Summary
Metoder för enkel, snabb induktion av en ryggsmärtmodell hos möss tillhandahålls här med hjälp av en intraligamentinjektion av urinplasminogenaktivator.
Abstract
En modell för ihållande smärta i nedre delen av ryggen kan induceras hos möss med den enkla metodik som beskrivs här. Steg-för-steg-metoder för enkel, snabb induktion av en ihållande ryggsmärtmodell hos möss tillhandahålls här med hjälp av en injektion av plasminogenaktivator av urokinastyp (urokinas), ett serinproteas som finns hos människor och andra djur. Metoden för induktion av ihållande smärta i nedre delen av ryggen hos möss innebär en enkel injektion av urokinas längs ligamentområdet i ländryggen. Det urokinasinflammatoriska ämnet aktiverar plasminogen till plasmin. Vanligtvis kan modellen induceras inom 10 minuter och överkänslighet kvarstår i minst 8 veckor.
Överkänslighet, gångstörning och andra vanliga ångest- och depressionsliknande mått kan testas i den kvarstående modellen. Ryggsmärta är den vanligaste typen av smärta. För att öka medvetenheten om ryggsmärta har International Association for the Study of Pain (IASP) utsett 2021 till "Global Year about Back Pain" och 2022 till "Global Year for Translating Pain Knowledge to Practice". En begränsning för den terapeutiska utvecklingen av smärtterapi är bristen på lämpliga modeller för att testa ihållande och kronisk smärta. Funktionerna i denna modell är lämpliga för att testa potentiella terapier som syftar till att minska ryggsmärta och dess tillhörande egenskaper, vilket bidrar till IASP:s utnämning 2022 till det globala året för att översätta smärtkunskap till praktik.
Introduction
Ländryggssmärta är en av de vanligaste orsakerna till funktionsnedsättning och 1 av 5 personeri världen lider 1. Trots dessa ansträngningar är det få tillförlitliga djurmodeller av ryggsmärta som är populära i djurförsök inom smärtområdet, särskilt på möss. Tidigare modeller har nästan uteslutande använt råttor för induktion av kronisk ryggsmärta (CBP) såsom de som induceras genom injektion av urinplasminogenaktivator (uPA) i ländryggens facettled 2,3, injektion av nervtillväxtfaktor (NGF) i bålmuskulatur4 eller mononatriumjodacetat (MIA)5 eller interleukin-1beta6 injektion i den intravertebrala disken. Naturligtvis är råttor att föredra för dessa modeller, främst på grund av deras större storlek och lättillgänglighet för injektion av inflammatoriska medel.
För att vara tydlig, musmodeller av ryggsmärta finns som SPARC-null-musmodellen av intervertebral diskdegeneration som använts i många år7, men dessa är mer kostsamma och tidskrävande att etablera än injektionsbaserade modeller. En nyligen genomförd musstudie etablerade en modell för smärta i nedre delen av ryggen genom att kombinera NGF-injektion i ländryggsmuskler med vertikal kronisk fasthållningsstress8. I följande protokoll har vi anpassat den uPA-inducerade CBP-modellen från råttor för möss2. Överkänslighet etableras inom 1 vecka och kvarstår upp till 6-8 veckor. Dessutom konstaterar vi att möss utvecklar ångest- och depressionsliknande beteenden. Med tanke på förekomsten av ryggsmärta och den vanligare användningen av möss i molekylär smärtforskning, är denna hållbara modell lätt etablerad för användning i utvecklingen av nya behandlingsstrategier för lindring av ryggsmärtor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs är i enlighet med NIH:s guide för vård och användning av försöksdjur. Studierna godkändes av den lokala kommittén för institutionell vård och användning (IACUC #23-201364-HSC) vid University of New Mexico Health Sciences Center. Alla studier följer riktlinjer under överinseende av en OLAW Assurance of Compliance (A3002-01) om användning av djur i forskning, enligt beskrivningen i del III. II. Försäkringar och certifieringar. Djuren är inhysta i Animal Resources Center (ARC) som underhålls av laboratoriepersonalen och personalen vid avdelningen för laboratorie- och djurresurser (DLAR). Metoden för avlivning (100 μL 59 mg/ml pentobarbitalinjektion) är snabb och tillförlitlig och möjliggör dissektion och insamling av olika vävnader för vidare forskning.
1. Djur
- Husvuxna (~3-4 veckor gamla) han- och honmöss BALB/c (20-25 g) på en omvänd 12 h:12 h ljus:mörk cykel, så deras aktiva tid i mörker inträffar under laboratoriearbetstid.
OBS: Detta gör det möjligt att bedöma alla parametrar under djurens naturliga aktiva tid, eftersom gnagare är naturligt nattaktiva djur. Detta minskar bidraget från förändringar av den cirkadiska klockan så att djuren kan testas under sin aktiva tid som nu är dagtid. - Övervaka djuren två gånger dagligen.
- Behåll mössen på normal musuppfödarmat, som har lägre sojaproteininnehåll jämfört med vanlig gnagarsoppa (känd för att förändra överkänslighet) om man bedömer läkemedelseffekter på smärtrelaterade beteenden.
- Väg djuren en gång i veckan för att säkerställa att en hälsosam viktökning bibehålls.
OBS: Inga gruppskillnader i vikt noterades under de 8-10 veckor långa studierna, vilket möjliggjorde blindning av studien.
2. Induktion av modell
- Utför modellinduktion på en varm, steril plan yta som är försedd med en anordning för att fästa stabiliseringsband för att hålla musen på plats (Figur 1A). Utför operationen med ett dissektionsmikroskop på en steriliserad yta.
OBS: Använd ett dragskåp av kemisk kvalitet om anestesiuppsamling inte är tillgänglig. - Använd kirurgiskt silke eller till och med garn med gummiband knutna i änden av snörena som hakas fast i plattans ribbade kanter som fasthållning om du använder bottenplattan som rekommenderas i materialtabellen.
- Placera en uppvakningsstation för värmedynor på en yta intill operationsuppställningen för överföring av möss till stationen omedelbart efter injektionen (Figur 1B).
OBS: Placera en tom husbur på värmedynan minst 10 minuter före injektion så att buren kan värmas upp till en behaglig temperatur (37 °C). Placera buren halvt av dynan för att ge den vakna musen en preferens för återhämtningstemperaturer. - Bered urokinaset och späd ut det i sterilt vatten. Alkohol Rengör Hamilton-sprutan och skölj den i sterilt vatten. Rita upp lösningen i förväg så att musen är nedsövd så kort tid som möjligt. Använd 5 μL 2 mg/ml urinplasminogenaktivator för modellen; För shams, använd 5 μL steril koksaltlösning.
- Ställ in isoflurananestesistationen på en nivå av 4 % eller mindre för denna korta procedur. Placera musen i induktionskammaren; Vanligtvis kommer musens snabba andningsfrekvens att sakta ner inom 1-2 minuter, från övre bröstkorgens rörelse till nedre delen av bröstet.
- Använd en syrenivå på 1.5 l/min och en F-behållare med aktivt kol eller arbeta under ett biologiskt flöde eller evakueringshuv över huvudet för att skrubba isofluran för att undvika exponering för djurkirurgen. Om det inte är tillgängligt, utför proceduren i en kemikaliesäkerhetshuv.
- Växla snabbt musen och anestesiflödet till operationsområdet på en 37°C värmedyna, placera musens nos i noskonen för att bibehålla anestesinivån (Figur 1C,D). Kontrollera att musen inte har någon reflexmässig rörelse för att nypa tån och håll sedan fast musen på bottenplattan.
OBS: Om det finns någon rörelse alls, sätt tillbaka musen i induktionskammaren och upprepa detta. - Rengör området på rygghuden med en spritservett. Justera LED-belysningen efter behov för att få en tydlig view av den sövda musens baksida.
OBS: Om det behövs, använd en elektrisk rakapparat för att ta bort hår från musens rygg så att det finns en fri view av ryggradens åsar under huden. Om försöksmössen är rakade, raka även ryggen på de naiva och falska mössen för att blinda dem. - Injicera musen medan den är helt bedövad och immobiliserad (ingen rätande reflex och tillbakadragande av tårna). Använd två fingrar för att försiktigt känna var undersidan av musens bröstkorg möter ryggraden (Figur 2A). Under den punkten finns de virkesspinala segmenten; rikta injektionen här mot L2-L3.
- Placera spetsen på Hamilton-sprutan intill ryggraden (Figur 2B,C). Rikta sprutan i ~45° vinkel mot det interspinösa ligamentet omedelbart intill benet.
OBS: Beroende på hur tufft musens hud är kan det ibland fungera bättre att förlita sig på gravitationen istället för aktivt tryck och en 90° vinkel. - För in nålspetsen försiktigt men bestämt i det interspinösa ligamentet (Figur 3B,C).
OBS: Målet är inte att bryta bukhålan utan att injicera ligamentet. - Töm nålens innehåll långsamt. Om det vid något tillfälle finns vätska i spetsen är nålen inte genom huden. Fortsätt tills alla 5 μl har injicerats.
- Håll nålen på plats i ~5 s för att förhindra återflöde från injektionen. Användning av blått färgämne i terminala eller akuta pilotförsök rekommenderas.
OBS: Om det görs på rätt sätt ska vätskan spridas in i ligamentet enligt bilden (Figur 3A). - Ta bort nålen försiktigt och långsamt. Se till att det inte finns något blod eller flytningar.
- Placera musen i värmeåtervinningsstationen med en burtopp tills den vaknar och är rörlig innan du sätter tillbaka den i hemburen.
OBS: Förutsatt att proceduren utfördes snabbt bör det inte ta mer än en minut innan musen vaknar. - Kontrollera mössen i 1 timme efter operationen för att säkerställa att all normal motorisk funktion fortsätter som en försiktighetsåtgärd.
OBS: Om det görs på rätt sätt bör det inte finnas några komplikationer från denna procedur. - Kontrollera mössen dagligen under veckan efter operationen, inklusive viktbedömning och inspektion av injektionsstället för att säkerställa att ingen infektion eller komplikationer har uppstått. Använd inte musen för ytterligare experiment om det sker en förändring i beteendet, såsom viktminskning och slöhet.
Figur 1: Inställning för urokinas CBP-induktion. (A) Fine Science Tools-basplattan som rekommenderas för musoperationer. De ribbade kanterna kan ha ett haksnöre på sig för att hålla musen på plats. (B) Återvinningsstation. En tom husbur rekommenderas, hälften på värmedynan, hälften av. En ren trasa placeras på undersidan för att ge musen en bekväm viloplats. (C) Rekommendation för inställning av anestesimaskin. Använd ett tvåkanaligt leveranssystem och sätt upp en slang till induktionskammaren och en annan till operationsstationen. (D) En vy av musens fasthållningsanordningar. Två snören knyts på de räfflade kanterna på bottenplattan och dras sedan försiktigt över musens hals respektive baksida. Se till att inte hålla fast musen för hårt så att den fortfarande kan andas normalt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Urokinasinjektionsinduktion av CBP. (A) En vy över injektionsställets placering. Som bilden visar, känn med fingrarna för att hitta botten av musens bröstkorg för en referenspunkt för L4-L5. (B) En bild av injektionsprocessen som visar vinkeln för korrekt injektion. (C) En vinkel på 45° är att föredra här, men justera efter behov för att säkerställa att nålen kommer dit den ska. Om det behövs, raka injektionsstället för bättre visualisering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Diagram över injektionsstället. (A) Ett fotografi av injektionsstället. Bläck används här för att indikera var vätskan kommer in i det interspinösa ligamentet mellan L2- och L3-kotorna. B) Ett diagram som visar nålens korrekta placering och injektionsställets placering, sett från sidan. (C) Ett diagram som visar kotorna uppifrån och ner och injektionsställen för de interspinösa ligamenten. Injektionerna sker vanligtvis på de interspinösa ligamenten bredvid ryggraden, men nålen kan också föras in i utrymmet mellan och de tvärgående kotorna. Användning av blått färgämne i pilotförsök rekommenderas enligt punkt A. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Beteendemässiga analyser
- von Frey mekanisk reflexresponströskeltestning
OBS: Mekanisk uttagströskel är den minimala kraft som behövs för att framkalla ett svar 50 % av tiden med en serie av 8 von Frey-monofilament graderade i diameter med ~0.2 g ökningar, vilket ger logaritmiska stegförändringar i mekanisk kraft (Materialtabell).- Testa mekanisk stimulering med von Frey-fibrer applicerade på baktassen, innervationsterritoriet för lumbosakralnerverna. Bestäm baslinjevärdena för tassuttag före operationen. Efter operationen, bestäm den mekaniska tröskeln en gång i veckan under det kroniska experimentet.
- Flytta djuren från stallet och acklimatisera dem i testrummet i 30 minuter i deras hemburar före testningen. Därifrån flyttar du djuren för att hålla fast dem individuellt i små genomskinliga bås på testbordet med skärmskiva i 15-20 minuter beroende på deras aktivitetsnivå.
OBS: Testningen kan börja efter att möss har lagt sig i viloläge och inte vänder och rör sig i kammaren. Acklimatisering till fasthållningsskåpet minimerar stressinducerade effekter. Om möss har hållits på en omvänd ljuscykel bör testning göras under rödljusförhållanden. - Fortsätt med testning med graderade serier av von Frey-fibrer enligt beskrivningen nedan och i Chaplan et al.9.
- Mät fotplattan på en konsekvent plats på varje djur med hjälp av 3,61 von Frey-filamentet som när det böjs framkallar 0,4 g kraft (Materialtabell). Följ upp med stimulering med 4.08 von Frey-filamentet som framkallar 1.0 g kraft.
OBS: Ingen av dessa fibrer framkallar reaktioner hos naiva, acklimatiserade djur. - Applicera varje filament 5x med >5 s intervall vinkelrätt mot trampdynan, var noga med att inte vidröra ett veck/springa eller hår. En positiv respons är att man drar tillbaka foten till tre av fem stimuli. Applicera nästa svagare filament i serien tills djuret inte reagerar på den mekaniska stimuleringen; Använd då nästa högre filament. Om det framkallar en respons, använd det nedre filamentet igen tills fyra försök har gjorts efter förändringen av responsen på mekanisk stimulering av trampdynan.
- Använd det resulterande responsmönstret för att beräkna den mekaniska uttagströskeln, den minimala mängd kraft som behövs för att framkalla en respons 50 % av tiden, med hjälp av en kurvanpassningsalgoritm9. En minskning av den kraft som krävs för att framkalla en tillbakadragen fot jämfört med naiva möss eller djurets egen baslinje indikerar en ökad känslighet hos djuret.
- Mät fotplattan på en konsekvent plats på varje djur med hjälp av 3,61 von Frey-filamentet som när det böjs framkallar 0,4 g kraft (Materialtabell). Följ upp med stimulering med 4.08 von Frey-filamentet som framkallar 1.0 g kraft.
- Testning av tröskelvärde för termisk reflexrespons
OBS: Tröskelvärden för värme- och kylrespons fastställs med Hargreaves respektive kylplattetesterna.- Hargreaves test
- Placera mössen i bås på en glasyta som värms upp med en infraröd sändare underifrån. Anteckna latensen för att dra ut foten som tiden i sekunder från det att stimulus från infrarött ljus (50 °C) från apparaten appliceras på musens baktass fram till dess att stimuleringen dras tillbaka.
- Test av kallplatta
- Placera mössen på kylplattan som kyls till -9 °C. Anteckna latensen för att dra ut foten som tiden i sekunder från det att musen placeras på apparaten tills musen börjar lyfta foten.
- Alternativt kan du placera en kall sond som kyls till -9 °C under musens baktass medan musen är inburad ovanpå ett trådnät. Anteckna latensen för tillbakadragande som tiden i sekunder från det att apparaten placerats under baktassen tills musen börjar lyfta foten, slicka eller skaka. För att undvika att framkalla ett nociceptivt svar, vänj musen vid att vidröras av sonden vid rumstemperatur.
- Hargreaves test
- Kognitions- och känsloberoende beteendeanalyser
OBS: Långvarig överkänslighet hos djur ger emotionell och kognitiv dysfunktion. Dessa mäts vanligtvis endast en gång i vecka 6 efter induktion av smärtmodellen för att undvika övningseffekter.- Ångesttester
OBS: Ångest och depression kan också testas på ett tillförlitligt sätt för att fastställa modellens effektivitet. Det är bäst att vänta till minst vecka 4-6 efter induktionsinjektionen för att låta komorbiditeterna utvecklas. Att föredra mörker framför ljuskammare är ett mått på nociceptionsrelaterad ångest. I noll- eller pluslabyrinttestet tillbringar smärtmodellmöss mindre tid i de öppna kvadranterna än naiva kontrolldjur, en uppvisning av ångestliknande beteende10,11.- Test av ljus/mörk platspreferens: Placera varje djur i testlådan för platspreferens med en passage mellan två kammare (10 x 10 x 10 cm3). En kammare i apparaten är starkt upplyst, medan den motsatta sidan förblir mörk. Under varje 10 minuters test, övervaka djurets plats med dator för att bestämma ljus- och mörkervistelsetider och antalet övergångar.
OBS: Alternativt kan du montera en videokamera över testkammaren och manuellt registrera tiden i varje kammare. - Upphöjda plus- eller nolllabyrinter: placera modellgnagarna eller naiva djuren på labyrinten och använd ett stoppur för att bedöma tiden som spenderas i de stängda delarna av labyrinten. Bestäm tiden som tillbringas i de två muromgärdade "säkra" områdena och två öppna "osäkra" områden. Djur med smärta föredrar stängda säkra områden.
OBS: Ångestliknande beteende kan testas i antingen en noll- eller pluslabyrint (10 min). Nolllabyrinten är ett cirkulärt spår i motsats till pluslabyrinten, som är "plusteckenformad". Båda har två öppna och två slutna kvadranter som möjliggör kontinuerligt utforskande beteende. Båda är upphöjda 1 m från marken, antingen en cirkulär eller plusformad gångväg uppdelad i fyra lika stora kvadranter.
- Test av ljus/mörk platspreferens: Placera varje djur i testlådan för platspreferens med en passage mellan två kammare (10 x 10 x 10 cm3). En kammare i apparaten är starkt upplyst, medan den motsatta sidan förblir mörk. Under varje 10 minuters test, övervaka djurets plats med dator för att bestämma ljus- och mörkervistelsetider och antalet övergångar.
- Sackaros stänk depressionstest
OBS: Sackarostänktestet används för att bestämma depressionsliknande beteende. Stänktestet gör det möjligt att mäta frånvaron av normalt groomingbeteende som ett symptom på depression till följd av kronisk smärta.- Poängsätt frekvensen, varaktigheten och latensen för putsning i 10 minuter efter att ha sprayat en 10-30 % sackaroslösning på ryggpälsen (~250 μL nära svansbasen). Låt förblindade observatörer räkna antalet groomingmanövrar från videobandinspelningar12.
OBS: Detta index har rapporterats påverkas i gnagarmodeller av humörstörningar, såsom kronisk mild stress, och korrigeras av kronisk antidepressiv behandling13.
- Poängsätt frekvensen, varaktigheten och latensen för putsning i 10 minuter efter att ha sprayat en 10-30 % sackaroslösning på ryggpälsen (~250 μL nära svansbasen). Låt förblindade observatörer räkna antalet groomingmanövrar från videobandinspelningar12.
- Test av nya objekt
OBS: Kognitiv dysfunktion är mätbar med det nya objekttestet.- Acklimatisera mössen individuellt till en genomskinlig plastbur med öppen topp (56 x 30 x 20 cm) i 1 timme. Lägg till två identiska leksaksminifigurer i motsatta hörn av buren i 5 minuter.
- På testdagen vänjer du djuren vid den genomskinliga buren igen i 1 timme innan du placerar de två identiska minifigurerna i samma positioner i buren i 5 minuter innan du sätter tillbaka dem i hemburen.
- Ersätt en av de ursprungliga figurerna med ett helt annat nytt föremål, lämna tillbaka mössen till testburen 4 timmar senare och registrera den tid som spenderats på att utforska föremålen.
- Beräkna det rapporterade igenkänningsindexet (RI) som den procentuella tid som ägnas åt att utforska det nya objektet av den totala objektutforskningstiden14.
- Bedömning av motorisk funktion
OBS: Inkblot rörlighets- och gångstörningstest15 bedömer motorisk funktion i ryggsmärtmodellen.- Bygg en tunnel av ett pappershandduksrör som skärs på längden på ena kanten. Sprid ut tunneln på ett rent skrivarpapper.
- Håll mössen försiktigt inlindade i en handduk tills de är lugna. Placera tassarna på en stämpeldyna fuktad med giftfritt indiskt bläck för att täcka dem med bläck eller måla bläcket på undersidan av musens fötter med en bomullspinne. Släpp ut mössen vid tunnelingången och låt dem springa genom tunneln och fånga dem i slutet.
- Poängsätt tassavtryck baserat på tre parametrar: steglängd (det vertikala avståndet från baksidan av ett tryck till nästa), stegbredd (horisontellt avstånd mellan avtryck) och tåavstånd (avståndet mellan tårna på motsatta sidor av tassen).
OBS: Godkända godbitar kan också användas för att uppmuntra musen att komma genom tunneln. Om tassavtrycken är utsmetade eller otydliga måste experimentet upprepas.
- Ångesttester
Figur 4: Mekanisk och termisk överkänslighet efter CBP-induktion. Smärtan är mätbar en vecka efter modellinduktion och kvarstår i 8 veckor. (A) von Frey-testet. Mekanisk tröskeltestning utförs med von Frey-filament applicerade på fotplattan genom ett nätbord med upp-ned-metoden som visas här under loppet av 4 veckor. Den naiva hantröskeln (grön) är dold under den blå linjen för de naiva honmössen. CBP-mössen (n = 4 hanar, 4 honor) uppvisade signifikant ökad mekanisk känslighet jämfört med de naiva kontrollerna (n = 2 hanar, 2 honor). Tvåvägs ANOVA (Dunnett's multiple comparisons test) utfördes på dessa data: n = 4 per grupp. I post-hoc-analyser gav Bonferroni-justering av alla P-värden för jämförelser vecka för vecka av CBP kontra Naive alla 11 värden < 0,0011. p < 0,0001. B) Hargreaves-testet. Värmetröskeln testades på trampdynan med Hargreaves-testet (50 °C). CBP-mössen (n = 12 hanar, 12 honor) visade signifikant ökad värmekänslighet jämfört med de naiva kontrollerna (n = 6 hanar, 6 honor). Mann-Whitneys tvåsidiga t-test utfördes för att testa signifikans (p < 0,0001). (C) Känslighet för kyla. Kallsondtestet utfördes genom att placera möss på kylplatteapparaten som kyldes till -9 °C. Latensen för att dra sig tillbaka registrerades som tiden i sekunder från det att musen placerades på apparaten tills musen börjar lyfta foten, slicka eller skaka. I de data som visades placerades en kall sond som kylts till -9 °C under musens baktass medan musen är inburad ovanpå ett trådnät. Alla möss testades 1-3 veckor efter injektionen. CBP-mössen (n = 4 hanar, 6 honor) visade signifikant ökad köldkänslighet jämfört med de naiva kontrollerna (n = 2 hanar, 4 honor). Mann-Whitneys tvåsidiga t-test utfördes för att testa signifikans (p = 0,0002). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nociceptiv beteendetestning och dataanalys
Åberopade åtgärder
Överkänslighet på trampdynan utvecklas inom ett dygn efter urokinasinjektionen. Inom 1 vecka sänks uttagströskeln avsevärt och kvarstår fram till avlivning; Detta visas till och med vecka 4 efter operationen (Figur 4A). Tassuttagsfördröjning analyseras med hjälp av von Frey upp-ner-metoden9 och Hargreaves-testet. I det plottade exemplet visade möss med CBP (n = 4 hanar, 4 honor) signifikant ökad mekanisk känslighet jämfört med kontroller (n = 2 hanar, 2 honor). Modellen försvinner i vecka 6-7. Detta tidsförlopp gör det möjligt att utvärdera föreningar för att dämpa överkänslighet vid kroniska tidpunkter, motsvarande år av smärterfarenhet hos kliniska patienter. Det reflexiva von Frey-testet kan upprepas flera gånger på en enda dag när effekten av en kortlivad förening fastställs.
von Frey mekaniskt känslighetstest
Trampdynans känslighet, och därmed svårighetsgraden av ryggsmärtmodellen, kvantifieras av antalet abstinenshändelser från graderade von Frey-filament med definierad draghållfasthet. Stimulering med den lägsta fibern (0,008 g, 1,65) är vanligtvis inte detekterbar utom i svåra fall av allodyni; Den största fibern (6,0 g, 4,74) är ungefär lika stor som ett trubbigt gem, och även om den kan kännas av en mus, kommer en naiv mus vanligtvis inte att rygga tillbaka vid applicering. Djuren är fria att frivilligt flytta foten bort från stimulansen. Den genomsnittliga förekomsten av abstinenshändelser uttrycks som antalet svar av fem, där noll indikerar inget uttag och fem indikerar det maximala antalet uttag. Respons på lägre fibrer jämfört med kontroller indikerar ökad känslighet. Efter induktion av denna modell utvecklas statistiskt signifikant mekanisk överkänslighet inom en vecka och kvarstår i flera veckor efter injektion (Figur 4A).
Hargreaves tröskeltest för termisk känslighet
Tillbakadragande av foten på några sekunder efter exponering för IR-inducerad värmestimulus jämförs mellan (bland) grupper. En minskning av uttagsfördröjningen i sekunder tyder på värmeöverkänslighet (figur 4B). Djuren är fria att frivilligt flytta foten bort från stimulansen.
Termisk överkänslighet för kall sond
Ryggsmärtmodellen inducerar köldöverkänslighet på trampdynan. Djuren är fria att frivilligt flytta foten bort från stimulansen. En minskning av abstinensfördröjningen i sekunder tyder på köldöverkänslighet (Figur 4C). Abstinensfördröjningen togs med ett stoppur från det att den kalla stimulansen applicerades på musen som uppvisade ett tillbakadragande beteende, slickande, snärtande eller upprepat lyft av den drabbade baktassen.
Spontana smärtmätningar som inte framkallas
Figur 5: Förändrade icke-framkallade beteendemått. (A) Ångest i CBP-modellen. Den totala tiden som tillbringas i ljuskammaren i ljus/mörker-boxen och antalet uppfödningstillfällen är signifikant lägre hos möss med CBP, vilket tyder på ångest. Envägs ANOVA (Dunnett's multiple comparisons test) utfördes på dessa data: (n = 4 CBP, n = 6 Naive). Tukey post-hoc test utfördes för att bekräfta skillnader mellan specifika gruppmedelvärden. * p < 0,05, ** p < 0,01. (B) Depression i CBP-modellen. Den totala putsningstiden och antalet putsade gånger under sackarostänktestet är signifikant lägre hos möss med CBP, medan tiden innan putsningen påbörjas ökade signifikant. Envägs ANOVA (Dunnett's multiple comparisons test) utfördes på dessa data: (n = 4 CBP, n = 6 Naive). Tukey post-hoc test utfördes för att bekräfta skillnader mellan specifika gruppmedelvärden. * p < 0,05, *** p < 0,001. (C) Stegförändringar hos möss med CBP-modell. Steglängden mellan möss med CBP och naiva möss skilde sig markant. Envägs ANOVA (Dunnett's multiple comparisons test) utfördes på dessa data: n = 4 per grupp. Tukey post-hoc test utfördes för att bekräfta skillnader mellan specifika gruppmedelvärden. ** p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Ljus/mörkt test
En vanlig ljus/mörk kammare kan användas för ångestanalys10. Möss med ryggsmärtmodellen är betydligt mindre benägna att tillbringa tid i ljuskammaren och har färre uppfödningsbeteenden, vilket är en indikation på modellens ångest och svårighetsgrad. Alternativt kan de förhöjda noll- eller pluslabyrinterna användas för att mäta ångestliknande beteenden. Gnagare med en smärtmodell som uppvisar ångestliknande beteende går in i och tillbringar mindre tid i de öppna kvadranterna än naiva kontrolldjur (Figur 5A).
Depressionsliknande beteende
Sackarostänktestet kan användas för att bedöma depressionsliknande beteende i ryggsmärtor modell11. Testet bedömer frånvaron av groomingbeteende som ett tecken på depression till följd av den inducerade smärtmodellen12,13. Möss med ryggsmärtor putsar sig betydligt färre gånger och kortare tid totalt sett, samt tar längre tid på sig att börja putsa sig (fördröjning till putsning) (Figur 5B).
Mobilitetsmotoriskt beteende
Slutligen kan bläckfläckstestet användas för att skilja gångskillnader mellan modellen och kontrollmöss15. Möss med ryggsmärta uppvisar signifikant kortare och bredare steg jämfört med kontrollpersoner (Figur 5C). Mät steglängden för gruppjämförelser och notera skillnaderna i stegutseende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna modell av kronisk ryggsmärta är enkel att framkalla, och överkänslighet som etableras inom 1 vecka kan pågå i upp till (och möjligen längre) 8 veckor. Detta möjliggör noggranna studier av det kroniska smärttillståndet i motsats till andra akuta modeller som bara varar i en vecka eller två. Medan vi visar modellen på möss, kan den uPA-inducerade CBP-modellen också etableras på råttor2. En fördel med modellen är att det förlängda tidsförloppet framkallar utvecklingen av ångest- och depressionsliknande beteenden, som observeras hos patienter med kronisk ländryggssmärta. Med tanke på prevalensen av ryggsmärta16 är det en fördel att kunna utföra i de mer vanligt förekommande musmodellerna inom molekylär smärtforskning.
Denna induktion av en smärtmodell med hjälp av uPA har gjorts på liknande sätt med en intraartikulär injektion för att inducera artros3, men metoden som visas här (intraligament) kan göras snabbare och med mycket mindre risk för skador på musen. Det behövs ingen suturering och ingen risk för blödning på grund av punktering av ledhålan. Eftersom det är en enda injektion med lite förarbete är det också lätt att blinda tekniker för grupper för mer exakta resultat.
Den största begränsningen med denna modell handlar om att mössen ska acklimatiseras ordentligt till von Frey-testet. Faktum är att det rekommenderas att möss acklimatiseras till sitt bås och filamenten minst en vecka före modellinduktion för att säkerställa att ryckresponsen inte beror på att miljön de befinner sig i är ny eller på att de ser något röra sig under fötterna.
Det är viktigt att injektionen görs i ligamenten för att säkerställa maximal respons på urokinas och inte i muskeln som producerar ungefär hälften av responsen. Eftersom injektionen är nära ryggraden är det fortfarande viktigt att övervaka alla möss dagligen efter injektionen i minst 1 vecka för att säkerställa att det inte finns några komplikationer från ingreppet. Om någon mus visar tecken på slöhet, viktminskning, förlamning, onormalt beteende eller överdriven putsning av injektionsstället, överväg att ta bort musen från studien.
Framtida studier kommer att undersöka dorsalrotsganglierna (DRG) med in vitro patch clamp-inspelningar. Flödesanalys kommer att bestämma det neuroimmuna svaret och förekomsten av invaderande inflammatoriska celler i DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga konkurrerande ekonomiska intressen. KNW bekräftar obetald konsultation med NeuroChronix, Bessor Pharma och USA Elixeria BioPharm, Inc.
Acknowledgments
Anslagsfinansiering tillhandahölls av NIH HEAL UG3 NS123958. Bostäderna inspekterades och ackrediterades av AAALAC. Djuren inhystes i Animal Resources Center (ARC) som underhålls av laboratoriepersonalen och personalen vid avdelningen för laboratorie- och djurresurser (DLAR). Procedurerna för beteendetestning är standardmetoder inom området som godkänts av American Pain Society och International Association for the Study of Pain. Metoden för avlivning överensstämmer med rekommendationerna från panelen för eutanasi vid American Veterinary Medical Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals and Consumables | |||
| 70% ethanol | Local Source | ||
| BALB/c mice | Envigo | 20-25 g | |
| Cotton balls | Fisher Scientific | 19-090-702 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 19-062-616 | |
| Isoflurane inhalant anesthetic | MedVet | RXISO-250 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | NGFP7002 | |
| Nitrile exam gloves | Fisher Scientific | ||
| Oxygen tank | Local Source | ||
| Surgical drape, Steri-Drape Utility Sheet, Absorbent Prevention | VWR | 76246-788 | cut into 15 x 15 cm pieces |
| Tygon tubing with 3 mm inner diameter | Grainger | 22XH87 | |
| Equipment | |||
| #11 carbon steel scalpel blades | VWR | 21909-612 | |
| Anesthesia induction chamber | Summit Medical Equipment Company | AS-01-0530-LG | |
| Autoclave | Local Unit | ||
| Biology Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Glass bead sterilizer Germinator 500 | VWR | 102095-946 | |
| IITC Life Sciences Series 8 Model PE34 Hot/Cold Plate Analgesia Meter | IITC | PE34 | |
| Integra Miltex cotton & dressing pliers | Safco Dental Supply | 66-317 | |
| OPTIKA CL31 double arm LED illuminator | New York Microscope Company | OPCL-31 | |
| Plantar Test System with InfraRed Emitter, i. e. Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370-001 and 37370-002 | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | 25607-947 | |
| Small animal heating pad | Valley Vet Supply | 47375 | |
| Student Vannas spring scissors, straight blade | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Table top animal research portable anesthesia workstation “PAM” | Patterson Scientific | AS-01-0007 | |
| Von Frey Filaments | Ugo Basile | 37450-275 |
References
- O'Sullivan, P. B., et al. Back to basics: 10 facts every person should know about back pain. British Journal of Sports Medicine. 54 (12), 698-699 (2020).
- Nauta, H. J., McIlwrath, S. L., Westlund, K. N. Punctate midline myelotomy reduces pain responses in a rat model of lumbar spine pain: evidence that the postsynaptic dorsal column pathway conveys pain from the axial spine. Cureus. 10 (3), 2371 (2018).
- Shuang, F., et al. Establishment of a rat model of lumbar facet joint osteoarthritis using intraarticular injection of urinary plasminogen activator. Scientific Reports. 5 (1), 9828 (2015).
- Reed, N. R., et al. Somatosensory behavioral alterations in a NGF-induced persistent low back pain model. Behavioural Brain Research. 418, 113617 (2022).
- Suh, H. R., Cho, H. -Y., Han, H. C. Development of a novel model of intervertebral disc degeneration by the intradiscal application of monosodium iodoacetate (MIA) in rat. The Spine Journal. 22 (1), 183-192 (2022).
- Kim, H., Hong, J. Y., Lee, J., Jeon, W. -J., Ha, I. -H. IL-1β promotes disc degeneration and inflammation through direct injection of intervertebral disc in a rat lumbar disc herniation model. The Spine Journal. 21 (6), 1031-1041 (2021).
- Millecamps, M., Tajerian, M., Sage, E. H., Stone, L. S. Behavioral signs of chronic back pain in the SPARC-null mouse. Spine. 36 (2), 95-102 (2011).
- La Porta, C., Tappe-Theodor, A. Differential impact of psychological and psychophysical stress on low back pain in mice. Pain. 161 (7), 1442-1458 (2020).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Takao, K., Miyakawa, T. Light/dark transition test for mice. Journal of Visualized Experiments JoVE. (1), e104 (2006).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- David, D. J., et al. Neurogenesis-dependent and -independent effects of fluoxetine in an animal model of anxiety/depression. Neuron. 62 (4), 479-493 (2009).
- Yalcin, I., et al. A time-dependent history of mood disorders in a murine model of neuropathic pain. Biological Psychiatry. 70 (10), 946-953 (2011).
- Madathil, S. K., et al. Astrocyte-specific overexpression of insulin-like growth factor-1 protects hippocampal neurons and reduces behavioral deficits following traumatic brain injury in mice. PloS One. 8 (6), e67204 (2013).
- Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost protocol of footprint analysis and hanging box test for mice applied the chronic restraint stress. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59027 (2019).
- Hassan, S., et al. Identifying chronic low back pain phenotypic domains and characteristics accounting for individual variation: a systematic review. Pain. , (2023).
