Summary
Denna procedur beskriver en översättningsbar progressiv belastad träningsmodell för körhjulsmotstånd hos möss. Den främsta fördelen med denna styrketräningsmodell är att den är helt frivillig, vilket minskar stressen för djuren och belastningen på forskaren.
Abstract
Tidigare utvecklade gnagarmotståndsbaserade träningsmodeller, inklusive synergistisk ablation, elektrisk stimulering, viktstegeklättring och senast viktad släddragning, är mycket effektiva för att ge en hypertrofisk stimulans för att inducera skelettmuskelanpassningar. Även om dessa modeller har visat sig vara ovärderliga för skelettmuskelforskning, är de antingen invasiva eller ofrivilliga och arbetskrävande. Lyckligtvis kör många gnagarstammar frivilligt långa sträckor när de får tillgång till ett löphjul. Laddade hjulkörningsmodeller (LWR) hos gnagare kan inducera anpassningar som vanligtvis observeras med motståndsträning hos människor, såsom ökad muskelmassa och fiberhypertrofi, samt stimulering av muskelproteinsyntes. Tillägget av måttlig hjulbelastning misslyckas dock antingen med att avskräcka möss från att springa stora sträckor, vilket mer återspeglar en uthållighets- / motståndsträningsmodell, eller så slutar mössen att springa nästan helt på grund av metoden för belastningsapplikation. Därför har en ny höglasthjulskörningsmodell (HLWR) utvecklats för möss där yttre motstånd appliceras och gradvis ökas, vilket gör det möjligt för möss att fortsätta springa med mycket högre belastningar än tidigare utnyttjat. Preliminära resultat från denna nya HLWR-modell tyder på att den ger tillräcklig stimulans för att inducera hypertrofiska anpassningar under 9 veckors träningsprotokoll. Häri beskrivs de specifika procedurerna för att utföra denna enkla men billiga progressiva motståndsbaserade träningsmodell hos möss.
Introduction
Skelettmuskelmassa utgör cirka 40% av kroppsmassan hos vuxna människor; Således är det viktigt att upprätthålla skelettmuskelmassa under hela livet. Skelettmuskelmassa spelar en integrerad roll i energimetabolismen, upprätthåller kärnkroppstemperaturen och glukoshomeostas1. Underhållet av skelettmuskulaturen är en balans mellan proteinsyntes och proteinnedbrytning, men det finns fortfarande många luckor i förståelsen av de invecklade molekylära mekanismerna som driver dessa processer. För att studera de molekylära mekanismer som reglerar underhåll och tillväxt av muskelmassa använder mänskliga försökspersoners forskningsmodeller ofta motståndsträningsbaserade interventioner, eftersom mekaniska stimuli spelar en integrerad roll i regleringen av skelettmuskelmassa. Medan forskning på människor har varit framgångsrik, begränsar den tid som krävs för att uppvisa anpassningar och etiska problem angående invasiva förfaranden (dvs. muskelbiopsier) mängden data som kan erhållas. Medan anpassningarna till motståndsträning är ganska allestädes närvarande över däggdjursarter, ger djurmodeller fördelen att kunna exakt kontrollera kost- och träningsregimen samtidigt som de möjliggör insamling av hela vävnader i hela kroppen, såsom hjärnan, levern, hjärtat och skelettmuskeln.
Många styrketräningsmodeller har utvecklats för användning hos gnagare: synergistisk ablation2, elektrisk stimulering3,4, viktad stegklättring5, viktad slädedragning6 och dukad huk7. Det är uppenbart att alla dessa modeller, om de görs korrekt, kan vara effektiva modeller för att inducera skelettmuskelanpassningar, såsom hypertrofi. Undergångarna med dessa modeller är dock att de mestadels är ofrivilliga, inte en del av normalt gnagarbeteende, tids- / arbetsintensiva och invasiva.
Lyckligtvis springer många mus- och råttstammar frivilligt långa sträckor när de får tillgång till ett löphjul. Dessutom förlitar sig träningsmodeller med fritt löpande hjul (FWR) inte på omfattande konditionering, positiv / negativ förstärkning eller anestesi för att tvinga rörelse eller muskelaktivitet 8,9. Löpaktiviteten beror mycket på musbelastning, kön, ålder och individuell basis. jämförde löpaktiviteten hos 15 olika musstammar och fann att den dagliga löpsträckan varierar från 2,93 km till 7,93 km, med C57BL/6 möss som springer längst, oavsett kön10. FWR är allmänt accepterat som en utmärkt modell för att inducera uthållighetsanpassningar i skelett- och hjärtmuskler 11,12,13,14,15,16; Att använda hjulkörning i motståndsträningsmodeller är dock mindre vanligt undersökt.
Som man kan misstänka kan den hypertrofiska effekten av hjulkörning förstärkas genom att lägga till motstånd mot löphjulet, kallat lastat hjulkörning (LWR), vilket kräver större ansträngningar att springa på hjulet för att närmare efterlikna motståndsträning. Med hjälp av olika metoder för belastningsapplikation har tidigare studier visat att LWR-modellen som använder råttor och möss rutinmässigt visade ökningar av muskelmassan i benen på 5%-30% inom loppet av 6-8 veckor 17,18,19,20,21. visade dessutom att en enda anfall av LWR ledde till en 50% större ökning av aktiveringen av proteinsyntessignalvägen jämfört med FWR22. Hjulmotstånd har oftast tillämpats med en friktionsbaserad, konstant belastningsmetod, varigenom en magnetisk broms eller spänningsbult används för att applicera hjulmotstånd 12,19,23,24. En varning för den friktionsbaserade, konstanta belastningsmetoden är att när måttligt till högt motstånd appliceras kan djuret inte övervinna det höga motståndet för att initiera hjulets rörelse, vilket effektivt upphör med träningen. Viktigast av allt är att många av bur- och hjulsystemen som används för gnagare som kör hjulmodeller är ganska kostsamma och kräver specialutrustning.
utvecklade nyligen en progressiv viktad hjulkörning (PoWeR) -modell, som applicerar en belastning på hjulet asymmetriskt via yttre massor som fästs på en enda sida av hjulet. Den obalanserade hjulbelastningen och det variabla motståndet hos PoWeR-modellen tros uppmuntra till fortsatt köraktivitet och främja kortare skurar av laddade hjulkörningar i möss, vilket närmare imiterar uppsättningarna och repetitionerna som utförs med motståndsträning17. Trots att det genomsnittliga löpavståndet var 10-12 km per dag gav PoWeR-modellen en ökning med 16% respektive 17% av plantaris muskelvåt massa respektive fibertvärsnittsarea (CSA). Trots många praktiska fördelar har PoWeR-modellen för LWR vissa begränsningar. Som erkänts av författarna är PoWeR-modellen en "hybrid" -stimulans med hög volym som återspeglar en blandad uthållighets- / motståndsträningsmodell (dvs. samtidig träning hos människor), i motsats till en mer strikt motståndsövningsbaserad modell, som potentiellt introducerar en interferenseffekt och bidrar till den mindre uttalade hypertrofi eller olika mekanismer genom vilka hypertrofi induceras25 . Att säkerställa att ett samtidigt träningsfenomen inte uppstår i vad som är avsett att vara en styrketräningsmodell är absolut nödvändigt. Därför modifierades PoWeR-modellen för att utveckla en LWR-modell som använder högre belastningar än tidigare använts för att mer likna en motståndsträningsmodell. Häri tillhandahålls detaljer för en enkel och billig 9 veckors progressiv motståndsträning LWR-modell i C57BL / 6-mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av Appalachian State University's Institutional Animal Care and Use Committee (#22-05).
1. Djur
- Skaffa C57BL/6-möss från den egna muskolonin.
OBS: Hanmöss 5-8 månaders ålder vid studiens början användes. Daglig löpaktivitet toppar och platåer vid cirka 9-10 veckors ålder26. Tidigare studier har visat att gamla möss (22-24 månader) också kommer att utföra lastad hjulkörning27. - Inhys mössen individuellt i en vanlig gnagarbur med trådlock och håll buren i en kontrollerad miljö (20-24 °C med en ljus:12 h ljus:mörk cykel).
- Ge standard gnagare chow och vatten ad libitum.
2. Löphjulsapparater
- Inställning av löphjul:
OBS: Löphjulen monteras/ställs in på samma sätt för alla löpande protokoll, förutom att lägga till 1 g eller 2,5 g belastningsmagneter.- Limma en enda 1 g sensormagnet på löphjulets yttre mittomkrets (figur 1).
- Använd detta hjul med en enda 1 g sensormagnet under endast den första veckan av hjulacklimatisering.
- Lastad hjulkörning (LWR; identiskt belastningsprotokoll med PoWeR17): Följ steg 2.1.4-2.1.6.
- Vecka 2 för LWR kräver 2 g belastning (se tabell 1) .
- Limma två 1 g-magneter sida vid sida på hjulets yttre omkrets (figur 2A).
OBS: Här är det bra att använda tejp för att hålla magneterna på plats tills limet torkar ordentligt; Annars kan de lockas till sensormagneten och lossna. - Applicera ytterligare belastning under veckorna 3, 4 och 6 genom att placera ytterligare en 1 g magnet ovanpå någon av de magneter som redan finns.
OBS: Inget lim är nödvändigt eftersom magneterna fäster fast vid varandra. Till exempel, med 6 g belastning i vecka 6, kommer magneterna var och en att staplas tre höga (figur 2B). - Högbelastad hjulkörning (HLWR): Följ steg 2.1.8-2.1.11.
HLWR-protokollet kräver tre uppsättningar hjul. Genom att montera olika uppsättningar hjul kan forskaren återanvända hjulinställningar för andra möss när hjulet har rengjorts och sanerats noggrant (antalet av varje uppsättning bör bestämmas av forskaren baserat på kohort / gruppstorlek). - Den första uppsättningen hjul (endast krävs för vecka 2) kommer att ha en enda 2,5 g magnet; limma (se anmärkningen nedan steg 2.1.5) en 2,5 g magnet på hjulets yttre omkrets (figur 3A).
- Den andra uppsättningen hjul (endast krävs för vecka 3) kommer att ha två 2,5 g magneter; limma (se anmärkningen nedan steg 2.1.5) två 2,5 g magneter sida vid sida på hjulets yttre omkrets (figur 3B).
- Den tredje uppsättningen hjul (krävs för vecka 4 och därefter) kommer att ha tre 2,5 g magneter sida vid sida; limma (se anmärkningen nedan steg 2.1.5) tre 2,5 g magneter sida vid sida på hjulets yttre omkrets (figur 3C).
- Applicera ytterligare belastning under vecka 6 och 8 genom att placera ytterligare en 2,5 g magnet ovanpå någon av de magneter som redan finns (figurerna 3D, E).
Figur 1: Grundläggande löphjul med en enda 1 g sensormagnet limmad på hjulets mellersta yttre omkrets. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Laddat löphjul (LWR) med sensormagnet och 1 g lastmagneter. (A) Exempel på 2 g last, två 1 g magneter limmade sida vid sida på hjulets ytterkant; (B) Exempel på 6 g belastning, två 1 g magneter limmade sida vid sida på hjulets ytterkant med ytterligare 4 g belastning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Högbelastat löphjul (HLWR) med sensormagnet och 2,5 g lastmagneter. (A) Exempel på 2,5 g belastning, en 2,5 g magnet limmad på hjulets ytterkant; B) Exempel på 5 g belastning, två 2,5 g magneter limmade sida vid sida vid hjulets ytterkant. C) Exempel på 7,5 g belastning, tre 2,5 g magneter limmade sida vid sida vid hjulets ytterkant. D) Exempel på 10 g belastning, tre 2,5 g magneter limmade sida vid sida vid hjulets ytterkant, med ytterligare 2,5 g belastning. (E) Exempel på 12,5 g belastning, tre 2,5 g magneter limmade sida vid sida på hjulets ytterkant, med ytterligare 5 g belastning applicerad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Burmontering
- Montera löphjul med hjälp av en bur utrustad med en digital cykeldator för att övervaka tidsträning (h) och tillryggalagd sträcka (km). Medelhastigheten (km/h) härleds aritmetiskt.
- Se till att ett nytt batteri sätts in i cykeldatorn innan montering.
- Ställ in hjulstorlek under den första cykeldatorprogrammeringen (se tillverkarens instruktioner); beräkna avståndet per varv genom att mäta löphjulets yttre omkrets (t.ex. 3 580 mm för den hjultyp som används häri).
- Placera cykeldatorsensorn i en fast yta på utsidan av burlocket, direkt ovanför där hjulets sensormagnet är placerad. Se till att alla dator- och sensorkomponenter finns i en solid barriär utanför buren för att förhindra att möss tuggar på komponenter.
- Använd locket på en tom pipettspetslåda med en liten rektangel utskuren för att den magnetiska cykelsensorn ska vara kvar och huvuddelen av lådan (med spetsstället borttaget) för att hålla cykeldatorn och tråden (figur 4A).
- Borra två hål genom hörnen på den fasta ytan för att säkra den magnetiska cykelsensorn och löphjulsstativet på plats på utsidan av buren (figur 4A).
- För in löphjulets bas, upp och ner, genom luckorna i burlocket men ovanpå den fasta yta som beskrivs i steg 3.2 (figur 4B).
- Fäst hjulbasen och datorsensorn på toppen av buren med hårdvara (figur 4C, D).
- Se till att sensormagneten och datorsensorn är åtskilda högst 1 cm från varandra för att möjliggöra korrekt inspelning av hjulrörelser (de flesta vanliga cykeldatorsensorer är dubbelriktade och registrerar positiv hjulrörelse i båda rotationsriktningarna).
- Fäst lämpligt löphjul (enligt beskrivningen ovan) på hjulbasen från insidan av burlocket och placera locket ordentligt på buren (figur 4E, F).
- Med hjulet hängande från burlocket, se till minst 2,5 cm avstånd från burgolvet. Placera en minimal mängd strömaterial i buren för att säkerställa att hjulet snurrar fritt men inte hindras av ansamling av sängkläder.
- Under experimentet registrerar du data från cykeldatorn med ett konsekvent intervallschema för att säkerställa korrekt aktivitetsövervakning.
- Inse att möss är en nattlig art; Därför kommer det mesta av deras naturliga buraktivitet (inklusive hjulkörning) att utföras under de mörka timmarna i ljuscykeln.
Figur 4: Löpande hjulbur. (A) Cykeldator och magnetisk sensor placerad i fast yta / bricka; (B) Inverterad hjulbas placerad ovanpå fast yta/bricka och sensor (ovanifrån; notera de två hålen i sensorytan/brickan för att säkra bas till burlock med hårdvara), (C) inverterad hjulbas med hårdvara monterad (nederkant). D) Inverterad hjulbas med maskinvara monterad (ovanifrån). E) Full burmontering (ovanifrån). och (F) full burmontering (sidovy). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Träningsträningsprotokoll
- Individuellt hus stillasittande (SED) möss i 9 veckor i en bur som innehåller ett låst löphjul för att förhindra körning.
OBS: Tabell 1 visar laddningsschemat för LWR (PoWeR) och HLWR-protokollen som används i den experimentella designen. - Minska belastningen för LWR- och HLWR-grupperna, om det behövs, för att säkerställa att möss fortsätter att träna under hela 9-veckorsprotokollet.
| Vecka | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | ||
| LWR (n = 4) | Ladda (g) | 0.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 5.0 | 6.0 | 6.0 | 6.0 |
| %BM | -- | 8% | 11% | 15% | 19% | 19% | 23% | 23% | 23% | |
| HLWR (n =7) | Ladda (g) | 0.0 | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 7.5 | 10.0 | 10.0 | 12.5 | 12.5 |
| %BM | -- | 10% | 19% | 28% | 28% | 38% | 38% | 48% | 48% | |
Tabell 1. Laddade hjulkörningsprotokoll
5. In situ muskelfunktionstestning, vävnadsskörd och vävnadsanalys
- Efter 9 veckors träningsintervention, bedöva möss med inhalerad isofluran (4% induktion; 2% underhåll) med extra syre och säkerställa korrekt övervakning av anestesiplan under hela proceduren.
- Utför ett in situ muskelfunktionstest på gastrocnemius, plantaris, soleus (GPS) -komplexet för att testa isometrisk muskelstyrka28. Upprätta en kraftfrekvenskurva genom att direkt stimulera ischiasnerven med 27 G elektrodnålar vid 11 stigande frekvenser mellan 1-300 Hz, med tetaniska sammandragningar som inträffar runt 100-150 hz29.
- Omedelbart efter muskelfunktionstestet, avliva mössen via livmoderhalsförskjutning och bekräfta eutanasi genom att ta bort hjärtat. Skär försiktigt ut plantaris- och soleusmusklerna och registrera den våta vävnadsmassan.
- Täck varje muskelprov i ett inbäddningsmedium (OCT) och montera det på en kork. Frys den i flytande kvävekyld isopentan och förvara den vid -80 °C tills ytterligare immunohistokemisk (IHC) analys utförs på delar av muskelvävnad (10 μm tjock).
- Analysera muskelfiber CSA med hjälp av immunofluorescens för laminin. Mät fiber CSA med hjälp av en automatisk bildkvantifieringsplattform30.
6. Statistisk analys
- Uttryck all data som medelvärde ± SD.
- Utföra statistiska analyser med hjälp av statistisk analysprogramvara med signifikans inställd på p ≤ 0,05.
- Jämför hjullöpnings- och träningsvolymdata med upprepade mått tvåvägs ANOVA.
- Jämför kroppsmassa, vävnadsmassa, CSA och muskelfunktion med en enkelriktad ANOVA. Om signifikanta F-förhållanden hittas, jämför skillnader inom gruppen med hjälp av Fisher LSD post hoc-analyser.
- Beräkna effektstorlekar och tolka dem sedan som 0,01, 0,06 och 0,14 för små, medelstora respektive stora effektstorlekar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie lottades 24 C57BL/6-möss (6,3 ± 0,7 månader i början av denna studie) slumpmässigt till en av tre behandlingsgrupper: stillasittande (SED), lastad hjulkörning (LWR; samma som PoWeR beskriven av Dungan et al.17) eller hög LWR (HLWR) och slutförde sedan sitt respektive 9-veckorsprotokoll. Efter acklimatiseringsveckan (vecka 1) fanns det inga grupp- eller grupp x-tidsskillnader i löpdistans eller träningsvolym (figur 5).
Figur 5: Löphjulsegenskaper för grupperna LWR (gröna fyllda rutor) och HLWR (röda fyllda trianglar). A) Genomsnittlig daglig löpsträcka (km). B) Genomsnittlig träningsvolym (km/dag∙g) uttryckt som daglig löpsträcka (km/dag) multiplicerad med daglig hjulbelastning (i g). Data uttrycks som gruppmedelvärde ± SD. LWR, n = 4; HLWR, n = 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Normaliserad soleusmassa var 21,4% större i HLWR-gruppen än SED-gruppen (p < 0,001), trots ingen skillnad i fiber CSA (p = 0,536) (Figur 6A). Även om plantaris muskelmassa och genomsnittlig fiber CSA inte visade statistiskt signifikanta skillnader (p = 0,573 respektive p = 0,111), verkar det finnas en förskjutning i andelen fibrer med en större CSA i plantaris av HLWR, jämfört med SED och LWR (Figur 6B). Det fanns inga signifikanta skillnader i ryckningar eller toppkraft i GPS-komplexet mellan grupperna mätt med ett in situ-muskelfunktionstest (tabell 2).
Figur 6: Fibertvärsnittsareaproportioner. (A) Soleus och (B) plantaris muskelfiberproportioner (%) efter tvärsnittsarea för SED (svarta fyllda cirklar), LWR (gröna fyllda rutor) och HLWR (röda fyllda trianglar) grupper (n = 3-4 / grupp). Soleusmuskeln innehåller liknande fiber CSA-proportioner i alla grupper. Plantarismuskeln i HLWR-gruppen verkar ha en högre andel fibrer med större CSA, jämfört med SED- och LWR-grupper. Data uttrycks som gruppmedelvärde för varje fiberstorlekskategori. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Grupp | |||||
| SED | LWR | HLWR | P-värde | Effektstorlek (ƞ2) | |
| Förträning av kroppsmassa (g) | 26.35 ± 2.12 | 28.07 ± 3.42 | 25.71 ± 2.22 | 0.299 | 0.324 |
| Kroppsmassa efter träning (g) | 26.82 ± 1.96 | 28.91 ± 2.80 | 27.43 ± 2.07 | 0.251 | 0.341 |
| Soleus massa (mg/g BM) | 0,28 ± 0,03 | 0,31 ± 0,02 | 0,34 ± 0,03# | 0.003 | 0.611 |
| Plantaris massa (mg/g BM) | 0,61 ± 0,06 | 0,64 ± 0,03 | 0,63 ± 0,06 | 0.573 | 0.239 |
| Soleus CSA (μm²) | 2042 ± 320 | 1964 ± 357 | 1800 ± 206 | 0.536 | 0.130 |
| Plantaris CSA (μm²) | 2032 ± 159 | 2483 ± 579 | 2754 ± 109 | 0.111 | 0.519 |
| Ryckkraft (N/g GPS) | 2,96 ± 0,47 | 3.19 ± 0,58 | 3,42 ± 0,78 | 0.254 | 0.340 |
| Maximal tetanisk kraft (N/g GPS) | 11.43 ± 1,77 | 13.04 ± 2.87 | 13.13 ± 1.70 | 0.136 | 0.395 |
| # - indikerar signifikant annorlunda än SED; Effektstorlek (ƞ2): liten = 0,01; medium = 0,06; stor = 0,140 | |||||
Tabell 2. Djuregenskaper, vävnadsmassa, muskelkraft och fibertvärsnittsarea
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Befintliga motståndsträningsmodeller hos gnagare har visat sig vara ovärderliga för skelettmuskelforskning; många av dessa modeller är dock invasiva, ofrivilliga och/eller tids- och arbetskrävande. LWR är en utmärkt modell som inte bara inducerar liknande muskelanpassningar som de som observerats i andra väl accepterade styrketräningsmodeller, utan också ger en kronisk, lågstressad träningsstimulans för djuret med minimal tid / arbetsengagemang av forskaren. Dessutom, eftersom LWR-modeller kräver minimal direkt intervention från forskaren, kan hela kohorter av möss enkelt tränas samtidigt för kort- eller långsiktiga interventionsstudier. Tillämpningen av måttlig hjulbelastning misslyckas dock antingen med att avskräcka möss från att springa stora avstånd (för lite motstånd), eller så slutar mössen att springa nästan helt på grund av metoden för lastapplikation (för mycket motstånd). Den progressiva viktade hjulkörningen (PoWeR) LWR-modellen utvecklad av Dungan et al. (2019)17 ger betydande muskelanpassningar, såsom fiberhypertrofi, men främjar också en övergång till en mer oxidativ fenotyp. Begränsningen av PoWeR som en verkligt "motståndsbaserad" modell är att den framkallar en stimulans med högre volym (avstånd) och lägre belastning (motstånd), vilket mer återspeglar en hybridträningsregim som ger en kombination av både motstånds- och uthållighetsstimuli. Därför har en ny högbelastad hjulkörningsmodell (HLWR) utvecklats för möss som modifierade PoWeR-modellen för att ge mer av en motståndsförspänd stimulans där den yttre belastningen appliceras och gradvis ökas, vilket gör det möjligt för möss att fortsätta springa, men vid mycket högre belastningar än tidigare använt. Vår modell använde samma koncept med obalanserad hjulbelastning som PoWeR-modellen men med ett enklare och billigare system. Förutom det "normala" sporadiska (på och av) löphjulsbeteendet hos möss, orsakar obalanserad hjulbelastning möss att springa i avbrutna "spurts". Detta beror på att musen måste dra lasten till toppen av hjulet (motsatt tyngdkraft) under den första halvan av varvtalet, bara för att "kusta" eller "fritt hjul" när lasten faller mot botten med tyngdkraften under andra halvan av varvtalet.
Efter 9 veckors träning visade soleusmuskeln hos HLWR-möss en 21.4% ökning av muskelmassan, men ingen skillnad i fiber CSA. Medan plantarismuskeln hos HLWR-möss inte visade någon signifikant ökning av muskelmassan, verkade andelen fibrer med större CSA öka. och Soffe et al. observerade inga skillnader i muskeltillväxt mellan lågt motstånd och högt motståndshjul som löper19,23; i den aktuella studien ökade dock soleusmassan med ~ 10% respektive ~ 20% i LWR- respektive HLWR-grupperna. Det verkar troligt att muskelhypertrofi som svar på den nya HLWR-motståndsträningsmodellen kan vara muskel- och fibertypspecifik; Det behövs dock ytterligare undersökningar för att bekräfta denna uppfattning. In situ muskelfunktionstestet utfördes som en enda akut session, endast på musens högra lem i slutet av 9-veckorsprotokollet, omedelbart före eutanasi och vävnadsuppsamling. Muskelmassa (våt massa normaliserad till kroppsmassa) som rapporteras här är endast från musens vänstra extremitet, eftersom det finns betydande svullnad / ödem från det kirurgiska ingreppet som kan förändra våt massa i musklerna i höger extremitet.
Betydelsen av denna nya HLWR-modell är att den visar att möss kommer att fortsätta att springa med relativt höga belastningar applicerade på hjulet. Hjulbelastningen i förhållande till den genomsnittliga kroppsmassan (% BM) för C57BL/6-möss baseras på den genomsnittliga kroppsmassan hos möss som används i detta projekt (~26 g). Genomsnittlig muskroppsmassa varierar beroende på belastning, ålder och kön. De högsta belastningarna på 10-12,5 g i HLWR-modellen (motsvarande ~ 40% -50% av musens kroppsmassa) är betydligt högre än för PoWeR-modellen (maximalt = 6 g), eller ungefär dubbelt så mycket som hjulmotståndet. Även om det inte är statistiskt signifikant verkar det finnas en kraftig nedgång i körsträckan när hjulbelastningen utvecklades över 7.5 g under vecka 6 och därefter av HLWR-modellen, medan LWR upprätthöll en konstant genomsnittlig körsträcka under resten av 9-veckorsprotokollet. Misslyckandet med höga hjulbelastningar i HLWR-modellen för att avsevärt dämpa körsträckan är en begränsning för dessa resultat; Detta kan dock mildras med större kohortstorlekar eftersom det fanns mycket hög variation i löpprestanda inom grupperna.
Det kan vara svårt att bedöma en muss benägenhet att konsekvent springa inom den första veckan efter acklimatisering till hjulkörning. Eftersom vissa möss helt enkelt inte kommer att springa tillräckligt för att inducera muskelanpassningar rekommenderas implementering av en minsta tröskelavgränsning för fortsatt inkludering av en viss mus i hjulkörningsgrupper. Minimitröskelgränsen bör vara en genomsnittlig löpsträcka på minst 1 km/dag under den första acklimatiseringsveckan. Om en mus inte springer minst 1 km / dag i genomsnitt under den första veckan är det osannolikt att musen väsentligt kommer att öka löpavståndet under resten av 9-veckorsprotokollet för att ge en betydande stimulans för anpassningar att inträffa. I det här fallet, om en viss mus inte uppfyller minimitröskeln på 1 km / dag efter den första acklimatiseringsveckan, lås hjulet och tilldela musen till den stillasittande gruppen. Att implementera denna minimitröskelavgränsning kommer att minska variationen i löpstatistik och säkerställa att möss kommer att få en adekvat träningsstimulans under 9-veckorsprotokollet. Detta är i andan av de tre "R: erna" för djurförsök, särskilt minskning. För det andra är det viktigt att ha en inbyggd beredskapsplan om en mus inte kan springa ett visst avstånd när höga hjulbelastningar tillämpas. För att säkerställa att möss fortsätter att träna under hela 9-veckorsprotokollet bör belastningen minskas till föregående vecka om löpsträckan sjunker under 0,25 km/dag under 3 dagar i följd. I det här fallet, om en viss mus inte kör i genomsnitt minst 0,25 km under 3 på varandra följande dagar efter att ha lagt till belastning, kan det vara nödvändigt att minska hjulbelastningen tillbaka till föregående belastning för att säkerställa att musen fortsätter att träna under resten av 9-veckorsprotokollet. I denna studie observerades att de flesta möss kunde fortsätta löpsträckorna > 0,25 km/dag, även med de högsta belastningarna (12,5 g) i HLWR-protokollet (figur 5A). Denna beredskapsplan genomfördes dock för tre av de sju mössen i HLWR-gruppen, varigenom belastningen behövde minskas till antingen 10 g eller 7,5 g vid ett tillfälle under 9 veckors träningsprotokoll. Det skulle vara olyckligt att ha en mus som framgångsrikt körs för majoriteten av protokollet bara för att tas bort från studien eftersom den inte kunde nå nästa steg vid mycket höga hjulbelastningar. Att minska belastningen något för att säkerställa fortsatt körning maximerar användningen av ett enskilt djur utan att kompromissa med välbefinnandet. Slutligen är det också viktigt att spåra daglig (eller åtminstone veckovis) matkonsumtion för att säkerställa att möss konsumerar tillräckligt med mat för att kompensera för den ökade fysiska aktiviteten. Detta är relativt enkelt när möss är individuellt inrymda. Förvänta dig en ökning av matintaget med ~ 20% jämfört med stillasittande möss31.
Det är svårt att direkt jämföra dessa resultat (t.ex. löpsträckor) med de som ursprungligen publicerades för PoWeR-modellen. rapporterade löpsträckor på ~ 10-12 km per dag17, medan möss i det nuvarande protokollet som utförde LWR-protokollet sprang ~ 5-6 km per dag. Den skarpa skillnaden kan hänföras till de manliga möss som används i det nuvarande protokollet, jämfört med de kvinnliga möss som används av Dungan et al., eftersom honmöss har observerats springa ~ 20% -40% längre10,32. använde dessutom metallhjul med en metallstavs löpyta, vilket kan leda till bättre körprestanda jämfört med de plasthjul som används i det aktuella protokollet. Det har tidigare rapporterats att unga kvinnliga C57BL/6-möss sprang i genomsnitt 8-10 km/dag på samma plasthjulsinställning33. Därför rekommenderas det starkt att pilottestning utförs för enskilda laboratorieinställningar för att bestämma mössens körprestanda på grund av faktorer som belastning, kön, hjultyp och individuell variation.
Den största fördelen med hjulkörningsmodellen med hög belastningsbeständighet som beskrivs här är att den är mycket mer kostnadseffektiv än andra modeller som kräver dyr specialutrustning. Utrustning för denna löpande hjulinställning kostar en bråkdel av specialiserade löphjulsapparater tillgängliga från kommersiella leverantörer. Slutligen uppfyller laddade hjulkörningsmodeller en annan av de tre "R: erna" för djurforskningsförfining. Eftersom hjulkörning är en helt frivillig stimulans är dessa modeller icke-invasiva och betydligt mindre stressande för möss jämfört med andra hypertrofimodeller, särskilt synergistablation eller andra modeller som kräver dagar eller veckor av operant konditionering. Framtida studier bör bekräfta att HLWR-modellen ger en större hypertrofisk stimulans jämfört med den blandade uthållighets- / motståndsstimulansen i LWR-modellen. Sammanfattningsvis, om den utförs korrekt, är den potentiella tillämpningen av denna nya, progressiva, högbelastningsmotståndshjulkörningsmodell en enkel men billig träningsövning med hög genomströmning och låg stressmotstånd för möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Graduate Student Government Association, Office of Student Research och Department of Health and Exercise Science vid Appalachian State University för att ha tillhandahållit finansiering för att stödja detta projekt. Dessutom vill vi tacka Monique Eckerd och Therin Williams-Frey för att de övervakade den dagliga driften av djurforskningsanläggningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND018-6 | Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading |
| 2.5 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND022 | Used for 2.5 g increments of wheel loading |
| 8-32 x 1" stainless steel screws | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 | |
| 8-32 Wing Nuts | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| 10 µL pipette tip box (empty) | Thermo Scientific | 2140 | We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice |
| Extreme Liquid Glue | Loctite | ||
| Laminin primary antibody | Novus Biologicals | NB300-144AF647 | primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum |
| Lithium 3 V battery | n/a | CR2032 | |
| M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| MyoVision: Automated Image Quantification Platform | Wen et al. (2017) | v1.0 | https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision |
| Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid | Orchid Scientific | Polycarbonate Rat Cage Type II | https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa |
| Sigma Sport 509 Bike Computer | Sigma Sport | Does not need to be this model in particular, but must have distance and time monitoring capabilities | |
| Silent Spinner Running Wheel (mini 11.4 cm) | Kaytee | SKU# 100079369 | https://www.kaytee.com/all-products/small-animal/silent-spinner-wheel |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Goldberg, A. L. Protein synthesis during work-induced growth of skeletal muscle. Journal of Cell Biology. 36 (3), 653-658 (1968).
- Baar, K., Esser, K. Phosphorylation of p70S6k correlates with increased skeletal muscle mass following resistance exercise. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 276 (1), 120-127 (1999).
- Wong, T. S., Booth, F. W. Skeletal muscle enlargement with weight-lifting exercise by rats. Journal of Applied Physiology. 65 (2), 950-954 (1988).
- Hornberger Jr, T. A., Farrar, R. P. Physiological hypertrophy of the FHL muscle following 8 weeks of progressive resistance exercise in the rat. Canadian Journal of Applied Physiology. 29 (1), 16-31 (2004).
- Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
- Tamaki, T., Uchiyama, S., Nakano, S. A weight-lifting exercise model for inducing hypertrophy in the hindlimb muscles of rats. Medicine and Science in Sports and Exercise. 24 (8), 881-886 (1992).
- De Bono, J. P., Adlam, D., Paterson, D. J., Channon, K. M. Novel quantitative phenotypes of exercise training in mouse models. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 290 (4), 926-934 (2006).
- Goh, J., Ladiges, W.
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Daves, M., Vordermark, A., Kleeberger, S. R. Genetic influence on daily wheel running activity level. Physiological Genomics. 19 (3), 270-276 (2004).
- Allen, D. L., et al. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. Journal of Applied Physiology. 90 (5), 1900-1908 (2001).
- Ishihara, A., et al. Effects of running exercise with increasing loads on tibialis anterior muscle fibres in mice. Experimental Physiology. 87 (2), 113-116 (2002).
- Kurosaka, M., et al. Effects of voluntary wheel running on satellite cells in the rat plantaris muscle. Journal of Sports Science and Medicine. 8 (1), 51-57 (2009).
- Lambert, M. I., Noakes, T. D. Spontaneous running increases VO2max and running performance in rats. Journal of Applied Physiology. 68 (1), 400-403 (1990).
- Rodnick, K. J., Reaven, G. M., Haskell, W. L., Sims, C. R., Mondon, C. E. Variations in running activity and enzymatic adaptations in voluntary running rats. Journal of Applied Physiology. 66 (3), 1250-1257 (1989).
- Sexton, W. L. Vascular adaptations in rat hindlimb skeletal muscle after voluntary running-wheel exercise. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 287-296 (1995).
- Dungan, C. M., et al. Elevated myonuclear density during skeletal muscle hypertrophy in response to training is reversed during detraining. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 316 (5), 649-654 (2019).
- Ishihara, A., Roy, R. R., Ohira, Y., Ibata, Y., Edgerton, V. R. Hypertrophy of rat plantaris muscle fibers after voluntary running with increasing loads. Journal of Applied Physiology. 84 (6), 2183-2189 (1998).
- Konhilas, J. P., et al. Loaded wheel running and muscle adaptation in the mouse. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (1), 455-465 (2005).
- Legerlotz, K., Elliott, B., Guillemin, B., Smith, H. K. Voluntary resistance running wheel activity pattern and skeletal muscle growth in rats: Wheel running activity pattern and muscle growth. Experimental Physiology. 93 (6), 754-762 (2008).
- Mobley, C. B., et al. Progressive resistance-loaded voluntary wheel running increases hypertrophy and differentially affects muscle protein synthesis, ribosome biogenesis, and proteolytic markers in rat muscle. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 102 (1), 317-329 (2018).
- D'Hulst, G., Palmer, A. S., Masschelein, E., Bar-Nur, O., De Bock, K. Voluntary resistance running as a model to induce mTOR activation in mouse skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 10, 1271 (2019).
- Soffe, Z., Radley-Crabb, H. G., McMahon, C., Grounds, M. D., Shavlakadze, T. Effects of loaded voluntary wheel exercise on performance and muscle hypertrophy in young and old male C57Bl/6J mice: Exercise and muscle hypertrophy in old mice. Scandinavian Journal of Medicine and Science in Sports. 26 (2), 172-188 (2016).
- White, Z., et al. Voluntary resistance wheel exercise from mid-life prevents sarcopenia and increases markers of mitochondrial function and autophagy in muscles of old male and female C57BL/6J mice. Skeletal Muscle. 6 (1), 45 (2016).
- Murach, K. A., McCarthy, J. J., Peterson, C. A., Dungan, C. M. Making mice mighty: Recent advances in translational models of load-induced muscle hypertrophy. Journal of Applied Physiology. 129 (3), 516-521 (2020).
- Swallow, J. G., Garland, T., Carter, P. A., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. Effects of voluntary activity and genetic selection on aerobic capacity in house mice (Mus domesticus). Journal of Applied Physiology. 84 (1), 69-76 (1998).
- Murach, K. A., et al. Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging. Aging Cell. 21 (1), 13527 (2022).
- Mackay, A. D., Marchant, E. D., Louw, M., Thomson, D. M., Hancock, C. R. Exercise, but not metformin prevents loss of muscle function due to doxorubicin in mice using an in situ method. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9163 (2021).
- Godwin, J. S., Hodgman, C. F., Needle, A. R., Zwetsloot, K. A., Andrew, R. Whole-body heat shock accelerates recovery from impact- induced skeletal muscle damage in mice. Conditioning Medicine. 2 (4), 184-191 (2020).
- Wen, Y., et al. MyoVision: Software for automated high-content analysis of skeletal muscle immunohistochemistry. Journal of Applied Physiology. 124 (1), 40-51 (2018).
- Manzanares, G., Brito-da-Silva, G., Gandra, P. G. Voluntary wheel running: Patterns and physiological effects in mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 52 (1), 7830 (2019).
- Bartling, B., et al. Sex-related differences in the wheel-running activity of mice decline with increasing age. Experimental Gerontology. 87, 139-147 (2017).
- Zwetsloot, K. A., Westerkamp, L. M., Holmes, B. F., Gavin, T. P. AMPK regulates basal skeletal muscle capillarization and VEGF expression, but is not necessary for the angiogenic response to exercise: AMPK and the skeletal muscle angiogenic response to exercise. The Journal of Physiology. 586 (24), 6021-6035 (2008).
