Summary
Bu prosedür, farelerde çevrilebilir bir aşamalı yüklü koşu tekerleği direnç eğitim modelini açıklar. Bu direnç eğitim modelinin birincil avantajı, tamamen gönüllü olması, böylece hayvanlar için stresi ve araştırmacı üzerindeki yükü azaltmasıdır.
Abstract
Daha önce geliştirilen sinerjik ablasyon, elektriksel stimülasyon, ağırlıklı merdiven tırmanma ve en son olarak ağırlıklı kızak çekme dahil olmak üzere kemirgen direncine dayalı egzersiz modelleri, iskelet kası adaptasyonlarını indüklemek için hipertrofik bir uyaran sağlamada oldukça etkilidir. Bu modellerin iskelet kası araştırmaları için paha biçilmez olduğu kanıtlanmış olsa da, ya invaziv ya da istemsiz ve emek yoğundur. Neyse ki, birçok kemirgen suşu bir koşu tekerleğine erişim verildiğinde gönüllü olarak uzun mesafeler koşar. Kemirgenlerdeki yüklü tekerlek çalıştırma (LWR) modelleri, insanlarda artan kas kütlesi ve lif hipertrofisi ve kas protein sentezinin uyarılması gibi direnç eğitimi ile yaygın olarak gözlenen adaptasyonları indükleyebilir. Bununla birlikte, ılımlı tekerlek yükünün eklenmesi ya fareleri uzun mesafelerde koşmaktan caydıramaz, bu da bir dayanıklılık / direnç eğitim modelini daha iyi yansıtır ya da fareler yük uygulama yöntemi nedeniyle neredeyse tamamen çalışmayı bırakır. Bu nedenle, harici direncin uygulandığı ve kademeli olarak arttırıldığı fareler için yeni bir yüksek yüklü tekerlek çalışma modeli (HLWR) geliştirilmiştir ve farelerin daha önce kullanılandan çok daha yüksek yüklerle çalışmaya devam etmelerini sağlamıştır. Bu yeni HLWR modelinden elde edilen ön sonuçlar, 9 haftalık eğitim protokolü boyunca hipertrofik adaptasyonları indüklemek için yeterli uyaran sağladığını göstermektedir. Burada, farelerde bu basit ama ucuz ilerleyici direnç tabanlı egzersiz eğitim modelini yürütmek için özel prosedürler açıklanmaktadır.
Introduction
İskelet kas kütlesi, yetişkin insanlarda vücut kütlesinin yaklaşık% 40'ını oluşturur; Bu nedenle, iskelet kas kütlesinin yaşam boyunca korunması kritik öneme sahiptir. İskelet kas kütlesi, enerji metabolizmasında, çekirdek vücut ısısının korunmasında ve glikoz homeostazında ayrılmaz bir rol oynar1. İskelet kasının korunması, protein sentezi ve protein yıkımı arasında bir dengedir, ancak bu süreçleri yönlendiren karmaşık moleküler mekanizmaların anlaşılmasında hala birçok boşluk vardır. Kas kütlesinin korunmasını ve büyümesini düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için, insan deneklerin araştırma modelleri genellikle direnç egzersizine dayalı müdahaleler kullanır, çünkü mekanik uyaranlar iskelet kas kütlesinin düzenlenmesinde ayrılmaz bir rol oynar. İnsan deneklerin araştırması başarılı olsa da, invaziv prosedürlerle (yani kas biyopsileri) ilgili uyarlamaları ve etik kaygıları sergilemek için gereken süre, elde edilebilecek veri miktarını sınırlar. Direnç egzersizine adaptasyonlar memeli türleri arasında oldukça yaygın olsa da, hayvan modelleri, diyet ve egzersiz rejimini tam olarak kontrol edebilmenin yararını sağlarken, aynı zamanda beyin, karaciğer, kalp ve iskelet kası gibi vücuttaki tüm dokuların toplanmasına izin verir.
Kemirgenlerde kullanılmak üzere birçok direnç eğitim modeli geliştirilmiştir: sinerjik ablasyon2, elektriksel stimülasyon3,4, ağırlıklı merdiven tırmanma5, ağırlıklı kızak çekme6 ve tuvalli çömelme7. Tüm bu modellerin, doğru yapılırsa, hipertrofi gibi iskelet kası adaptasyonlarını indüklemek için etkili modeller olabileceği açıktır. Bununla birlikte, bu modellerin düşüşleri, çoğunlukla istemsiz olmaları, normal kemirgen davranışının bir parçası olmamaları, zaman / emek yoğun ve istilacı olmalarıdır.
Neyse ki, birçok fare ve sıçan suşu, bir koşu tekerleğine erişim verildiğinde gönüllü olarak uzun mesafeler koşar. Dahası, serbest çalışan tekerlek (FWR) egzersiz modelleri, hareketi veya kas aktivitesini zorlamak için kapsamlı koşullandırma, pozitif / negatif takviye veya anesteziye dayanmaz 8,9. Koşu aktivitesi büyük ölçüde fare gerginliğine, cinsiyetine, yaşına ve bireysel bazda bağlıdır. Lightfoot ve ark. 15 farklı fare suşunun koşu aktivitesini karşılaştırdı ve günlük koşu mesafesinin 2.93 km ila 7.93 km arasında değiştiğini, C57BL / 6 farelerin cinsiyet10'dan bağımsız olarak en uzağa koştuğunu buldu. FWR genellikle iskelet ve kalp kaslarında dayanıklılık adaptasyonlarını indüklemek için mükemmel bir model olarak kabul edilir11,12,13,14,15,16; Bununla birlikte, direnç eğitim modellerinde tekerlek koşusunun kullanılması daha az araştırılmaktadır.
Tahmin edilebileceği gibi, tekerlek çalışmasının hipertrofik etkisi, yüklü tekerlek çalıştırma (LWR) olarak adlandırılan koşu tekerleğine direnç eklenerek arttırılabilir, böylece direnç eğitimini daha yakından taklit etmek için tekerlek üzerinde çalışmak için daha fazla çaba sarf edilmesi gerekir. Çeşitli yük uygulama yöntemleri kullanarak, önceki çalışmalar, sıçanları ve fareleri kullanan LWR modelinin, 6-8 hafta içinde ekstremite kas kütlesinde% 5-30'luk bir artış gösterdiğini göstermiştir 17,18,19,20,21. Ayrıca, D'hulst ve ark., tek bir LWR nöbetinin, FWR22'ye kıyasla protein sentezi sinyal yolunun aktivasyonunda% 50 daha fazla artışa yol açtığını göstermiştir. Tekerlek direnci en yaygın olarak sürtünme tabanlı, sabit yükleme yöntemiyle uygulanmıştır, bu sayede tekerlek direnci12,19,23,24'ü uygulamak için manyetik bir fren veya gergi cıvatası kullanılır. Sürtünmeye dayalı, sabit yük yönteminin bir uyarısı, orta ila yüksek direnç uygulandığında, hayvanın tekerleğin hareketini başlatmak için yüksek direncin üstesinden gelememesi ve eğitimi etkili bir şekilde durdurmasıdır. En önemlisi, kemirgen koşu tekerleği modelleri için kullanılan kafes ve tekerlek sistemlerinin birçoğu oldukça maliyetlidir ve özel ekipman gerektirir.
Son zamanlarda, Dungan ve ark., tekerleğin tek bir tarafına yapıştırılmış dış kütleler aracılığıyla tekerleğe asimetrik olarak bir yük uygulayan ilerici ağırlıklı tekerlek çalışan (PoWeR) bir model geliştirdi. PoWeR modelinin dengesiz tekerlek yüklemesi ve değişken direncinin, sürekli çalışma aktivitesini teşvik ettiği ve farelerde çalışan yüklü tekerleğin daha kısa patlamalarını teşvik ettiği, direnç eğitimi17 ile gerçekleştirilen setleri ve tekrarları daha yakından taklit ettiği düşünülmektedir. Ortalama koşu mesafesinin günde 10-12 km olmasına rağmen, PoWeR modeli, plantaris kası ıslak kütlesinde ve lif kesit alanında (CSA) sırasıyla% 16 ve% 17'lik bir artış sağlamıştır. Birçok pratik avantaja rağmen, LWR'nin PoWeR modelinin bazı sınırlamaları vardır. Yazarlar tarafından tanındığı gibi, PoWeR modeli, daha katı bir direnç egzersizine dayalı modelin aksine, harmanlanmış bir dayanıklılık / direnç egzersiz modelini (yani, insanlarda eşzamanlı eğitim) yansıtan, potansiyel olarak bir girişim etkisi yaratan ve daha az belirgin hipertrofiye veya hipertrofinin indüklendiği farklı mekanizmalara katkıda bulunan yüksek hacimli bir "hibrit" uyarandır. 25 . Bir direnç egzersizi eğitim modeli olması amaçlanan şeyde eşzamanlı bir eğitim olgusunun gerçekleşmemesini sağlamak zorunludur. Bu nedenle, PoWeR modeli, bir direnç eğitim modeline daha yakından benzemek için daha önce kullanılandan daha yüksek yükler kullanan bir LWR modeli geliştirmek üzere değiştirildi. Burada, C57BL / 6 farelerde basit ve ucuz bir 9 haftalık progresif direnç eğitimi LWR modeli için ayrıntılar verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Appalachian State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (#22-05) tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvanlar
- C57BL/6 farelerini şirket içi fare kolonisinden temin edin.
NOT: Çalışmanın başlangıcında 5-8 aylık erkek fareler kullanılmıştır. Günlük koşu aktivitesi 26 haftalıkken yaklaşık 9-10 haftalıkken zirveye ulaşır veplatolara ulaşır. Önceki çalışmalar, yaşlı farelerin (22-24 ay) da27 çalışan yüklü tekerlek gerçekleştireceğini göstermiştir. - Fareleri ayrı ayrı tel kapaklı standart bir kemirgen kafesinde barındırın ve kafesi kontrollü bir ortamda tutun (12:12 saat ışık:karanlık döngü ile 20-24 °C).
- Standart kemirgen chow ve su ad libitum sağlayın.
2. Koşu tekerleği aparatı
- Çalışan tekerlek kurulumu:
NOT: Çalışan tekerlekler, 1 g veya 2,5 g yük mıknatısları eklemek dışında, tüm çalışan protokoller için benzer şekilde monte edilir/kurulur.- Tek bir 1 g sensör mıknatısını koşu tekerleğinin dış orta çevresine yapıştırın (Şekil 1).
- Bu tekerleği, tekerleğe alışmanın yalnızca ilk haftası için tek bir 1 g sensör mıknatısıyla kullanın.
- Yüklü tekerlek çalıştırma (LWR; PoWeR17 ile aynı yükleme protokolü): 2.1.4-2.1.6 adımlarını izleyin.
- LWR için 2. hafta 2 g yük gerektirir (bkz. Tablo 1).
- İki adet 1 g mıknatısı tekerleğin dış çevresine yan yana yapıştırın (Şekil 2A).
NOT: Burada, yapıştırıcı sıkıca kuruyana kadar mıknatısları yerinde tutmak için bant kullanmak yararlıdır; aksi takdirde, sensör mıknatısına çekilebilir ve yerinden çıkabilirler. - 3, 4 ve 6. haftalarda, halihazırda mevcut olan mıknatıslardan herhangi birinin üzerine 1 g mıknatıs daha yerleştirerek ek yük uygulayın.
NOT: Mıknatıslar birbirine sıkıca yapıştığı için yapıştırıcı gerekmez. Örneğin, 6. haftada 6 g yük ile, mıknatısların her biri üç yüksekliğinde istiflenecektir (Şekil 2B). - Yüksek yüklü tekerlek çalıştırma (HLWR): 2.1.8-2.1.11 arasındaki adımları izleyin.
NOT: HLWR protokolü üç tekerlek seti gerektirir. Farklı tekerlek setlerinin montajı, araştırmacının tekerlek iyice temizlendikten ve sterilize edildikten sonra diğer fareler için tekerlek kurulumlarını yeniden kullanmasına izin verir (her setin sayısı, araştırmacı tarafından kohort / grup boyutuna göre belirlenmelidir). - İlk tekerlek seti (yalnızca 2. hafta için gereklidir) tek bir 2,5 g mıknatısa sahip olacaktır; Tekerleğin dış çevresine bir adet 2,5 g mıknatıs yapıştırın (Adım 2.1.5'in altındaki Nota bakınız) (Şekil 3A).
- İkinci tekerlek seti (sadece 3. hafta için gereklidir) iki adet 2,5 g mıknatısa sahip olacaktır; tutkal (Adım 2.1.5'in altındaki Not'a bakınız) tekerleğin dış çevresine yan yana iki adet 2,5 g mıknatıs (Şekil 3B).
- Üçüncü tekerlek seti (4. hafta ve sonrası için gereklidir) yan yana üç adet 2,5 g mıknatısa sahip olacaktır; tutkal (Adım 2.1.5'in altındaki Not'a bakınız) tekerleğin dış çevresine yan yana üç adet 2,5 g mıknatıs (Şekil 3C).
- Mevcut mıknatıslardan herhangi birinin üzerine 2,5 g'lık başka bir mıknatıs yerleştirerek 6. ve 8. haftalar için ek yük uygulayın (Şekil 3D, E).
Resim 1: Tekerleğin orta dış çevresine yapıştırılmış tek 1 g sensörlü mıknatıslı temel koşu tekerleği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sensör mıknatıslı yüklü koşu tekerleği (LWR) ve 1 g yükleme mıknatısları. (A) 2 g yük örneği, tekerleğin dış kenarına yan yana yapıştırılmış iki adet 1 g mıknatıs; (B) 6 g yük örneği, tekerleğin dış kenarına yan yana yapıştırılmış iki adet 1 g mıknatıs ve ilave 4 g yük uygulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Sensör mıknatıslı yüksek yüklü koşu tekerleği (HLWR) ve 2,5 g yükleme mıknatısları. (A) 2,5 g yük örneği, tekerleğin dış kenarına yapıştırılmış bir adet 2,5 g mıknatıs; (B) 5 g yük örneği, tekerleğin dış kenarına yan yana yapıştırılmış iki adet 2,5 g mıknatıs; (C) 7,5 g yük örneği, tekerleğin dış kenarına yan yana yapıştırılmış üç adet 2,5 g mıknatıs; (D) 10 g yük örneği, tekerleğin dış kenarına yan yana yapıştırılmış üç adet 2,5 g mıknatıs, ilave 2,5 g yük uygulanarak; (E) 12,5 g yük örneği, tekerleğin dış kenarına yan yana yapıştırılmış üç adet 2,5 g mıknatıs, ilave 5 g yük uygulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Kafes montajı
- Egzersiz süresini (h) ve kat edilen mesafeyi (km) izlemek için dijital bisiklet bilgisayarıyla donatılmış bir kafes kullanarak koşu tekerleklerini monte edin. Ortalama hız (km/s) aritmetik olarak türetilir.
- Montajdan önce bisiklet bilgisayarına yeni bir pil takıldığından emin olun.
- İlk bisiklet bilgisayar programlaması sırasında tekerlek boyutunu ayarlayın (üreticinin talimatlarına bakın); Koşu tekerleğinin dış çevresini ölçerek devir başına mesafeyi hesaplayın (örneğin, burada kullanılan tekerlek tipi için 3.580 mm).
- Bisiklet bilgisayar sensörünü, kafes kapağının dış tarafında, tekerleğin sensör mıknatısının bulunduğu yerin hemen üzerinde sağlam bir yüzeye yerleştirin. Farelerin bileşenleri çiğnemesini önlemek için tüm bilgisayar ve sensör bileşenlerinin kafesin dışındaki katı bir bariyer içinde bulunduğundan emin olun.
- Manyetik bisiklet sensörünün oturması için küçük bir dikdörtgen kesilmiş boş bir pipet ucu kutusunun kapağını ve bisiklet bilgisayarını ve kablosunu tutmak için kutunun ana kısmını (uç rafı ızgarası çıkarılmış) kullanın (Şekil 4A).
- Manyetik bisiklet sensörünü ve koşu tekerleği standını kafesin dışına sabitlemek için katı yüzeyin köşelerinden iki delik açın (Şekil 4A).
- Çalışan dingil tabanını baş aşağı, kafes kapağındaki boşluklardan ancak adım 3.2'de açıklanan katı yüzeyin üzerine yerleştirin (Şekil 4B).
- Dingil mesafesini ve bilgisayar sensörünü donanımla kafesin üst kısmına sabitleyin (Şekil 4C, D).
- Tekerlek hareketinin düzgün bir şekilde kaydedilmesini sağlamak için sensör mıknatısının ve bilgisayar sensörünün en fazla 1 cm aralıklarla yerleştirildiğinden emin olun (çoğu standart bisiklet bilgisayar sensörü çift yönlüdür ve her iki dönüş yönünde de pozitif tekerlek hareketini kaydeder).
- Uygun koşu tekerleğini (yukarıda açıklandığı gibi) kafes kapağının içinden dingil mesafesine takın ve kapağı kafesin üzerine güvenli bir şekilde yerleştirin (Şekil 4E, F).
- Tekerlek kafes kapağından asılıyken, kafes tabanından en az 2,5 cm boşluk bırakın. Tekerleğin serbestçe dönmesini, ancak yatak takımlarının birikmesiyle engellenmemesini sağlamak için kafese minimum miktarda yatak malzemesi yerleştirin.
- Deneme sırasında, doğru etkinlik izlemeyi sağlamak için bisiklet bilgisayarından gelen verileri tutarlı bir aralık çizelgesinde kaydedin.
- Farelerin gece bir tür olduğunu kabul edin; Bu nedenle, doğal kafes aktivitelerinin çoğu (tekerlek koşusu dahil) ışık döngüsünün karanlık saatlerinde gerçekleştirilecektir.
Resim 4: Çalışan tekerlek kafesi tertibatı. (A) Katı yüzeye/tepsiye yerleştirilmiş bisiklet bilgisayarı ve manyetik sensör; (B) katı yüzeyin/tepsinin ve sensörün üzerine yerleştirilmiş ters çevrilmiş dingil mesafesi (üstten görünüm; tabanın donanımla kafes kapağına sabitlenmesi için sensör yüzeyindeki/tepsisindeki iki deliğe dikkat edin), (C) donanım monte edilmiş ters dingil mesafesi (alttan görünüm); (D) donanım montajlı ters dingil mesafesi (üstten görünüm); (E) tam kafes tertibatı (üstten görünüm); ve (F) tam kafes tertibatı (yandan görünüm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Egzersiz eğitimi yükleme protokolleri
- Herhangi bir çalışmayı önlemek için kilitli bir koşu tekerleği içeren bir kafeste 9 hafta boyunca sedanter (SED) fareleri ayrı ayrı barındırın.
NOT: Tablo 1, deneysel tasarımda kullanılan LWR (PoWeR) ve HLWR protokollerinin yükleme programını sağlar. - Farelerin 9 haftalık protokolün tamamı boyunca egzersiz yapmaya devam etmesini sağlamak için gerekirse LWR ve HLWR gruplarının yükünü azaltın.
| Hafta | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | ||
| LWR (n = 4) | Yük (g) | 0.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 5.0 | 6.0 | 6.0 | 6.0 |
| %BM | -- | 8% | 11% | 15% | 19% | 19% | 23% | 23% | 23% | |
| HLWR (n = 7) | Yük (g) | 0.0 | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 7.5 | 10.0 | 10.0 | 12.5 | 12.5 |
| %BM | -- | 10% | 19% | 28% | 28% | 38% | 38% | 48% | 48% | |
Tablo 1. Yüklü tekerlek çalıştırma protokolleri
5. In situ kas fonksiyon testi, doku hasadı ve doku analizi
- 9 haftalık eğitim müdahalesini takiben, ek oksijen ile inhale izofluran (% 4 indüksiyon; % 2 bakım) kullanarak fareleri anestezi altına alın ve prosedür boyunca uygun anestezik düzlem izlemesini sağlayın.
- İzometrik kas gücünü test etmek için gastroknemius, plantaris, soleus (GPS) kompleksi üzerinde in situ kas fonksiyon testi yapın28. Siyatik siniri 1-300 Hz arasında 11 yükselen frekansta 27 G elektrot iğnesi ile doğrudan uyararak bir kuvvet-frekans eğrisi oluşturun, tetanik kasılmalar 100-150 hz29 civarında meydana gelir.
- Kas fonksiyon testinden hemen sonra, fareleri servikal çıkık yoluyla ötenazi yapın ve kalbi çıkararak ötenaziyi onaylayın. Plantaris ve soleus kaslarını dikkatlice tüketin ve ıslak doku kütlesini kaydedin.
- Her kas örneğini bir gömme ortamında (OCT) kaplayın ve bir mantar üzerine monte edin. Sıvı azot soğutmalı isopentan içinde dondurun ve kas dokusunun bölümlerinde (10 μm kalınlığında) daha fazla immünohistokimyasal (IHC) analiz yapılana kadar -80 ° C'de saklayın.
- Laminin için immünofloresan kullanarak kas lifi CSA'yı analiz edin. Otomatik görüntü ölçme platformu 30 kullanarak fiber CSA'yıölçün.
6. İstatistiksel analiz
- Tüm verileri ortalama ± SD olarak ifade edin.
- Anlamlılığı p ≤ 0,05 olarak ayarlanmış istatistiksel analiz yazılımı kullanarak istatistiksel analizler yapın.
- Tekerlek çalıştırma ve antrenman hacmi verilerini, tekrarlanan iki yönlü ANOVA ölçümleriyle karşılaştırın.
- Vücut kütlesini, doku kütlesini, CSA'yı ve kas fonksiyonunu tek yönlü bir ANOVA ile karşılaştırın. Önemli F-oranları bulunursa, Fisher LSD post hoc analizlerini kullanarak grup içi farklılıkları karşılaştırın.
- Efekt boyutlarını hesaplayın, ardından bunları küçük, orta ve büyük efekt boyutları için sırasıyla 0,01, 0,06 ve 0,14 olarak yorumlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, 24 C57BL / 6 fare (bu çalışmanın başlangıcında 6.3 ± 0.7 ay) rastgele üç tedavi grubundan birine atandı: sedanter (SED), yüklü tekerlek çalıştırma (LWR; Dungan ve ark.17 tarafından tanımlanan PoWeR ile aynı) veya yüksek LWR (HLWR) ve daha sonra ilgili 9 haftalık protokollerini tamamladılar. Alışma haftasından sonra (1. hafta), koşu mesafesi veya antrenman hacminde grup veya grup x zaman farkı yoktu (Şekil 5).
Şekil 5: LWR (yeşil dolgulu kareler) ve HLWR (kırmızı dolgulu üçgenler) grupları için koşu tekerleği özellikleri. (A) Ortalama günlük koşu mesafesi (km); (B) Günlük koşu mesafesi (km/gün) olarak ifade edilen ortalama antrenman hacmi (km/gün∙g), günlük tekerlek yükü (g cinsinden) ile çarpılır. Veriler grup ortalaması ± olarak ifade edilir. SD. LWR, n = 4; HLWR, n = 7. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Normalize soleus kitlesi HLWR grubunda SED grubuna göre %21.4 daha büyüktü (p < 0.001), ancak lif CSA'da fark yoktu (p = 0.536) (Şekil 6A). Plantaris kas kütlesi ve ortalama lif CSA'sı istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermese de (sırasıyla p = 0.573 ve p = 0.111), SED ve LWR'ye kıyasla HLWR plantarisinde daha büyük bir CSA'ya sahip liflerin oranında bir kayma olduğu görülmektedir (Şekil 6B). Gruplar arasında GPS kompleksinin seğirme veya tepe kuvvetinde, in situ kas fonksiyon testi ile ölçülen anlamlı bir fark yoktu (Tablo 2).
Şekil 6: Fiber kesit alanı oranları . (A) Soleus ve (B) plantaris kas lifi oranları (%) SED (siyah dolgulu daireler), LWR (yeşil dolgulu kareler) ve HLWR (kırmızı dolgulu üçgenler) grupları (n = 3-4/grup) için kesit alanına göre. Soleus kası tüm gruplarda benzer lif CSA oranları içerir. HLWR grubunun plantaris kası, SED ve LWR gruplarına kıyasla daha büyük CSA'lı liflerin daha yüksek bir oranına sahip gibi görünmektedir. Veriler, her fiber boyutu kategorisi için grup ortalaması olarak ifade edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Grup | |||||
| SED | cesaret | cesaret | P-değeri | Efekt Boyutu (ƞ2) | |
| Antrenman öncesi vücut kütlesi (g) | 26,35 ± 2,12 | 28,07 ± 3,42 | 25,71 ± 2,22 | 0.299 | 0.324 |
| Antrenman sonrası vücut kütlesi (g) | 26,82 ± 1,96 | 28,91 ± 2,80 | 27,43 ± 2,07 | 0.251 | 0.341 |
| Soleus kütlesi (mg/g BM) | 0.28 ± 0.03 | 0.31 ± 0.02 | 0.34 ± 0.03# | 0.003 | 0.611 |
| Plantaris kütlesi (mg/g BM) | 0.61 ± 0.06 | 0.64 ± 0.03 | 0.63 ± 0.06 | 0.573 | 0.239 |
| Soleus CSA (μm²) | 2042 ± 320 | 1964 ± 357 | 1800 ± 206 | 0.536 | 0.130 |
| Plantaris CSA (μm²) | 2032 ± 159 | 2483 ± 579 | 2754 ± 109 | 0.111 | 0.519 |
| Twitch kuvveti (N/g GPS) | 2,96 ± 0,47 | 3,19 ± 0,58 | 3,42 ± 0,78 | 0.254 | 0.340 |
| Maksimum tetanik kuvvet (N/g GPS) | 11,43 ± 1,77 | 13,04 ± 2,87 | 13,13 ± 1,70 | 0.136 | 0.395 |
| # - SED'den önemli ölçüde farklı olduğunu gösterir; Efekt Boyutu (ƞ2): küçük = 0,01; orta = 0,06; büyük = 0,140 | |||||
Tablo 2. Hayvan özellikleri, doku kütlesi, kas kuvveti ve lif kesit alanı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemirgenlerdeki mevcut direnç egzersiz modellerinin iskelet kası araştırmaları için paha biçilmez olduğu kanıtlanmıştır; Bununla birlikte, bu modellerin çoğu istilacı, istemsiz ve / veya zaman ve emek yoğundur. LWR, sadece diğer iyi kabul görmüş direnç egzersizi eğitim modellerinde gözlemlenenlerle benzer kas adaptasyonlarını indüklemekle kalmayıp, aynı zamanda araştırmacı tarafından minimum zaman / emek taahhüdü ile hayvan için kronik, düşük stresli bir egzersiz uyarıcısı sağlayan mükemmel bir modeldir. Ek olarak, LWR modelleri araştırmacıdan minimum doğrudan müdahale gerektirdiğinden, tüm fare kohortları kısa veya uzun vadeli müdahale çalışmaları için aynı anda kolayca egzersiz eğitimi alabilir. Bununla birlikte, ılımlı tekerlek yükünün uygulanması, fareleri büyük mesafelerde koşmaktan caydıramaz (çok az direnç) veya fareler, yük uygulama yöntemi (çok fazla direnç) nedeniyle neredeyse tamamen çalışmayı durdurur. Dungan ve ark. (2019)17 tarafından geliştirilen ilerici ağırlıklı tekerlek çalıştırma (PoWeR) LWR modeli, lif hipertrofisi gibi önemli kas adaptasyonları sağlar, ancak aynı zamanda daha oksidatif bir fenotipe geçişi de teşvik eder. PoWeR'nin gerçekten "direnç tabanlı" bir model olarak sınırlandırılması, hem direnç hem de dayanıklılık uyaranlarının bir kombinasyonunu sağlayan hibrit bir eğitim rejimini daha fazla yansıtan daha yüksek hacimli (mesafe) ve daha düşük yüklü (direnç) bir uyaranı ortaya çıkarmasıdır. Bu nedenle, PoWeR modelini, harici yükün uygulandığı ve kademeli olarak arttırıldığı direnç eğilimli bir uyaranın daha fazlasını sağlamak için modifiye eden fareler için yeni bir yüksek yüklü tekerlek çalıştırma (HLWR) modeli geliştirilmiştir, bu da farelerin çalışmaya devam etmesini sağlar, ancak daha önce kullanılandan çok daha yüksek yüklerde. Modelimiz, PoWeR modeliyle aynı dengesiz tekerlek yükleme konseptini kullandı, ancak daha basit ve daha ucuz bir sistemle. Farelerin "normal" sporadik (açık ve kapalı) çalışan tekerlek davranışına ek olarak, dengesiz tekerlek yüklemesi, farelerin kesintiye uğramış "mahmuzlarda" çalışmasına neden olur. Bunun nedeni, farenin devrimin ilk yarısında yükü tekerleğin tepesine (karşıt yerçekimi) çekmesi, yalnızca devrimin ikinci yarısında yük yerçekimi ile tabana doğru düştüğü için "kıyı" veya "serbest tekerlek" e çekmesi gerektiğidir.
9 haftalık eğitimden sonra, HLWR farelerinin soleus kası, kas kütlesinde% 21.4'lük bir artış gösterdi, ancak lif CSA'sında bir fark yoktu. HLWR farelerinin plantaris kası kas kütlesinde anlamlı bir artış göstermezken, daha büyük CSA'lı liflerin oranının arttığı görülmüştür. Konhilas ve ark. ve Soffe ve ark. düşük direnç ve yüksek dirençli tekerlek koşusu arasında kas büyümesinde hiçbir fark gözlemlemediler19,23; Bununla birlikte, mevcut çalışmada, soleus kütlesi LWR ve HLWR gruplarında sırasıyla ~% 10 ve ~% 20 oranında artmıştır. Yeni HLWR direnç eğitim modeline yanıt olarak kas hipertrofisinin kas ve lif tipine özgü olması muhtemel görünmektedir; ancak, bu kavramı doğrulamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. In situ kas fonksiyon testi, 9 haftalık protokolün sonunda, ötenazi ve doku toplamadan hemen önce, farenin sağ ekstremitesinde tek bir akut seans olarak gerçekleştirildi. Burada bildirilen kas kütlesi (vücut kütlesine normalize edilmiş ıslak kütle) sadece farenin sol ekstremitesinden gelir, çünkü cerrahi prosedürden sağ ekstremite kaslarındaki ıslak kütleyi değiştirebilecek önemli şişlik / ödem vardır.
Bu yeni HLWR modelinin önemi, farelerin tekerleğe uygulanan nispeten yüksek yüklerle çalışmaya devam edeceğini göstermesidir. C57BL/6 farelerin ortalama vücut kütlesi (% BM) ile ilgili tekerlek yükü, bu projede kullanılan farelerin ortalama vücut kütlesine (~ 26 g) dayanmaktadır. Ortalama fare vücut kütlesi gerginliğe, yaşa ve cinsiyete bağlı olarak değişecektir. HLWR modelinde 10-12.5 g'lık en yüksek yükler (farenin vücut kütlesinin ~% 40 -% 50'sine eşdeğer), PoWeR modelinden (maksimum = 6 g) veya tekerlek direncinin yaklaşık iki katından oldukça yüksektir. İstatistiksel olarak anlamlı olmasa da, tekerlek yükü HLWR modelinin 6. haftasında ve sonrasında 7,5 g'ı geçtiği için koşu mesafesinde keskin bir düşüş olduğu görülürken, LWR 9 haftalık protokolün geri kalanında sabit bir ortalama çalışma mesafesini korudu. HLWR modelinde yüksek tekerlek yüklerinin çalışma mesafesini önemli ölçüde zayıflatmaması, bu bulguların bir sınırlamasıdır; Bununla birlikte, gruplar içinde koşu performansında çok yüksek değişkenlik olduğu için bu durum daha büyük kohort boyutlarıyla hafifletilebilir.
Bir farenin, tekerlek çalışmasına alıştıktan sonraki ilk hafta içinde tutarlı bir şekilde koşma eğilimini değerlendirmek zor olabilir. Bazı fareler kas adaptasyonlarını indükleyecek kadar çalışmayacağından, herhangi bir farenin tekerlek koşu gruplarına sürekli dahil edilmesi için minimum eşik kesiminin uygulanması önerilir. Minimum eşik kesme, alışmanın ilk haftasında en az 1 km / gün ortalama koşu mesafesi olmalıdır. Bir fare ilk hafta boyunca ortalama olarak en az 1 km / gün koşmazsa, uyarlamaların gerçekleşmesi için önemli bir uyaran sağlamak için farenin 9 haftalık protokolün geri kalanında çalışma mesafesini önemli ölçüde artırması olası değildir. Bu durumda, belirli bir fare ilk alışma haftasından sonra minimum 1 km/gün eşiğini karşılamıyorsa, tekerleği kilitleyin ve bu fareyi yerleşik gruba yeniden atayın. Bu minimum eşik kesiminin uygulanması, koşu istatistiklerindeki değişkenliği azaltacak ve farelerin 9 haftalık protokol boyunca yeterli bir eğitim uyarıcısı elde etmelerini sağlayacaktır. Bu, hayvan araştırmasının üç "R" sinin ruhuna, özellikle de indirgemeye. İkincisi, yüksek tekerlek yükleri uygulandığında bir fare belirli bir mesafeyi çalıştıramazsa yerleşik bir acil durum planına sahip olmak önemlidir. Farelerin 9 haftalık protokolün tamamı boyunca egzersiz yapmaya devam etmesini sağlamak için, koşu mesafesi art arda 3 gün boyunca 0,25 km / gün'ün altına düşerse, yük bir önceki haftaya düşürülmelidir. Bu durumda, herhangi bir fare, yük ekledikten sonra art arda 3 gün boyunca ortalama en az 0,25 km koşmazsa, farenin 9 haftalık protokolün geri kalanında eğitime devam etmesini sağlamak için tekerlek yükünü önceki yüke geri döndürmek gerekebilir. Bu çalışmada, çoğu farenin, HLWR protokolündeki en yüksek yüklerle (12.5 g) bile, 0.25 km / gün'> koşu mesafelerine devam edebildiği gözlenmiştir (Şekil 5A). Bununla birlikte, bu acil durum planı, HLWR grubundaki yedi fareden üçü için uygulandı, bu sayede yükün 9 haftalık eğitim protokolü sırasında bir noktada 10 g veya 7.5 g'a düşürülmesi gerekiyordu. Bir farenin protokolün çoğunluğu için başarılı bir şekilde çalıştırılması talihsiz olurdu, çünkü çok yüksek tekerlek yüklerinde bir sonraki aşamaya ulaşamadı. Çalışmaya devam etmeyi sağlamak için yükü biraz azaltmak, refahtan ödün vermeden bireysel bir hayvanın kullanımını en üst düzeye çıkarır. Son olarak, farelerin artan fiziksel aktiviteyi telafi etmek için yeterli miktarda yiyecek tükettiğinden emin olmak için günlük (veya en azından haftalık) gıda tüketimini izlemek de önemlidir. Fareler ayrı ayrı barındırıldığında bu nispeten basittir. Sedanter farelere kıyasla gıda alımında ~% 20'lik bir artış bekleyin31.
Bu sonuçları (örneğin, koşu mesafeleri) PoWeR modeli için orijinal olarak yayınlananlarla doğrudan karşılaştırmak zordur. Dungan ve ark. günde ~ 10-12 km koşu mesafeleri17 bildirirken, LWR protokolünü gerçekleştiren mevcut protokoldeki fareler günde ~ 5-6 km koştu. Keskin tutarsızlık, Dungan ve ark. tarafından kullanılan dişi farelere kıyasla, mevcut protokolde kullanılan erkek farelere atfedilebilir, çünkü dişi farelerin ~% 20 -% 40 daha uzağa koştuğu gözlenmiştir.10,32. Ayrıca, Dungan ve ark. metal çubuk çalışma yüzeyine sahip metal tekerlekler kullandılar, bu da mevcut protokolde kullanılan plastik koşu tekerleklerine kıyasla daha iyi çalışma performansına yol açabilir. Daha önce genç dişi C57BL/6 farelerin aynı plastik koşu tekerleği kurulumu33 ile günde ortalama 8-10 km koştuğu bildirilmişti. Bu nedenle, gerinim, cinsiyet, tekerlek tipi ve bireysel varyasyon gibi faktörler nedeniyle farelerin çalışma performansını belirlemek için bireysel laboratuvar ortamlarında pilot testlerin yapılması şiddetle tavsiye edilir.
Burada açıklanan yüksek yük direncine sahip tekerlek çalışma modelinin temel avantajı, pahalı özel ekipman gerektiren diğer modellerden çok daha uygun maliyetli olmasıdır. Bu koşu tekerleği kurulumu için ekipman, ticari satıcılardan temin edilebilen özel koşu tekerleği aparatlarının bir kısmına mal olur. Son olarak, yüklü tekerlek çalıştırma modelleri, hayvan araştırması-arıtmanın üç "R" sinden birini daha yerine getiriyor. Tekerlek çalışması tamamen gönüllü bir uyaran olduğundan, bu modeller invaziv değildir ve fareler için diğer hipertrofi modellerine, özellikle sinerjik ablasyona veya günlerce veya haftalarca süren operasyonel koşullandırma gerektiren diğer modellere kıyasla önemli ölçüde daha az streslidir. Gelecekteki çalışmalar, HLWR modelinin, LWR modelinin harmanlanmış dayanıklılık / direnç uyaranına kıyasla daha büyük bir hipertrofik uyaran sağladığını doğrulamalıdır. Sonuç olarak, doğru bir şekilde gerçekleştirilirse, bu yeni, progresif, yüksek yüke dayanıklı tekerlek çalıştırma modelinin potansiyel uygulaması, fareler için basit ama ucuz, yüksek verimli ve düşük gerilimli direnç egzersiz müdahalesidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu projeyi desteklemek için finansman sağladıkları için Lisansüstü Öğrenci Hükümeti Derneği, Öğrenci Araştırma Ofisi ve Appalachian Eyalet Üniversitesi Sağlık ve Egzersiz Bilimi Bölümü'ne teşekkür ederiz. Ek olarak, hayvan araştırma tesisinin günlük operasyonlarını denetledikleri için Monique Eckerd ve Therin Williams-Frey'e teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND018-6 | Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading |
| 2.5 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND022 | Used for 2.5 g increments of wheel loading |
| 8-32 x 1" stainless steel screws | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 | |
| 8-32 Wing Nuts | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| 10 µL pipette tip box (empty) | Thermo Scientific | 2140 | We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice |
| Extreme Liquid Glue | Loctite | ||
| Laminin primary antibody | Novus Biologicals | NB300-144AF647 | primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum |
| Lithium 3 V battery | n/a | CR2032 | |
| M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| MyoVision: Automated Image Quantification Platform | Wen et al. (2017) | v1.0 | https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision |
| Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid | Orchid Scientific | Polycarbonate Rat Cage Type II | https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa |
| Sigma Sport 509 Bike Computer | Sigma Sport | Does not need to be this model in particular, but must have distance and time monitoring capabilities | |
| Silent Spinner Running Wheel (mini 11.4 cm) | Kaytee | SKU# 100079369 | https://www.kaytee.com/all-products/small-animal/silent-spinner-wheel |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Goldberg, A. L. Protein synthesis during work-induced growth of skeletal muscle. Journal of Cell Biology. 36 (3), 653-658 (1968).
- Baar, K., Esser, K. Phosphorylation of p70S6k correlates with increased skeletal muscle mass following resistance exercise. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 276 (1), 120-127 (1999).
- Wong, T. S., Booth, F. W. Skeletal muscle enlargement with weight-lifting exercise by rats. Journal of Applied Physiology. 65 (2), 950-954 (1988).
- Hornberger Jr, T. A., Farrar, R. P. Physiological hypertrophy of the FHL muscle following 8 weeks of progressive resistance exercise in the rat. Canadian Journal of Applied Physiology. 29 (1), 16-31 (2004).
- Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
- Tamaki, T., Uchiyama, S., Nakano, S. A weight-lifting exercise model for inducing hypertrophy in the hindlimb muscles of rats. Medicine and Science in Sports and Exercise. 24 (8), 881-886 (1992).
- De Bono, J. P., Adlam, D., Paterson, D. J., Channon, K. M. Novel quantitative phenotypes of exercise training in mouse models. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 290 (4), 926-934 (2006).
- Goh, J., Ladiges, W.
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Daves, M., Vordermark, A., Kleeberger, S. R. Genetic influence on daily wheel running activity level. Physiological Genomics. 19 (3), 270-276 (2004).
- Allen, D. L., et al. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. Journal of Applied Physiology. 90 (5), 1900-1908 (2001).
- Ishihara, A., et al. Effects of running exercise with increasing loads on tibialis anterior muscle fibres in mice. Experimental Physiology. 87 (2), 113-116 (2002).
- Kurosaka, M., et al. Effects of voluntary wheel running on satellite cells in the rat plantaris muscle. Journal of Sports Science and Medicine. 8 (1), 51-57 (2009).
- Lambert, M. I., Noakes, T. D. Spontaneous running increases VO2max and running performance in rats. Journal of Applied Physiology. 68 (1), 400-403 (1990).
- Rodnick, K. J., Reaven, G. M., Haskell, W. L., Sims, C. R., Mondon, C. E. Variations in running activity and enzymatic adaptations in voluntary running rats. Journal of Applied Physiology. 66 (3), 1250-1257 (1989).
- Sexton, W. L. Vascular adaptations in rat hindlimb skeletal muscle after voluntary running-wheel exercise. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 287-296 (1995).
- Dungan, C. M., et al. Elevated myonuclear density during skeletal muscle hypertrophy in response to training is reversed during detraining. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 316 (5), 649-654 (2019).
- Ishihara, A., Roy, R. R., Ohira, Y., Ibata, Y., Edgerton, V. R. Hypertrophy of rat plantaris muscle fibers after voluntary running with increasing loads. Journal of Applied Physiology. 84 (6), 2183-2189 (1998).
- Konhilas, J. P., et al. Loaded wheel running and muscle adaptation in the mouse. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (1), 455-465 (2005).
- Legerlotz, K., Elliott, B., Guillemin, B., Smith, H. K. Voluntary resistance running wheel activity pattern and skeletal muscle growth in rats: Wheel running activity pattern and muscle growth. Experimental Physiology. 93 (6), 754-762 (2008).
- Mobley, C. B., et al. Progressive resistance-loaded voluntary wheel running increases hypertrophy and differentially affects muscle protein synthesis, ribosome biogenesis, and proteolytic markers in rat muscle. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 102 (1), 317-329 (2018).
- D'Hulst, G., Palmer, A. S., Masschelein, E., Bar-Nur, O., De Bock, K. Voluntary resistance running as a model to induce mTOR activation in mouse skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 10, 1271 (2019).
- Soffe, Z., Radley-Crabb, H. G., McMahon, C., Grounds, M. D., Shavlakadze, T. Effects of loaded voluntary wheel exercise on performance and muscle hypertrophy in young and old male C57Bl/6J mice: Exercise and muscle hypertrophy in old mice. Scandinavian Journal of Medicine and Science in Sports. 26 (2), 172-188 (2016).
- White, Z., et al. Voluntary resistance wheel exercise from mid-life prevents sarcopenia and increases markers of mitochondrial function and autophagy in muscles of old male and female C57BL/6J mice. Skeletal Muscle. 6 (1), 45 (2016).
- Murach, K. A., McCarthy, J. J., Peterson, C. A., Dungan, C. M. Making mice mighty: Recent advances in translational models of load-induced muscle hypertrophy. Journal of Applied Physiology. 129 (3), 516-521 (2020).
- Swallow, J. G., Garland, T., Carter, P. A., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. Effects of voluntary activity and genetic selection on aerobic capacity in house mice (Mus domesticus). Journal of Applied Physiology. 84 (1), 69-76 (1998).
- Murach, K. A., et al. Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging. Aging Cell. 21 (1), 13527 (2022).
- Mackay, A. D., Marchant, E. D., Louw, M., Thomson, D. M., Hancock, C. R. Exercise, but not metformin prevents loss of muscle function due to doxorubicin in mice using an in situ method. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9163 (2021).
- Godwin, J. S., Hodgman, C. F., Needle, A. R., Zwetsloot, K. A., Andrew, R. Whole-body heat shock accelerates recovery from impact- induced skeletal muscle damage in mice. Conditioning Medicine. 2 (4), 184-191 (2020).
- Wen, Y., et al. MyoVision: Software for automated high-content analysis of skeletal muscle immunohistochemistry. Journal of Applied Physiology. 124 (1), 40-51 (2018).
- Manzanares, G., Brito-da-Silva, G., Gandra, P. G. Voluntary wheel running: Patterns and physiological effects in mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 52 (1), 7830 (2019).
- Bartling, B., et al. Sex-related differences in the wheel-running activity of mice decline with increasing age. Experimental Gerontology. 87, 139-147 (2017).
- Zwetsloot, K. A., Westerkamp, L. M., Holmes, B. F., Gavin, T. P. AMPK regulates basal skeletal muscle capillarization and VEGF expression, but is not necessary for the angiogenic response to exercise: AMPK and the skeletal muscle angiogenic response to exercise. The Journal of Physiology. 586 (24), 6021-6035 (2008).
