Summary
Эта процедура описывает переводимую модель тренировки сопротивления бегового колеса с прогрессивной нагрузкой на мышах. Основным преимуществом этой модели тренировок с отягощениями является то, что она полностью добровольная, что снижает стресс для животных и нагрузку на исследователя.
Abstract
Ранее разработанные модели упражнений, основанные на сопротивлении грызунов, включая синергетическую абляцию, электрическую стимуляцию, подъем по лестнице с весом и совсем недавно вытягивание саней с утяжеленным весом, очень эффективны в обеспечении гипертрофического стимула для индуцирования адаптации скелетных мышц. Хотя эти модели оказались бесценными для исследований скелетных мышц, они являются либо инвазивными, либо непроизвольными и трудоемкими. К счастью, многие штаммы грызунов добровольно бегут на большие расстояния, когда им предоставляется доступ к беговому колесу. Модели нагруженного колесного бега (LWR) у грызунов способны вызывать адаптации, обычно наблюдаемые при тренировках с отягощениями у людей, такие как увеличение мышечной массы и гипертрофия волокон, а также стимуляция синтеза мышечного белка. Тем не менее, добавление умеренной нагрузки на колеса либо не может удержать мышей от бега на большие расстояния, что больше отражает модель тренировки выносливости / сопротивления, либо мыши прекращают бег почти полностью из-за метода применения нагрузки. Поэтому для мышей, где применяется внешнее сопротивление и постепенно увеличивается, была разработана новая модель работы с высоконагруженным колесом (HLWR), позволяющая мышам продолжать работать с гораздо более высокими нагрузками, чем ранее. Предварительные результаты этой новой модели HLWR показывают, что она обеспечивает достаточный стимул для индуцирования гипертрофических адаптаций в течение 9-недельного протокола обучения. Здесь описываются конкретные процедуры для выполнения этой простой, но недорогой прогрессивной модели тренировок на основе сопротивления на мышах.
Introduction
Масса скелетных мышц составляет примерно 40% массы тела у взрослых людей; таким образом, поддержание массы скелетных мышц на протяжении всей жизни имеет решающее значение. Скелетная мышечная масса играет неотъемлемую роль в энергетическом обмене, поддержании температуры тела и глюкозного гомеостаза1. Поддержание скелетных мышц представляет собой баланс между синтезом белка и деградацией белка, но все еще существует много пробелов в понимании сложных молекулярных механизмов, которые управляют этими процессами. Для изучения молекулярных механизмов, регулирующих поддержание и рост мышечной массы, исследовательские модели людей часто используют вмешательства на основе упражнений с отягощениями, поскольку механические стимулы играют неотъемлемую роль в регуляции массы скелетных мышц. В то время как исследования на людях были успешными, время, необходимое для проявления адаптации и этических проблем в отношении инвазивных процедур (т. Е. Биопсия мышц), ограничивает количество данных, которые могут быть получены. В то время как адаптация к упражнениям с отягощениями довольно распространена среди видов млекопитающих, животные модели обеспечивают преимущество в том, что они могут точно контролировать диету и режим упражнений, а также позволяют собирать целые ткани по всему телу, такие как мозг, печень, сердце и скелетные мышцы.
Многие модели тренировок с отягощениями были разработаны для использования у грызунов: синергетическая абляция2, электрическая стимуляция 3,4, утяжеленное подъем по лестнице5, утяжеленное тяги саней6 и приседание с холстом7. Очевидно, что все эти модели, если все эти модели сделаны правильно, могут быть эффективными моделями для индуцирования адаптации скелетных мышц, такой как гипертрофия. Однако недостатки этих моделей заключаются в том, что они в основном непроизвольные, не являются частью нормального поведения грызунов, трудоемкими и инвазивными.
К счастью, многие штаммы мышей и крыс добровольно бегут на большие расстояния, когда им предоставляется доступ к беговому колесу. Кроме того, модели упражнений со свободным колесом (FWR) не полагаются на обширное кондиционирование, положительное / отрицательное подкрепление или анестезию для принудительного движения или мышечной активности 8,9. Беговая деятельность сильно зависит от напряжения мыши, пола, возраста и индивидуальной основы. Lightfoot et al. сравнили беговую активность 15 различных штаммов мышей и обнаружили, что ежедневная дистанция бега колеблется от 2,93 км до 7,93 км, причем мыши C57BL / 6 бегут дальше всех, независимо от пола10. FWR обычно считается отличной моделью для стимуляции адаптации выносливости в скелетных и сердечных мышцах 11,12,13,14,15,16; однако использование колесного бега в моделях тренировок с отягощениями исследуется реже.
Как можно было бы подозревать, гипертрофический эффект бега колеса может быть усилен путем добавления сопротивления беговому колесу, называемому бегом нагруженного колеса (LWR), что требует больших усилий для бега на колесе, чтобы более точно имитировать тренировку сопротивления. Используя различные методы применения нагрузки, предыдущие исследования показали, что модель LWR, использующая крыс и мышей, обычно демонстрировала увеличение мышечной массы конечностей на 5%-30% в течение 6-8 недель 17,18,19,20,21. Кроме того, D'hulst et al. продемонстрировали, что один приступ LWR привел к увеличению активации сигнального пути синтеза белка на 50% по сравнению с FWR22. Сопротивление колеса чаще всего применяется методом постоянной нагрузки, основанным на трении, при котором магнитный тормоз или натяжной болт используется для применения сопротивления колеса 12,19,23,24. Одно из предостережений метода постоянной нагрузки, основанного на трении, заключается в том, что при применении умеренного и высокого сопротивления животное не может преодолеть высокое сопротивление, чтобы инициировать движение колеса, эффективно прекращая обучение. Самое главное, что многие из клеточных и колесных систем, используемых для моделей ходовых колес грызунов, довольно дорогостоящие и требуют специализированного оборудования.
Недавно Dungan et al. разработали прогрессивную модель с утяжеленным колесом (PoWeR), которая применяет нагрузку на колесо асимметрично через внешние массы, прикрепленные к одной стороне колеса. Считается, что несбалансированная нагрузка на колеса и переменное сопротивление модели PoWeR способствуют продолжению беговой активности и способствуют более коротким всплескам нагруженного колеса, работающих на мышах, более точно имитируя сеты и повторения, выполняемые с тренировкой с отягощениями17. Несмотря на то, что средняя дистанция бега составляла 10-12 км в день, модель PoWeR дала увеличение влажной массы мышц плантариса на 16% и 17% и площади поперечного сечения волокон (CSA) соответственно. Несмотря на многие практические преимущества, модель PoWeR LWR имеет некоторые ограничения. Как признают авторы, модель PoWeR представляет собой «гибридный» стимул большого объема, который отражает смешанную модель упражнений на выносливость / сопротивление (т. Е. Параллельные тренировки у людей), в отличие от более строгой модели, основанной на упражнениях с отягощениями, потенциально вводя эффект интерференции и способствуя менее выраженной гипертрофии или различным механизмам, с помощью которых гипертрофия индуцируется25 . Обеспечение того, чтобы явление параллельной тренировки не происходило в том, что должно быть моделью тренировки с отягощениями, является обязательным. Поэтому модель PoWeR была модифицирована для разработки модели LWR, которая использует более высокие нагрузки, чем ранее, чтобы больше напоминать модель тренировки сопротивления. Здесь приведены подробные сведения о простой и недорогой 9-недельной модели LWR с прогрессивной тренировкой с отягощениями у мышей C57BL/6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Аппалачского государственного университета (No 22-05).
1. Животные
- Добывайте мышей C57BL/6 из собственной колонии мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались самцы мышей в возрасте 5-8 месяцев в начале исследования. Ежедневная беговая активность достигает пика и плато примерно в 9-10 недель в возрасте26 лет. Предыдущие исследования показали, что старые мыши (22-24 месяца) также будут выполнять нагруженное колесо, работающее27. - Поместите мышей по отдельности в стандартную клетку для грызунов с проволочной крышкой и держите клетку в контролируемой среде (20-24 ° C с циклом 12: 12 ч света: темнота).
- Обеспечьте стандартным чау-чау для грызунов и водой ad libitum.
2. Ходовой колесный аппарат
- Настройка ходового колеса:
ПРИМЕЧАНИЕ: Ходовые колеса собираются/настраиваются аналогично для всех протоколов работы, за исключением добавления нагрузочных магнитов 1 g или 2,5 g.- Приклейте один магнит датчика 1 g к внешней средней окружности ходового колеса (рисунок 1).
- Используйте это колесо с одним магнитом датчика 1 g только в течение первой недели акклиматизации колеса.
- Работа на нагруженном колесе (LWR; протокол загрузки идентичен PoWeR17): Выполните шаги 2.1.4-2.1.6.
- Неделя 2 для LWR требует 2 г нагрузки (см. таблицу 1).
- Приклейте два магнита по 1 г бок о бок на внешнюю окружность колеса (рисунок 2А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь полезно использовать ленту, чтобы удерживать магниты на месте, пока клей не высохнет; в противном случае они могут притягиваться к магниту датчика и смещаться. - Примените дополнительную нагрузку в течение недель 3, 4 и 6, поместив еще один магнит весом 1 г поверх любого из уже присутствующих магнитов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клей не требуется, так как магниты прочно прилипают друг к другу. Например, при 6 г нагрузки на 6-й неделе каждый из магнитов будет укладываться в три раза (рисунок 2B). - Ход высоконагруженных колес (HLWR): Выполните шаги 2.1.8-2.1.11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол HLWR требует трех комплектов колес. Сборка различных наборов колес позволяет исследователю повторно использовать колесные установки для других мышей после того, как колесо тщательно очищено и продезинфицировано (количество каждого набора должно быть определено исследователем на основе размера когорты / группы). - Первый комплект колес (требуется только для недели 2) будет иметь один магнит весом 2,5 г; приклеить (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже Этап 2.1.5) одним магнитом весом 2,5 г на внешнюю окружность колеса (рис. 3А).
- Второй комплект колес (требуется только для недели 3) будет иметь два магнита по 2,5 г; приклеить (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже на этапе 2.1.5) два магнита весом 2,5 г бок о бок на внешнюю окружность колеса (рис. 3В).
- Третий комплект колес (требуется для недели 4 и далее) будет иметь три магнита по 2,5 г бок о бок; приклеить (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже Этап 2.1.5) три магнита весом 2,5 г бок о бок на внешнюю окружность колеса (рис. 3С).
- Применяйте дополнительную нагрузку в течение недель 6 и 8, поместив еще один магнит весом 2,5 г поверх любого из уже присутствующих магнитов (рисунки 3D, E).
Рисунок 1: Базовое ходовое колесо с одним магнитом датчика 1 g, приклеенным к средней внешней окружности колеса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Нагруженное ходовое колесо (LWR) с магнитом датчика и нагрузочными магнитами 1 g. (A) Пример 2 g нагрузки, два магнита 1 g, приклеенные бок о бок к внешнему краю колеса; (B) пример нагрузки 6 г, два магнита по 1 г, приклеенные бок о бок к внешнему краю колеса с дополнительной нагрузкой 4 г. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Высоконагруженное ходовое колесо (HLWR) с магнитом датчика и нагрузочными магнитами 2,5 г. (А) пример 2,5 г нагрузки, один магнит 2,5 г, приклеенный к внешнему краю колеса; (B) пример нагрузки 5 г, два магнита по 2,5 г, приклеенные бок о бок к внешнему краю колеса; (C) пример нагрузки 7,5 г, три магнита по 2,5 г, приклеенные бок о бок к внешнему краю колеса; (D) пример 10 г нагрузки, три магнита по 2,5 г, приклеенных бок о бок к внешнему краю колеса, с дополнительными 2,5 г нагрузки; (E) пример нагрузки 12,5 г, три магнита по 2,5 г, приклеенные бок о бок к внешнему краю колеса, с дополнительными 5 г нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Сборка клетки
- Соберите ходовые колеса с помощью клетки, оснащенной цифровым велосипедным компьютером для мониторинга времени тренировки (ч) и пройденного расстояния (км). Средняя скорость (км/ч) выводится арифметически.
- Убедитесь, что перед сборкой в велосипедный компьютер вставлена свежая батарея.
- Установить размер колеса при первоначальном компьютерном программировании велосипеда (см. инструкцию производителя); рассчитать расстояние за оборот путем измерения внешней окружности ходового колеса (например, 3 580 мм для типа колеса, используемого в настоящем документе).
- Поместите компьютерный датчик велосипеда в твердую поверхность на внешней стороне крышки клетки, непосредственно над тем местом, где расположен магнит датчика колеса. Убедитесь, что все компоненты компьютера и датчика содержатся в твердом барьере за пределами клетки, чтобы мыши не жевали компоненты.
- Используйте крышку пустой коробки с наконечником пипетки с небольшим прямоугольником, вырезанным для размещения магнитного датчика велосипеда, и основную часть коробки (со снятой сеткой стойки наконечника) для хранения велосипедного компьютера и провода (рисунок 4A).
- Просверлите два отверстия через углы твердой поверхности, чтобы закрепить магнитный датчик велосипеда и рабочее колесо на месте снаружи клетки (рисунок 4A).
- Вставьте текущую колесную базу вверх ногами через зазоры в крышке сепаратора, но поверх твердой поверхности, описанной на этапе 3.2 (рисунок 4B).
- Закрепите колесную базу и датчик компьютера в верхней части клетки с помощью аппаратного обеспечения (рисунок 4C, D).
- Убедитесь, что магнит датчика и компьютерный датчик расположены на расстоянии не более 1 см друг от друга, чтобы обеспечить надлежащую регистрацию движения колеса (большинство стандартных компьютерных датчиков велосипеда являются двунаправленными и будут записывать положительное движение колеса в любом направлении вращения).
- Прикрепите соответствующее ходовое колесо (как описано выше) к колесной базе с внутренней стороны крышки сепаратора и надежно поместите крышку на сепаратор (рисунок 4E, F).
- С колесом, свисающим с крышки клетки, обеспечьте не менее 2,5 см зазора от пола клетки. Поместите минимальное количество подстилающего материала в клетку, чтобы колесо свободно вращалось, но не становилось препятствием из-за накопления подстилки.
- Во время экспериментов записывайте данные с велосипедного компьютера с последовательным интервальным графиком, чтобы обеспечить точный мониторинг активности.
- Признать, что мыши являются ночным видом; поэтому большая часть их естественной активности в клетке (включая работу колес) будет выполняться в темные часы светового цикла.
Рисунок 4: Сепаратор ходового колеса в сборе. (A) Велосипедный компьютер и магнитный датчик размещены в твердой поверхности / лотке; (B) перевернутая колесная база, размещенная поверх твердой поверхности/лотка и датчика (вид сверху; обратите внимание на два отверстия в поверхности датчика/лотке для крепления основания к крышке сепаратора с помощью оборудования), (C) перевернутая колесная база с собранным оборудованием (вид снизу); (D) перевернутая колесная база с оборудованием в собранном виде (вид сверху); (E) полный сепаратор в сборе (вид сверху); и F) полный сепаратор в сборе (вид сбоку). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Протоколы тренировки по нагрузке
- Индивидуально размещать сидячих (SED) мышей в течение 9 недель в клетке, содержащей запертое беговое колесо, чтобы предотвратить любой бег.
ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 приведен график загрузки протоколов LWR (PoWeR) и HLWR, используемых при экспериментальном проектировании. - Уменьшите нагрузку для групп LWR и HLWR, если это необходимо, чтобы мыши продолжали тренироваться в течение всего 9-недельного протокола.
| Неделя | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | ||
| LWR (n = 4) | Нагрузка (г) | 0.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 5.0 | 6.0 | 6.0 | 6.0 |
| %БМ | -- | 8% | 11% | 15% | 19% | 19% | 23% | 23% | 23% | |
| ВАО (n =7) | Нагрузка (г) | 0.0 | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 7.5 | 10.0 | 10.0 | 12.5 | 12.5 |
| %БМ | -- | 10% | 19% | 28% | 28% | 38% | 38% | 48% | 48% | |
Таблица 1. Протоколы работы нагруженных колес
5. Тестирование мышечной функции in situ , сбор тканей и анализ тканей
- После 9-недельного обучающего вмешательства обезболивайте мышей, используя ингаляционный изофлуран (4% индукция; 2% поддержание) дополнительным кислородом, и обеспечьте надлежащий мониторинг анестезирующей плоскости на протяжении всей процедуры.
- Выполните тест функции мышц in situ на комплексе икроножной крупы, плантариса, камбалы (GPS) для проверки изометрической мышечной силы28. Установите кривую силы-частоты путем прямой стимуляции седалищного нерва с помощью 27 G-электродных игл на 11 восходящих частотах между 1-300 Гц, с тетаническими сокращениями, происходящими около 100-150 Гц29.
- Сразу после теста мышечной функции усыплите мышей через вывих шейки матки и подтвердите эвтаназию, удалив сердце. Тщательно иссекните подошвенные и камбаловидные мышцы и запишите влажную тканевую массу.
- Покройте каждый образец мышцы в встраиваемой средой (OCT) и установите его на пробку. Заморозьте его в жидком азотоохлаждаемом изопентане и храните при -80 °C до дальнейшего иммуногистохимического (IHC) анализа на участках мышечной ткани (толщиной 10 мкм).
- Анализ мышечного волокна CSA с использованием иммунофлуоресценции для ламинина. Измерьте оптоволоконный CSA с помощью платформы30 автоматической количественной оценки изображений.
6. Статистический анализ
- Выражайте все данные как среднее ± SD.
- Выполняйте статистический анализ с использованием программного обеспечения для статистического анализа со значимостью, установленной на уровне p ≤ 0,05.
- Сравните данные о пробеге колес и объеме тренировок с повторными измерениями двусторонней ANOVA.
- Сравните массу тела, массу тканей, CSA и мышечную функцию с односторонней ANOVA. Если обнаружены значимые F-соотношения, сравните внутригрупповые различия, используя пост-специальный анализ ЛСД Фишера.
- Рассчитайте размеры эффектов, а затем интерпретируйте их как 0,01, 0,06 и 0,14 для малых, средних и больших размеров эффектов соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании 24 мыши C57BL/6 (6,3 ± 0,7 месяца в начале этого исследования) были случайным образом распределены в одну из трех групп лечения: сидячий образ жизни (SED), бег на нагруженных колесах (LWR; такой же, как PoWeR, описанный Dungan et al.17), или высокий LWR (HLWR), а затем завершили свой соответствующий 9-недельный протокол. После недели акклиматизации (неделя 1) не было никаких групповых или групповых различий во времени в дистанции бега или объеме тренировок (рисунок 5).
Рисунок 5: Характеристики ходовых колес для групп LWR (зеленые заполненные квадраты) и HLWR (красные заполненные треугольники). (A) Среднесуточная дистанция бега (км); (B) средний тренировочный объем (км/день∙г), выраженный в виде суточной дистанции бега (км/день), умноженной на суточную нагрузку на колесо (в g). Данные выражаются в виде среднего группового ± SD. LWR, n = 4; HLWR, n = 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Нормализованная масса камбалы была на 21,4% больше в группе HLWR, чем в группе SED (p < 0,001), несмотря на отсутствие различий в клетчатке CSA (p = 0,536) (рисунок 6A). Хотя мышечная масса плантариса и среднее количество волокон CSA не демонстрировали статистически значимых различий (p = 0,573 и p = 0,111 соответственно), по-видимому, наблюдается сдвиг в доле волокон с большим CSA в подошвенном HLWR по сравнению с SED и LWR (рисунок 6B). Не было выявлено существенных различий в подергивании или пиковой силе комплекса GPS между группами, измеренных с помощью теста функции мышц in situ (таблица 2).
Рисунок 6: Пропорции площади поперечного сечения волокна. (A) Пропорции мышечных волокон soleus и (B) plantaris (%) по площади поперечного сечения для групп SED (черные заполненные круги), LWR (зеленые заполненные квадраты) и HLWR (красные заполненные треугольники) (n = 3-4 / группа). Камбаловидная мышца содержит сходные пропорции волокна CSA во всех группах. Подошвенная мышца группы HLWR, по-видимому, имеет более высокую долю волокон с большим CSA по сравнению с группами SED и LWR. Данные выражаются в виде среднего группового значения для каждой категории размеров волокон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Группа | |||||
| СЕПГ | ЛВР | ВАВР | P-значение | Размер эффекта (ƞ2) | |
| Предтренировочная масса тела (г) | 26.35 ± 2.12 | 28.07 ± 3.42 | 25.71 ± 2.22 | 0.299 | 0.324 |
| Масса тела после тренировки (г) | 26.82 ± 1.96 | 28.91 ± 2.80 | 27.43 ± 2.07 | 0.251 | 0.341 |
| Масса камбалы (мг/г БМ) | 0,28 ± 0,03 | 0,31 ± 0,02 | 0.34 ± 0.03# | 0.003 | 0.611 |
| Подошвенная масса (мг/г БМ) | 0,61 ± 0,06 | 0,64 ± 0,03 | 0,63 ± 0,06 | 0.573 | 0.239 |
| Камбала CSA (мкм²) | 2042 ± 320 | 1964 ± 357 | 1800 ± 206 | 0.536 | 0.130 |
| Плантарис CSA (мкм²) | 2032 ± 159 | 2483 ± 579 | 2754 ± 109 | 0.111 | 0.519 |
| Усилие подергивания (Н/г GPS) | 2.96 ± 0.47 | 3.19 ± 0.58 | 3.42 ± 0.78 | 0.254 | 0.340 |
| Максимальное тетаническое усилие (Н/г GPS) | 11.43 ± 1.77 | 13.04 ± 2.87 | 13.13 ± 1.70 | 0.136 | 0.395 |
| # - указывает на то, что значительно отличается от SED; Размер эффекта (ƞ2): малый = 0,01; средний = 0,06; большой = 0,140 | |||||
Таблица 2. Характеристики животных, масса тканей, мышечная сила и площадь поперечного сечения волокон
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существующие модели упражнений с отягощениями у грызунов оказались бесценными для исследований скелетных мышц; однако многие из этих моделей являются инвазивными, непроизвольными и/или трудоемкими и трудоемкими. LWR является отличной моделью, которая не только вызывает аналогичные мышечные адаптации, как те, которые наблюдаются в других общепринятых моделях тренировок с отягощениями, но также обеспечивает хронический стимул для упражнений с низким уровнем стресса для животного с минимальными временными / трудовыми обязательствами исследователя. Кроме того, поскольку модели LWR требуют минимального прямого вмешательства со стороны исследователя, целые когорты мышей могут быть легко обучены упражнениям одновременно для краткосрочных или долгосрочных интервенционных исследований. Однако применение умеренной нагрузки на колеса либо не может удержать мышей от бега на большие расстояния (слишком малое сопротивление), либо мыши прекращают бег почти полностью из-за метода приложения нагрузки (слишком большое сопротивление). Прогрессивная модель LWR с утяжеленным колесом (PoWeR), разработанная Dungan et al. (2019)17 , дает значительные мышечные адаптации, такие как гипертрофия волокон, но также способствует переходу к более окислительному фенотипу. Ограничение PoWeR как действительно «основанной на сопротивлении» модели заключается в том, что она вызывает стимул с более высоким объемом (расстояние) и меньшей нагрузкой (сопротивление), более отражающий гибридный режим тренировок, обеспечивающий комбинацию стимулов сопротивления и выносливости. Поэтому для мышей была разработана новая модель высоконагруженного колесного хода (HLWR), которая модифицировала модель PoWeR, чтобы обеспечить более смещенный со сопротивлением стимул, где внешняя нагрузка прилагается и постепенно увеличивается, что позволяет мышам продолжать работать, но при гораздо более высоких нагрузках, чем ранее использовалось. Наша модель использовала ту же концепцию несбалансированной загрузки колес, что и модель PoWeR, но с более простой и менее дорогой системой. В дополнение к «нормальному» спорадическому (включенному и выключенному) поведению ходового колеса мышей, несбалансированная нагрузка на колеса заставляет мышей бежать в прерванных «рывках». Это связано с тем, что мышь должна тянуть груз к верхней части колеса (противопоставляя гравитации) в течение первой половины оборота, только к «берегу» или «свободному колесу», когда груз падает вниз с гравитацией во второй половине оборота.
После 9 недель тренировок камбаловидная мышца мышей HLWR показала увеличение мышечной массы на 21,4%, но без разницы в клетчатке CSA. В то время как подошвенная мышца мышей HLWR не выявила значительного увеличения мышечной массы, доля волокон с более крупным CSA, по-видимому, увеличилась. Konhilas et al. и Soffe et al. не наблюдали различий в росте мышц между низким сопротивлением и высоким сопротивлением колеса, работающим19,23; однако в текущем исследовании масса камбалы увеличилась на ~10% и ~20% в группах LWR и HLWR соответственно. Представляется вероятным, что гипертрофия мышц в ответ на новую модель тренировки сопротивления HLWR может быть специфичной для мышц и волокон; однако для подтверждения этого понятия необходимо провести дальнейшее расследование. Тест функции мышц in situ проводился в виде одного острого сеанса, только на правой конечности мыши в конце 9-недельного протокола, непосредственно перед эвтаназией и сбором тканей. Мышечная масса (влажная масса, нормализованная до массы тела), о которой сообщается здесь, относится только к левой конечности мыши, так как существует значительный отек / отек от хирургической процедуры, который может изменить влажную массу в мышцах правой конечности.
Значение этой новой модели HLWR заключается в том, что она демонстрирует, что мыши будут продолжать работать с относительно высокими нагрузками, приложенными к колесу. Нагрузка на колеса по отношению к средней массе тела (% BM) мышей C57BL/6 основана на средней массе тела мышей, используемых в этом проекте (~26 г). Средняя масса тела мыши будет варьироваться в зависимости от штамма, возраста и пола. Самые высокие нагрузки в 10-12,5 г в модели HLWR (эквивалентные ~40%-50% массы тела мыши) значительно выше, чем у модели PoWeR (максимум = 6 г), или примерно в два раза больше сопротивления колеса. Несмотря на статистическую значимость, по-видимому, наблюдается резкое снижение дистанции бега, поскольку нагрузка на колеса превысила 7,5 г на 6-й неделе и далее модели HLWR, в то время как LWR поддерживала постоянную среднюю дистанцию бега в течение оставшейся части 9-недельного протокола. Неспособность высоких колесных нагрузок в модели HLWR значительно ослабить дистанцию бега является ограничением этих выводов; однако это может быть смягчено с помощью больших размеров когорты, поскольку в группах наблюдалась очень высокая вариативность в производительности бега.
Может быть трудно оценить склонность мыши к последовательному бегу в течение первой недели акклиматизации к колесному бегу. Поскольку некоторые мыши просто не будут бегать достаточно, чтобы вызвать мышечную адаптацию, рекомендуется реализация минимального порогового порога для дальнейшего включения любой конкретной мыши в группы, работающие на колесах. Минимальное пороговое значение должно составлять среднюю дистанцию бега не менее 1 км/день в течение первой недели акклиматизации. Если мышь не пробегает в среднем не менее 1 км / день в течение первой недели, маловероятно, что мышь существенно увеличит дистанцию бега в течение оставшейся части 9-недельного протокола, чтобы обеспечить существенный стимул для адаптации. В этом случае, если какая-либо конкретная мышь не соответствует минимальному порогу в 1 км/день после первой недели акклиматизации, заблокируйте колесо и переназначьте эту мышь в сидячую группу. Реализация этого минимального порогового порога снизит изменчивость статистики бега и гарантирует, что мыши получат адекватный тренировочный стимул в течение 9-недельного протокола. Это в духе трех «R» исследований на животных, в частности, сокращения. Во-вторых, важно иметь встроенный план действий в чрезвычайных ситуациях, если мышь не может пробежать определенное расстояние при высоких нагрузках на колеса. Чтобы мыши продолжали тренироваться в течение всего 9-недельного протокола, нагрузка должна быть уменьшена до уровня предыдущей недели, если дистанция бега опускается ниже 0,25 км / день в течение 3 последовательных дней. В этом случае, если какая-либо конкретная мышь не пробегает в среднем не менее 0,25 км в течение 3 последовательных дней после добавления нагрузки, может потребоваться уменьшить нагрузку на колесо обратно к предыдущей нагрузке, чтобы гарантировать, что мышь будет продолжать обучение в течение оставшейся части 9-недельного протокола. В этом исследовании было отмечено, что большинство мышей смогли продолжить бег на дистанции > 0,25 км/ день даже при самых высоких нагрузках (12,5 г) в протоколе HLWR (рисунок 5A). Тем не менее, этот план на случай непредвиденных обстоятельств был реализован для трех из семи мышей в группе HLWR, в соответствии с которым нагрузка должна была быть уменьшена до 10 г или 7,5 г в один момент в течение 9-недельного протокола обучения. Было бы прискорбно, если бы мышь успешно работала для большей части протокола только для того, чтобы быть удаленной из исследования, потому что она не могла достичь следующей стадии при очень высоких нагрузках на колеса. Небольшое снижение нагрузки для обеспечения непрерывного бега максимизирует использование отдельного животного без ущерба для благополучия. Наконец, также важно отслеживать ежедневное (или, по крайней мере, еженедельное) потребление пищи, чтобы убедиться, что мыши потребляют достаточно пищи, чтобы компенсировать повышенную физическую активность. Это относительно просто, когда мыши размещаются индивидуально. Ожидайте увеличения потребления пищи ~ 20% по сравнению с сидячими мышами31.
Трудно напрямую сравнить эти результаты (например, дистанции бега) с теми, которые первоначально были опубликованы для модели PoWeR. Dungan et al. сообщили о пробеге на дистанциях ~ 10-12 км в день17, тогда как мыши в текущем протоколе, который выполнял протокол LWR, бегали ~ 5-6 км в день. Резкое расхождение может быть связано с самцами мышей, используемых в текущем протоколе, по сравнению с самками мышей, используемых Dungan et al., поскольку было замечено, что самки мышей бегут примерно на 20-40% дальше10,32. Кроме того, Dungan et al. использовали металлические колеса с металлической рабочей поверхностью стержня, что может привести к лучшим рабочим характеристикам по сравнению с пластиковыми ходовыми колесами, используемыми в текущем протоколе. Ранее сообщалось, что молодые самки мышей C57BL/6 бегали в среднем 8-10 км/день на одной и той же пластиковой установке ходового колеса33. Поэтому настоятельно рекомендуется проводить пилотное тестирование для отдельных лабораторных условий для определения производительности мышей из-за таких факторов, как напряжение, пол, тип колеса и индивидуальные вариации.
Основным преимуществом описанной здесь модели колеса с высоким сопротивлением нагрузкам является то, что она намного экономичнее других моделей, требующих дорогостоящего специализированного оборудования. Оборудование для такой установки ходового колеса стоит часть специализированных аппаратов ходовых колес, доступных у коммерческих поставщиков. Наконец, модели с нагруженным колесом выполняют еще одну из трех «R» исследований на животных. Поскольку работа колес является полностью добровольным стимулом, эти модели являются неинвазивными и значительно менее стрессовыми для мышей по сравнению с другими моделями гипертрофии, в частности синергетической абляцией или другими моделями, которые требуют дней или недель оперантного обусловливания. Будущие исследования должны подтвердить, что модель HLWR обеспечивает больший гипертрофический стимул по сравнению со смешанным стимулом выносливости/сопротивления модели LWR. В заключение, при правильном выполнении, потенциальное применение этой новой, прогрессивной модели с высоким сопротивлением нагрузке является простым, но недорогим, высокопроизводительным и низкострессоустойчивым упражнением для мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Ассоциацию управления аспирантами, Управление студенческих исследований и Департамент здравоохранения и физических упражнений в Аппалачском государственном университете за предоставление финансирования для поддержки этого проекта. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Моник Эккерд и Терин Уильямс-Фрей за надзор за повседневной деятельностью исследовательского центра на животных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND018-6 | Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading |
| 2.5 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND022 | Used for 2.5 g increments of wheel loading |
| 8-32 x 1" stainless steel screws | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 | |
| 8-32 Wing Nuts | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| 10 µL pipette tip box (empty) | Thermo Scientific | 2140 | We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice |
| Extreme Liquid Glue | Loctite | ||
| Laminin primary antibody | Novus Biologicals | NB300-144AF647 | primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum |
| Lithium 3 V battery | n/a | CR2032 | |
| M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| MyoVision: Automated Image Quantification Platform | Wen et al. (2017) | v1.0 | https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision |
| Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid | Orchid Scientific | Polycarbonate Rat Cage Type II | https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa |
| Sigma Sport 509 Bike Computer | Sigma Sport | Does not need to be this model in particular, but must have distance and time monitoring capabilities | |
| Silent Spinner Running Wheel (mini 11.4 cm) | Kaytee | SKU# 100079369 | https://www.kaytee.com/all-products/small-animal/silent-spinner-wheel |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Goldberg, A. L. Protein synthesis during work-induced growth of skeletal muscle. Journal of Cell Biology. 36 (3), 653-658 (1968).
- Baar, K., Esser, K. Phosphorylation of p70S6k correlates with increased skeletal muscle mass following resistance exercise. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 276 (1), 120-127 (1999).
- Wong, T. S., Booth, F. W. Skeletal muscle enlargement with weight-lifting exercise by rats. Journal of Applied Physiology. 65 (2), 950-954 (1988).
- Hornberger Jr, T. A., Farrar, R. P. Physiological hypertrophy of the FHL muscle following 8 weeks of progressive resistance exercise in the rat. Canadian Journal of Applied Physiology. 29 (1), 16-31 (2004).
- Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
- Tamaki, T., Uchiyama, S., Nakano, S. A weight-lifting exercise model for inducing hypertrophy in the hindlimb muscles of rats. Medicine and Science in Sports and Exercise. 24 (8), 881-886 (1992).
- De Bono, J. P., Adlam, D., Paterson, D. J., Channon, K. M. Novel quantitative phenotypes of exercise training in mouse models. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 290 (4), 926-934 (2006).
- Goh, J., Ladiges, W.
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Daves, M., Vordermark, A., Kleeberger, S. R. Genetic influence on daily wheel running activity level. Physiological Genomics. 19 (3), 270-276 (2004).
- Allen, D. L., et al. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. Journal of Applied Physiology. 90 (5), 1900-1908 (2001).
- Ishihara, A., et al. Effects of running exercise with increasing loads on tibialis anterior muscle fibres in mice. Experimental Physiology. 87 (2), 113-116 (2002).
- Kurosaka, M., et al. Effects of voluntary wheel running on satellite cells in the rat plantaris muscle. Journal of Sports Science and Medicine. 8 (1), 51-57 (2009).
- Lambert, M. I., Noakes, T. D. Spontaneous running increases VO2max and running performance in rats. Journal of Applied Physiology. 68 (1), 400-403 (1990).
- Rodnick, K. J., Reaven, G. M., Haskell, W. L., Sims, C. R., Mondon, C. E. Variations in running activity and enzymatic adaptations in voluntary running rats. Journal of Applied Physiology. 66 (3), 1250-1257 (1989).
- Sexton, W. L. Vascular adaptations in rat hindlimb skeletal muscle after voluntary running-wheel exercise. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 287-296 (1995).
- Dungan, C. M., et al. Elevated myonuclear density during skeletal muscle hypertrophy in response to training is reversed during detraining. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 316 (5), 649-654 (2019).
- Ishihara, A., Roy, R. R., Ohira, Y., Ibata, Y., Edgerton, V. R. Hypertrophy of rat plantaris muscle fibers after voluntary running with increasing loads. Journal of Applied Physiology. 84 (6), 2183-2189 (1998).
- Konhilas, J. P., et al. Loaded wheel running and muscle adaptation in the mouse. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (1), 455-465 (2005).
- Legerlotz, K., Elliott, B., Guillemin, B., Smith, H. K. Voluntary resistance running wheel activity pattern and skeletal muscle growth in rats: Wheel running activity pattern and muscle growth. Experimental Physiology. 93 (6), 754-762 (2008).
- Mobley, C. B., et al. Progressive resistance-loaded voluntary wheel running increases hypertrophy and differentially affects muscle protein synthesis, ribosome biogenesis, and proteolytic markers in rat muscle. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 102 (1), 317-329 (2018).
- D'Hulst, G., Palmer, A. S., Masschelein, E., Bar-Nur, O., De Bock, K. Voluntary resistance running as a model to induce mTOR activation in mouse skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 10, 1271 (2019).
- Soffe, Z., Radley-Crabb, H. G., McMahon, C., Grounds, M. D., Shavlakadze, T. Effects of loaded voluntary wheel exercise on performance and muscle hypertrophy in young and old male C57Bl/6J mice: Exercise and muscle hypertrophy in old mice. Scandinavian Journal of Medicine and Science in Sports. 26 (2), 172-188 (2016).
- White, Z., et al. Voluntary resistance wheel exercise from mid-life prevents sarcopenia and increases markers of mitochondrial function and autophagy in muscles of old male and female C57BL/6J mice. Skeletal Muscle. 6 (1), 45 (2016).
- Murach, K. A., McCarthy, J. J., Peterson, C. A., Dungan, C. M. Making mice mighty: Recent advances in translational models of load-induced muscle hypertrophy. Journal of Applied Physiology. 129 (3), 516-521 (2020).
- Swallow, J. G., Garland, T., Carter, P. A., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. Effects of voluntary activity and genetic selection on aerobic capacity in house mice (Mus domesticus). Journal of Applied Physiology. 84 (1), 69-76 (1998).
- Murach, K. A., et al. Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging. Aging Cell. 21 (1), 13527 (2022).
- Mackay, A. D., Marchant, E. D., Louw, M., Thomson, D. M., Hancock, C. R. Exercise, but not metformin prevents loss of muscle function due to doxorubicin in mice using an in situ method. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9163 (2021).
- Godwin, J. S., Hodgman, C. F., Needle, A. R., Zwetsloot, K. A., Andrew, R. Whole-body heat shock accelerates recovery from impact- induced skeletal muscle damage in mice. Conditioning Medicine. 2 (4), 184-191 (2020).
- Wen, Y., et al. MyoVision: Software for automated high-content analysis of skeletal muscle immunohistochemistry. Journal of Applied Physiology. 124 (1), 40-51 (2018).
- Manzanares, G., Brito-da-Silva, G., Gandra, P. G. Voluntary wheel running: Patterns and physiological effects in mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 52 (1), 7830 (2019).
- Bartling, B., et al. Sex-related differences in the wheel-running activity of mice decline with increasing age. Experimental Gerontology. 87, 139-147 (2017).
- Zwetsloot, K. A., Westerkamp, L. M., Holmes, B. F., Gavin, T. P. AMPK regulates basal skeletal muscle capillarization and VEGF expression, but is not necessary for the angiogenic response to exercise: AMPK and the skeletal muscle angiogenic response to exercise. The Journal of Physiology. 586 (24), 6021-6035 (2008).
