektrisk stimulering, vektet stigeklatring, og sist, vektet sledetrekking, er svært effektive for å gi en hypertrofisk stimulus for å indusere skjelettmuskeltilpasninger. Selv om disse modellene har vist seg uvurderlige for skjelettmuskelforskning, er de enten invasive eller ufrivillige og arbeidsintensive. Heldigvis løper mange gnagerstammer frivillig lange avstander når de får tilgang til et løpehjul. Ladd hjuldrift (LWR) modeller hos gnagere er i stand til å indusere tilpasninger som ofte observeres med motstandstrening hos mennesker, for eksempel økt muskelmasse og fiberhypertrofi, samt stimulering av muskelproteinsyntese. Imidlertid klarer ikke tillegget av moderat hjulbelastning enten å avskrekke mus fra å løpe store avstander, noe som reflekterer mer en utholdenhets- / motstandstreningsmodell, eller musene slutter å løpe nesten helt på grunn av metoden for belastningsapplikasjon. Derfor er det utviklet en ny høylasthjulsmodell (HLWR) for mus der ekstern motstand påføres og økes gradvis, slik at mus kan fortsette å løpe med mye høyere belastning enn tidligere utnyttet. Foreløpige resultater fra denne nye HLWR-modellen antyder at den gir tilstrekkelig stimulans til å indusere hypertrofiske tilpasninger i løpet av 9 ukers treningsprotokoll. Her beskrives de spesifikke prosedyrene for å utføre denne enkle, men rimelige progressive motstandsbaserte treningstreningsmodellen hos mus.
Introduction
Skjelettmuskelmasse utgjør ca. 40% av kroppsmassen hos voksne mennesker; Dermed er det viktig å opprettholde skjelettmuskelmasse gjennom livet. Skjelettmuskelmasse spiller en integrert rolle i energimetabolisme, opprettholder kjernekroppstemperatur og glukosehomeostase1. Vedlikehold av skjelettmuskulatur er en balanse mellom proteinsyntese og proteinnedbrytning, men mange hull eksisterer fortsatt i forståelsen av de intrikate molekylære mekanismene som driver disse prosessene. For å studere de molekylære mekanismene som regulerer vedlikehold og vekst av muskelmasse, bruker menneskers forskningsmodeller ofte motstandsøvelsesbaserte inngrep, siden mekaniske stimuli spiller en integrert rolle i reguleringen av skjelettmuskelmasse. Mens forskning på mennesker har vært vellykket, begrenser tiden som er nødvendig for å vise tilpasninger og etiske bekymringer angående invasive prosedyrer (dvs. muskelbiopsier) mengden data som kan oppnås. Mens tilpasningene til motstandsøvelse er ganske allestedsnærværende på tvers av pattedyrarter, gir dyremodeller fordelen av å kunne kontrollere diett- og treningsregimet nøyaktig, samtidig som det muliggjør innsamling av hele vev i hele kroppen, som hjerne, lever, hjerte og skjelettmuskulatur.
Mange motstandstreningsmodeller er utviklet for bruk hos gnagere: synergistisk ablasjon2, elektrisk stimulering 3,4, vektet stigeklatring5, vektet sledetrekk6 og canvassed huk7. Det er tydelig at alle disse modellene, hvis de gjøres riktig, kan være effektive modeller for å indusere skjelettmuskulaturtilpasninger, for eksempel hypertrofi. Ulempene med disse modellene er imidlertid at de for det meste er ufrivillige, ikke en del av normal gnageradferd, tids- / arbeidsintensiv og invasiv.
Heldigvis løper mange muse- og rottestammer frivillig lange avstander når de får tilgang til et løpehjul. Videre er friløpshjul (FWR) treningsmodeller ikke avhengige av omfattende kondisjonering, positiv / negativ forsterkning eller anestesi for å tvinge bevegelse eller muskelaktivitet 8,9. Løpsaktivitet avhenger i stor grad av musebelastning, kjønn, alder og individuell basis. Lightfoot og medarbeidere sammenlignet løpeaktiviteten til 15 forskjellige musestammer og fant at den daglige løpedistansen varierer fra 2,93 km til 7,93 km, med C57BL/6 mus som løper lengst, uavhengig av kjønn10. FWR er allment akseptert som en utmerket modell for å indusere utholdenhetstilpasninger i skjelett- og hjertemuskler 11,12,13,14,15,16; Imidlertid er bruk av hjulkjøring i motstandstreningsmodeller mindre ofte undersøkt.
Som man kunne mistenke, kan den hypertrofiske effekten av hjulkjøring forsterkes ved å legge til motstand mot løpehjulet, kalt lastet hjulkjøring (LWR), og dermed kreve større innsats for å løpe på hjulet for å etterligne motstandstrening nærmere. Ved hjelp av varierte metoder for belastningsapplikasjon har tidligere studier vist at LWR-modellen ved bruk av rotter og mus rutinemessig viste økninger i muskelmasse på 5% -30% i løpet av 6-8 uker 17,18,19,20,21. Videre viste D'hulst og medarbeidere at et enkelt anfall av LWR førte til en 50% større økning i aktivering av proteinsyntesens signalvei sammenlignet med FWR22. Hjulmotstand har blitt mest brukt av en friksjonsbasert, konstant lastemetode, hvor en magnetisk brems eller spenningsbolt brukes til å bruke hjulmotstand 12,19,23,24. En advarsel ved friksjonsbasert, konstant belastningsmetode er at når moderat til høy motstand påføres, kan dyret ikke overvinne den høye motstanden for å starte bevegelse av hjulet, og effektivt slutte å trene. Viktigst av alt, mange av bur- og hjulsystemene som brukes til gnagere, er ganske kostbare og krever spesialutstyr.
Nylig utviklet Dungan og medarbeidere en progressiv vektet hjulgående (PoWeR) modell, som påfører en belastning på hjulet asymmetrisk via eksterne masser festet til en enkelt side av hjulet. Den ubalanserte hjulbelastningen og den variable motstanden til PoWeR-modellen antas å oppmuntre til fortsatt løpsaktivitet og fremme kortere utbrudd av lastet hjulkjøring hos mus, nærmere etterligne settene og repetisjonene som utføres med motstandstrening17. Til tross for at den gjennomsnittlige løpeavstanden var 10-12 km per dag, ga PoWeR-modellen en økning på henholdsvis 16% og 17% i plantaris muskel våtmasse og fibertverrsnittsareal (CSA). Til tross for mange praktiske fordeler har PoWeR-modellen til LWR noen begrensninger. Som anerkjent av forfatterne, er PoWeR-modellen en "hybrid" stimulus med høyt volum som reflekterer en blandet utholdenhets- / motstandstreningsmodell (dvs. samtidig trening hos mennesker), i motsetning til en strengere motstandsøvelsesbasert modell, som potensielt introduserer en interferenseffekt og bidrar til den mindre uttalt hypertrofi eller forskjellige mekanismer som hypertrofi induseres25 . Det er viktig å sikre at et samtidig treningsfenomen ikke forekommer i det som er ment å være en motstandstreningsmodell. Derfor ble PoWeR-modellen modifisert for å utvikle en LWR-modell som bruker høyere belastninger enn tidligere brukt til å ligne mer på en motstandstreningsmodell. Her er detaljer gitt for en enkel og billig 9 ukers progressiv motstandstrening LWR-modell i C57BL / 6 mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Appalachian State Universitys institusjonelle dyrepleie- og brukskomité (# 22-05).
1. Dyr
- Anskaffe C57BL/6 mus fra den interne musekolonien.
MERK: Hannmus i alderen 5-8 måneder ved starten av studien ble brukt. Daglig løpeaktivitet topper og platåer rundt 9-10 uker i alderen26 år. Tidligere studier har vist at gamle mus (22-24 måneder) også vil utføre lastet hjulkjøring27. - Hus musene individuelt i et standard gnagerbur med et trådlokk og hold buret i et kontrollert miljø (20-24 ° C med en 12:12 h lys: mørk syklus).
- Gi standard gnager chow og vann ad libitum.
2. Løpende hjulapparat
- Løpende hjuloppsett:
MERK: Løpehjul er montert / satt opp på samme måte for alle løpeprotokoller, bortsett fra å legge til 1 g eller 2,5 g lastmagneter.- Lim en enkelt 1 g sensormagnet til den ytre midtomkretsen av løpehjulet (figur 1).
- Bruk dette hjulet med en enkelt 1 g sensormagnet for bare den første uken med hjulakklimatisering.
- Lastet hjulkjøring (LWR; identisk lasteprotokoll til PoWeR17): Følg trinn 2.1.4-2.1.6.
- Uke 2 for LWR krever 2 g belastning (se tabell 1).
- Lim to 1 g magneter side om side på hjulets ytre omkrets (figur 2A).
MERK: Her er det nyttig å bruke tape for å holde magnetene på plass til limet tørker godt; Ellers kan de bli tiltrukket av sensormagneten og bli løsnet. - Påfør ekstra belastning i uke 3, 4 og 6 ved å plassere en annen 1 g magnet på toppen av en av magnetene som allerede er tilstede.
MERK: Ingen lim er nødvendig da magnetene fester seg godt til hverandre. For eksempel, med 6 g belastning i uke 6, vil magnetene hver bli stablet tre høye (figur 2B). - Høyt lastet hjulkjøring (HLWR): Følg trinn 2.1.8-2.1.11.
MERK: HLWR-protokollen krever tre sett med hjul. Montering av forskjellige sett med hjul gjør det mulig for forskeren å gjenbruke hjuloppsett for andre mus når hjulet er grundig rengjort og desinfisert (antall av hvert sett bør bestemmes av forskeren basert på kohort / gruppestørrelse). - Det første settet med hjul (kun nødvendig for uke 2) vil ha en enkelt 2,5 g magnet; lim (se MERKNADEN nedenfor trinn 2.1.5) en 2,5 g magnet på hjulets ytre omkrets (figur 3A).
- Det andre settet med hjul (kreves kun for uke 3) vil ha to 2,5 g magneter; lim (se MERKNADEN nedenfor trinn 2.1.5) to 2,5 g magneter side om side på hjulets ytre omkrets (figur 3B).
- Det tredje settet med hjul (kreves for uke 4 og utover) vil ha tre 2,5 g magneter side om side; lim (se MERKNADEN nedenfor trinn 2.1.5) tre 2,5 g magneter side om side på hjulets ytre omkrets (figur 3C).
- Påfør ekstra belastning i uke 6 og 8 ved å plassere en annen 2,5 g magnet på toppen av en av magnetene som allerede er tilstede (figur 3D, E).
Figur 1: Grunnleggende løpehjul med enkel 1 g sensormagnet limt til hjulets midtre ytre omkrets. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Lastet løpehjul (LWR) med sensormagnet og 1 g lastemagneter. (A) Eksempel på 2 g belastning, to 1 g magneter limt side om side til ytterkanten av hjulet; (B) eksempel på 6 g belastning, to 1 g magneter limt side om side til ytterkanten av hjulet med ytterligere 4 g belastning påført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Høyt lastet løpehjul (HLWR) med sensormagnet og 2,5 g lastemagneter. (A) eksempel på 2,5 g belastning, en 2,5 g magnet limt til ytterkanten av hjulet; (B) eksempel på 5 g last, to 2,5 g magneter limt side om side til ytterkanten av hjulet; (C) eksempel på 7,5 g last, tre 2,5 g magneter limt side om side til ytterkanten av hjulet; (D) eksempel på 10 g last, tre 2,5 g magneter limt side om side til ytterkanten av hjulet, med ytterligere 2,5 g belastning påført; (E) eksempel på 12,5 g belastning, tre 2,5 g magneter limt side om side til ytterkanten av hjulet, med ytterligere 5 g belastning påført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Burmontering
- Monter løpehjul ved hjelp av et bur utstyrt med en digital sykkelcomputer for å overvåke tidstrening (h) og tilbakelagt avstand (km). Gjennomsnittshastighet (km/t) er avledet aritmetisk.
- Forsikre deg om at et nytt batteri er satt inn i sykkelcomputeren før montering.
- Angi hjulstørrelse under innledende sykkelcomputerprogrammering (se produsentens instruksjoner); Beregn per omdreiningsavstand ved å måle løpehjulets ytre omkrets (f.eks. 3 580 mm for hjultypen som brukes her).
- Plasser sykkelcomputersensoren i en solid overflate på utsiden av burlokket, rett over der sensormagneten på hjulet er plassert. Forsikre deg om at alle datamaskin- og sensorkomponenter er inne i en solid barriere utenfor buret for å forhindre at mus tygger på komponenter.
- Bruk lokket på en tom pipettespissboks med et lite rektangel kuttet ut for at den magnetiske sykkelsensoren skal ligge, og hoveddelen av boksen (med spissen av stativet fjernet) for å holde sykkelcomputeren og ledningen (figur 4A).
- Bor to hull gjennom hjørnene på den faste overflaten for å sikre magnetisk sykkelsensor og løpehjulstativ på plass på utsiden av buret (figur 4A).
- Sett den løpende hjulbasen opp ned gjennom hullene i burlokket, men på toppen av den faste overflaten beskrevet i trinn 3.2 (figur 4B).
- Fest hjulbasen og datasensoren til toppen av buret med maskinvare (figur 4C, D).
- Forsikre deg om at sensormagneten og datasensoren ikke er plassert mer enn 1 cm fra hverandre for å muliggjøre riktig registrering av hjulbevegelse (de fleste standard sykkelcomputersensorer er toveis og vil registrere positiv hjulbevegelse i begge rotasjonsretninger).
- Fest riktig løpehjul (som beskrevet ovenfor) til hjulbunnen fra innsiden av burlokket, og plasser lokket sikkert på buret (figur 4E, F).
- Med hjulet hengende fra burlokket, sørg for minst 2,5 cm klaring fra burgulvet. Plasser en minimal mengde sengetøymateriale i buret for å sikre at hjulet spinner fritt, men ikke blir hindret av oppbygging av sengetøy.
- Under eksperimentering, registrer data fra sykkelcomputeren på en konsekvent intervallplan for å sikre nøyaktig aktivitetsovervåking.
- Gjenkjenne at mus er en nattlig art; Derfor vil det meste av deres naturlige buraktivitet (inkludert hjulkjøring) utføres i løpet av de mørke timene i lyssyklusen.
Figur 4: Montering av løpehjulbur. (A) Sykkelcomputer og magnetisk sensor plassert i solid overflate / skuff; (B) omvendt hjulbase plassert på toppen av solid overflate / skuff og sensor (toppvisning; legg merke til de to hullene i sensoroverflaten / skuffen for å feste basen til burlokket med maskinvare), (C) omvendt hjulbase med maskinvare montert (nederste visning); (D) omvendt hjulbase med maskinvare montert (toppvisning); (E) full burmontering (sett ovenfra); og (F) full burmontering (sidevisning). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Protokoller for lasting av treningstrening
- Hus individuelt stillesittende (SED) mus i 9 uker i et bur som inneholder et låst løpehjul for å forhindre løping.
MERK: Tabell 1 gir lasteplanen for LWR (PoWeR) og HLWR-protokollene som brukes i eksperimentell design. - Reduser belastningen for LWR- og HLWR-gruppene, om nødvendig, for å sikre at musene fortsetter å trene i hele 9-ukersprotokollen.
| Uke | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | ||
| LWR (n = 4) | Belastning (g) | 0.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 5.0 | 6.0 | 6.0 | 6.0 |
| %BM | -- | 8% | 11% | 15% | 19% | 19% | 23% | 23% | 23% | |
| HLWR (n =7) | Belastning (g) | 0.0 | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 7.5 | 10.0 | 10.0 | 12.5 | 12.5 |
| %BM | -- | 10% | 19% | 28% | 28% | 38% | 38% | 48% | 48% | |
Tabell 1. Protokoller for kjøring av lastede hjul
5. In situ muskelfunksjonstesting, vevshøsting og vevsanalyse
- Etter 9 ukers treningsintervensjon, bedøve mus ved hjelp av inhalert isofluran (4% induksjon, 2% vedlikehold) med ekstra oksygen, og sørg for riktig bedøvelsesplanovervåking gjennom hele prosedyren.
- Utfør en in situ muskelfunksjonstest på gastrocnemius, plantaris, soleus (GPS) komplekset for å teste isometrisk muskelstyrke28. Etablere en kraftfrekvenskurve ved å stimulere isjiasnerven direkte med 27 G elektrodetåler ved 11 stigende frekvenser mellom 1-300 Hz, med tetaniske sammentrekninger som forekommer rundt 100-150 hz29.
- Umiddelbart etter muskelfunksjonstesten, avlive musene via cervikal dislokasjon og bekreft eutanasi ved å fjerne hjertet. Forsiktig excise plantaris og soleus muskler og registrere våtvevsmassen.
- Belegg hver muskelprøve i et innebyggingsmedium (OCT) og monter den på en kork. Frys den i flytende nitrogenkjølt isopentan, og oppbevar den ved -80 °C til ytterligere immunhistokjemisk (IHC) analyse utføres på deler av muskelvev (10 μm tykt).
- Analyser muskelfiber CSA ved hjelp av immunfluorescens for laminin. Mål fiber CSA ved hjelp av en automatisk bildekvantifiseringsplattform30.
6. Statistisk analyse
- Uttrykk alle data som gjennomsnitt ± SD.
- Utføre statistiske analyser ved hjelp av statistisk analyseprogramvare med signifikans satt til p ≤ 0,05.
- Sammenlign hjulløping og treningsvolumdata med gjentatte målinger toveis ANOVA.
- Sammenlign kroppsmasse, vevsmasse, CSA og muskelfunksjon med en enveis ANOVA. Hvis signifikante F-forhold er funnet, kan du sammenligne forskjeller innad i gruppen ved hjelp av Fisher LSD post hoc-analyser.
- Beregn effektstørrelser, og tolk dem deretter som 0,01, 0,06 og 0,14 for henholdsvis små, mellomstore og store effektstørrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble 24 C57BL/6 mus (6,3 ± 0,7 måneder ved starten av denne studien) randomisert til en av tre behandlingsgrupper: stillesittende (SED), lastet hjulkjøring (LWR; samme som PoWeR beskrevet av Dungan et al.17), eller høy LWR (HLWR), og fullførte deretter sin respektive 9 ukers protokoll. Etter akklimatiseringsuken (uke 1) var det ingen gruppe- eller gruppe x tidsforskjeller i løpeavstand eller treningsvolum (figur 5).
Figur 5: Løpehjulegenskaper for gruppene LWR (grønnfylte firkanter) og HLWR (rødfylte trekanter). (A) Gjennomsnittlig daglig løpedistanse (km); (B) gjennomsnittlig treningsvolum (km/dag∙g) uttrykt som daglig løpedistanse (km/dag) multiplisert med daglig hjulbelastning (i g). Data uttrykkes som gruppegjennomsnitt ± SD. LWR, n = 4; HLWR, n = 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Normalisert soleusmasse var 21,4 % større i HLWR-gruppen enn SED-gruppen (p < 0,001), til tross for ingen forskjell i fiber CSA (p = 0,536) (figur 6A). Selv om plantaris muskelmasse og gjennomsnittlig fiber CSA ikke viste statistisk signifikante forskjeller (henholdsvis p = 0,573 og p = 0,111), ser det ut til å være et skifte i andelen fibre med større CSA i plantaris av HLWR, sammenlignet med SED og LWR (figur 6B). Det var ingen signifikante forskjeller i rykninger eller toppkraft i GPS-komplekset mellom gruppene målt ved in situ muskelfunksjonstest (tabell 2).
Figur 6: Fiber tverrsnittsareal proporsjoner. (A) Soleus og (B) plantaris muskelfiberproporsjoner (%) etter tverrsnittsareal for SED (svarte fylte sirkler), LWR (grønne fylte firkanter) og HLWR (røde fylte trekanter) grupper (n = 3-4 / gruppe). Soleusmuskelen inneholder lignende fiber CSA-proporsjoner i alle grupper. Plantarismuskelen i HLWR-gruppen ser ut til å ha en høyere andel fibre med større CSA, sammenlignet med SED- og LWR-grupper. Data uttrykkes som gruppegjennomsnitt for hver fiberstørrelseskategori. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gruppe | |||||
| SED | LWR | HLWR | P-verdi | Effektstørrelse (ƞ2) | |
| Kroppsmasse før trening (g) | 26.35 ± 2.12 | 28.07 ± 3.42 | 25.71 ± 2.22 | 0.299 | 0.324 |
| Kroppsmasse etter trening (g) | 26.82 ± 1,96 | 28.91 ± 2.80 | 27.43 ± 2.07 | 0.251 | 0.341 |
| Soleusmasse (mg/g BM) | 0,28 ± 0,03 | 0,31 ± 0,02 | 0,34 ± 0,03 # | 0.003 | 0.611 |
| Plantarismasse (mg/g BM) | 0,61 ± 0,06 | 0,64 ± 0,03 | 0,63 ± 0,06 | 0.573 | 0.239 |
| Soleus CSA (μm²) | 2042 ± 320 | 1964 ± 357 | 1800 ± 206 | 0.536 | 0.130 |
| Plantaris CSA (μm²) | 2032 ± 159 | 2483 ± 579 | 2754 ± 109 | 0.111 | 0.519 |
| Rykkekraft (N/g GPS) | 2,96 ± 0,47 | 03,19 ± 0,58 | 3,42 ± 0,78 | 0.254 | 0.340 |
| Maksimal tetanisk kraft (N/g GPS) | 11.43 ± 1,77 | 13.04 ± 2,87 | 13.13 ± 1,70 | 0.136 | 0.395 |
| # - indikerer signifikant forskjellig fra SED; Effektstørrelse (ƞ2): liten = 0,01; middels = 0, 06; stor = 0,140 | |||||
Tabell 2. Dyreegenskaper, vevsmasse, muskelkraft og fibertverrsnittsareal
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksisterende motstandstreningsmodeller hos gnagere har vist seg uvurderlige for skjelettmuskelforskning; Imidlertid er mange av disse modellene invasive, ufrivillige og / eller tids- og arbeidskrevende. LWR er en utmerket modell som ikke bare induserer lignende muskulære tilpasninger som de som observeres i andre godt aksepterte motstandstreningstreningsmodeller, men gir også en kronisk, lavspenningstreningsstimulus for dyret med minimal tid / arbeidsforpliktelse fra forskeren. I tillegg, siden LWR-modeller krever minimal direkte intervensjon fra forskeren, kan hele kohorter av mus lett trenes samtidig for kort- eller langsiktige intervensjonsstudier. Imidlertid klarer ikke anvendelsen av moderat hjulbelastning å avskrekke mus fra å løpe store avstander (for lite motstand), eller musene slutter å løpe nesten helt på grunn av metoden for belastningspåføring (for mye motstand). Den progressive veide hjulgående (PoWeR) LWR-modellen utviklet av Dungan et al (2019) 17 gir betydelige muskulære tilpasninger, for eksempel fiberhypertrofi, men fremmer også et skifte til en mer oksidativ fenotype. Begrensningen av PoWeR som en virkelig "motstandsbasert" modell er at den fremkaller en stimulus med høyere volum (avstand) og lavere belastning (motstand), mer reflekterende for et hybrid treningsregime som gir en kombinasjon av både motstands- og utholdenhetsstimuli. Derfor er det utviklet en ny modell for høyt lastet hjulkjøring (HLWR) for mus som modifiserte PoWeR-modellen for å gi mer motstandsforspent stimulans der den eksterne belastningen påføres og gradvis økes, slik at mus kan fortsette å løpe, men ved mye høyere belastninger enn tidligere brukt. Vår modell benyttet det samme konseptet med ubalansert hjullasting som PoWeR-modellen, men med et enklere og rimeligere system. I tillegg til den "normale" sporadiske (på og av) løpende hjuloppførselen til mus, fører ubalansert hjulbelastning til at mus løper i avbrutte "spruter". Dette skyldes at musen er pålagt å trekke lasten til toppen av hjulet (motsatt tyngdekraft) under første halvdel av revolusjonen, bare til "kyst" eller "fritt hjul" når lasten faller mot bunnen med tyngdekraften i andre halvdel av revolusjonen.
Etter 9 ukers trening viste soleusmuskelen til HLWR-mus en 21,4% økning i muskelmasse, men ingen forskjell i fiber CSA. Mens plantarismuskelen til HLWR-mus ikke viste noen signifikant økning i muskelmasse, syntes andelen fibre med større CSA å øke. Konhilas og medarbeidere og Soffe og medarbeidere observerte ingen forskjeller i muskelvekst mellom lav motstand og hjul med høy motstand19,23; I den nåværende studien økte imidlertid soleusmassen med ~ 10% og ~ 20% i henholdsvis LWR- og HLWR-gruppene. Det virker sannsynlig at muskelhypertrofi som svar på den nye HLWR-motstandstreningsmodellen kan være muskel- og fibertypespesifikk; Imidlertid er det behov for ytterligere undersøkelser for å bekrefte denne oppfatningen. In situ muskelfunksjonstest ble utført som en enkelt akutt seanse, kun på høyre lem av musen ved slutten av 9-ukersprotokollen, rett før eutanasi og vevssamling. Muskelmasse (våt masse normalisert til kroppsmasse) rapportert her er bare fra venstre lem av musen, da det er betydelig hevelse / ødem fra den kirurgiske prosedyren som kan endre våt masse i musklene i høyre lem.
Betydningen av denne nye HLWR-modellen er at den demonstrerer at mus vil fortsette å løpe med relativt høye belastninger på hjulet. Hjulbelastning i forhold til gjennomsnittlig kroppsmasse (% BM) av C57BL/6 mus er basert på gjennomsnittlig kroppsmasse for mus som brukes i dette prosjektet (~26 g). Gjennomsnittlig musekroppsmasse vil variere avhengig av belastning, alder og kjønn. De høyeste belastningene på 10-12,5 g i HLWR-modellen (tilsvarende ~ 40% -50% av musens kroppsmasse) er betydelig høyere enn for PoWeR-modellen (maksimum = 6 g), eller omtrent dobbelt så stor hjulmotstand. Selv om det ikke er statistisk signifikant, ser det ut til å være en sterk nedgang i løpeavstanden ettersom hjulbelastningen utviklet seg forbi 7,5 g i uke 6 og utover HLWR-modellen, mens LWR opprettholdt en konstant gjennomsnittlig løpeavstand for resten av 9-ukersprotokollen. Svikt i høye hjulbelastninger i HLWR-modellen for å dempe løpeavstanden betydelig er en begrensning for disse funnene; Dette kan imidlertid reduseres med større kohortstørrelser da det var svært stor variasjon i løpsprestasjoner innad i gruppene.
Det kan være vanskelig å vurdere musens tilbøyelighet til konsekvent å løpe i løpet av den første uken av akklimatisering til hjulkjøring. Siden noen mus bare ikke vil løpe nok til å indusere muskulære tilpasninger, anbefales det å implementere en minimumsgrenseavskjæring for fortsatt inkludering av en bestemt mus i hjulkjøringsgrupper. Minste grenseverdi bør være en gjennomsnittlig løpeavstand på minst 1 km/dag i løpet av den første uken med akklimatisering. Hvis en mus ikke løper minst 1 km / dag i gjennomsnitt i løpet av den første uken, er det lite sannsynlig at musen vil øke løpeavstanden betydelig i løpet av resten av 9-ukersprotokollen for å gi en betydelig stimulans for tilpasninger som skal skje. I dette tilfellet, hvis en bestemt mus ikke oppfyller minimumsgrensen på 1 km/dag etter den første akklimatiseringsuken, låser du hjulet og overfører musen til stillesittende gruppe. Implementering av denne minimumsterskelgrensen vil redusere variabiliteten i løpsstatistikk og sikre at mus vil skaffe seg en tilstrekkelig treningsstimulans i løpet av 9-ukersprotokollen. Dette er i ånden av de tre "R's" av dyreforsøk, spesielt reduksjon. For det andre er det viktig å ha en innebygd beredskapsplan hvis en mus ikke klarer å løpe en viss avstand når høye hjulbelastninger påføres. For å sikre at musene fortsetter å trene i hele 9-ukersprotokollen, bør belastningen reduseres til forrige uke hvis løpedistansen faller under 0,25 km/dag i 3 påfølgende dager. I dette tilfellet, hvis en bestemt mus ikke kjører i gjennomsnitt minst 0,25 km over 3 påfølgende dager etter at belastningen er lagt til, kan det være nødvendig å redusere hjulbelastningen tilbake til forrige belastning for å sikre at musen vil fortsette å trene resten av 9-ukersprotokollen. I denne studien ble det observert at de fleste mus var i stand til å fortsette å løpe avstander > 0,25 km / dag, selv med de høyeste belastningene (12,5 g) i HLWR-protokollen (figur 5A). Imidlertid ble denne beredskapsplanen implementert for tre av de syv musene i HLWR-gruppen, hvorved belastningen måtte reduseres til enten 10 g eller 7,5 g på et tidspunkt i løpet av den 9 ukers treningsprotokollen. Det ville være uheldig å ha en mus vellykket kjøre for flertallet av protokollen bare for å bli fjernet fra studien fordi den ikke kunne nå neste trinn ved svært høye hjulbelastninger. Å redusere belastningen litt for å sikre fortsatt løping maksimerer bruken av et enkelt dyr uten at det går ut over velferden. Til slutt er det også viktig å spore daglig (eller i det minste ukentlig) matforbruk for å sikre at mus bruker nok mat til å kompensere for økt fysisk aktivitet. Dette er relativt enkelt når mus er individuelt plassert. Forvent en økning i matinntaket på ~ 20% sammenlignet med stillesittende mus31.
Det er vanskelig å sammenligne disse resultatene direkte (f.eks. løpeavstander) med de som opprinnelig ble publisert for PoWeR-modellen. Dungan og medarbeidere rapporterte løpeavstander på ~ 10-12 km per dag17, mens mus i den nåværende protokollen som utførte LWR-protokollen løp ~ 5-6 km per dag. Den sterke uoverensstemmelsen kan tilskrives hannmusene som brukes i den nåværende protokollen, sammenlignet med hunnmusene som brukes av Dungan et al., da hunnmus har blitt observert å løpe ~ 20% -40% lenger 10,32. Videre brukte Dungan og medarbeidere metallhjul med en løpeflate med metallstang, noe som kan føre til bedre løpeytelse sammenlignet med de plastiske løpehjulene som brukes i den nåværende protokollen. Det har tidligere blitt rapportert at unge kvinnelige C57BL/6 mus løp i gjennomsnitt 8-10 km/dag på samme plastløpehjuloppsett33. Derfor anbefales det sterkt at pilottesting utføres for individuelle laboratorieinnstillinger for å bestemme kjøreytelsen til mus på grunn av faktorer som belastning, kjønn, hjultype og individuell variasjon.
Den største fordelen med hjulkjøringsmodellen med høy belastningsmotstand som er beskrevet her, er at den er mye mer kostnadseffektiv enn andre modeller som krever dyrt spesialutstyr. Utstyr for dette løpende hjuloppsettet koster en brøkdel av spesialiserte løpehjulapparater tilgjengelig fra kommersielle leverandører. Til slutt, lastet hjulet kjører modeller oppfylle en annen av de tre "R's" av dyrevern-raffinement. Siden hjulkjøring er en helt frivillig stimulans, er disse modellene ikke-invasive og betydelig mindre stressende for mus sammenlignet med andre hypertrofimodeller, spesielt synergistisk ablasjon eller andre modeller som krever dager eller uker med operant kondisjonering. Fremtidige studier bør bekrefte at HLWR-modellen gir en større hypertrofisk stimulus sammenlignet med den blandede utholdenhets- / motstandstimulansen til LWR-modellen. Avslutningsvis, hvis den utføres riktig, er den potensielle anvendelsen av denne nye, progressive, høybelastningsmotstandshjulmodellen en enkel, men billig, høy gjennomstrømning og lavspenningsmotstandstreningsintervensjon for mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Graduate Student Government Association, Office of Student Research og Department of Health and Exercise Science ved Appalachian State University for å gi finansiering for å støtte dette prosjektet. I tillegg vil vi takke Monique Eckerd og Therin Williams-Frey for å føre tilsyn med den daglige driften av dyreforsøksanlegget.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND018-6 | Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading |
| 2.5 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND022 | Used for 2.5 g increments of wheel loading |
| 8-32 x 1" stainless steel screws | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 | |
| 8-32 Wing Nuts | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| 10 µL pipette tip box (empty) | Thermo Scientific | 2140 | We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice |
| Extreme Liquid Glue | Loctite | ||
| Laminin primary antibody | Novus Biologicals | NB300-144AF647 | primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum |
| Lithium 3 V battery | n/a | CR2032 | |
| M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| MyoVision: Automated Image Quantification Platform | Wen et al. (2017) | v1.0 | https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision |
| Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid | Orchid Scientific | Polycarbonate Rat Cage Type II | https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa |
| Sigma Sport 509 Bike Computer | Sigma Sport | Does not need to be this model in particular, but must have distance and time monitoring capabilities | |
| Silent Spinner Running Wheel (mini 11.4 cm) | Kaytee | SKU# 100079369 | https://www.kaytee.com/all-products/small-animal/silent-spinner-wheel |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Goldberg, A. L. Protein synthesis during work-induced growth of skeletal muscle. Journal of Cell Biology. 36 (3), 653-658 (1968).
- Baar, K., Esser, K. Phosphorylation of p70S6k correlates with increased skeletal muscle mass following resistance exercise. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 276 (1), 120-127 (1999).
- Wong, T. S., Booth, F. W. Skeletal muscle enlargement with weight-lifting exercise by rats. Journal of Applied Physiology. 65 (2), 950-954 (1988).
- Hornberger Jr, T. A., Farrar, R. P. Physiological hypertrophy of the FHL muscle following 8 weeks of progressive resistance exercise in the rat. Canadian Journal of Applied Physiology. 29 (1), 16-31 (2004).
- Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
- Tamaki, T., Uchiyama, S., Nakano, S. A weight-lifting exercise model for inducing hypertrophy in the hindlimb muscles of rats. Medicine and Science in Sports and Exercise. 24 (8), 881-886 (1992).
- De Bono, J. P., Adlam, D., Paterson, D. J., Channon, K. M. Novel quantitative phenotypes of exercise training in mouse models. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 290 (4), 926-934 (2006).
- Goh, J., Ladiges, W.
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Daves, M., Vordermark, A., Kleeberger, S. R. Genetic influence on daily wheel running activity level. Physiological Genomics. 19 (3), 270-276 (2004).
- Allen, D. L., et al. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. Journal of Applied Physiology. 90 (5), 1900-1908 (2001).
- Ishihara, A., et al. Effects of running exercise with increasing loads on tibialis anterior muscle fibres in mice. Experimental Physiology. 87 (2), 113-116 (2002).
- Kurosaka, M., et al. Effects of voluntary wheel running on satellite cells in the rat plantaris muscle. Journal of Sports Science and Medicine. 8 (1), 51-57 (2009).
- Lambert, M. I., Noakes, T. D. Spontaneous running increases VO2max and running performance in rats. Journal of Applied Physiology. 68 (1), 400-403 (1990).
- Rodnick, K. J., Reaven, G. M., Haskell, W. L., Sims, C. R., Mondon, C. E. Variations in running activity and enzymatic adaptations in voluntary running rats. Journal of Applied Physiology. 66 (3), 1250-1257 (1989).
- Sexton, W. L. Vascular adaptations in rat hindlimb skeletal muscle after voluntary running-wheel exercise. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 287-296 (1995).
- Dungan, C. M., et al. Elevated myonuclear density during skeletal muscle hypertrophy in response to training is reversed during detraining. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 316 (5), 649-654 (2019).
- Ishihara, A., Roy, R. R., Ohira, Y., Ibata, Y., Edgerton, V. R. Hypertrophy of rat plantaris muscle fibers after voluntary running with increasing loads. Journal of Applied Physiology. 84 (6), 2183-2189 (1998).
- Konhilas, J. P., et al. Loaded wheel running and muscle adaptation in the mouse. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (1), 455-465 (2005).
- Legerlotz, K., Elliott, B., Guillemin, B., Smith, H. K. Voluntary resistance running wheel activity pattern and skeletal muscle growth in rats: Wheel running activity pattern and muscle growth. Experimental Physiology. 93 (6), 754-762 (2008).
- Mobley, C. B., et al. Progressive resistance-loaded voluntary wheel running increases hypertrophy and differentially affects muscle protein synthesis, ribosome biogenesis, and proteolytic markers in rat muscle. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 102 (1), 317-329 (2018).
- D'Hulst, G., Palmer, A. S., Masschelein, E., Bar-Nur, O., De Bock, K. Voluntary resistance running as a model to induce mTOR activation in mouse skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 10, 1271 (2019).
- Soffe, Z., Radley-Crabb, H. G., McMahon, C., Grounds, M. D., Shavlakadze, T. Effects of loaded voluntary wheel exercise on performance and muscle hypertrophy in young and old male C57Bl/6J mice: Exercise and muscle hypertrophy in old mice. Scandinavian Journal of Medicine and Science in Sports. 26 (2), 172-188 (2016).
- White, Z., et al. Voluntary resistance wheel exercise from mid-life prevents sarcopenia and increases markers of mitochondrial function and autophagy in muscles of old male and female C57BL/6J mice. Skeletal Muscle. 6 (1), 45 (2016).
- Murach, K. A., McCarthy, J. J., Peterson, C. A., Dungan, C. M. Making mice mighty: Recent advances in translational models of load-induced muscle hypertrophy. Journal of Applied Physiology. 129 (3), 516-521 (2020).
- Swallow, J. G., Garland, T., Carter, P. A., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. Effects of voluntary activity and genetic selection on aerobic capacity in house mice (Mus domesticus). Journal of Applied Physiology. 84 (1), 69-76 (1998).
- Murach, K. A., et al. Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging. Aging Cell. 21 (1), 13527 (2022).
- Mackay, A. D., Marchant, E. D., Louw, M., Thomson, D. M., Hancock, C. R. Exercise, but not metformin prevents loss of muscle function due to doxorubicin in mice using an in situ method. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9163 (2021).
- Godwin, J. S., Hodgman, C. F., Needle, A. R., Zwetsloot, K. A., Andrew, R. Whole-body heat shock accelerates recovery from impact- induced skeletal muscle damage in mice. Conditioning Medicine. 2 (4), 184-191 (2020).
- Wen, Y., et al. MyoVision: Software for automated high-content analysis of skeletal muscle immunohistochemistry. Journal of Applied Physiology. 124 (1), 40-51 (2018).
- Manzanares, G., Brito-da-Silva, G., Gandra, P. G. Voluntary wheel running: Patterns and physiological effects in mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 52 (1), 7830 (2019).
- Bartling, B., et al. Sex-related differences in the wheel-running activity of mice decline with increasing age. Experimental Gerontology. 87, 139-147 (2017).
- Zwetsloot, K. A., Westerkamp, L. M., Holmes, B. F., Gavin, T. P. AMPK regulates basal skeletal muscle capillarization and VEGF expression, but is not necessary for the angiogenic response to exercise: AMPK and the skeletal muscle angiogenic response to exercise. The Journal of Physiology. 586 (24), 6021-6035 (2008).
