Summary
Metoder til enkel, hurtig induktion af en rygsmertemodel hos mus tilvejebringes her ved anvendelse af en intraligamentinjektion af urinplasminogenaktivator.
Abstract
En model af vedvarende lændesmerter kan induceres hos mus med den enkle metode, der er beskrevet heri. Trinvise metoder til enkel, hurtig induktion af en vedvarende rygsmertemodel hos mus tilvejebringes her ved anvendelse af en injektion af plasminogenaktivator af urokinase-typen (urokinase), en serinprotease, der findes hos mennesker og andre dyr. Metoden til induktion af vedvarende lændesmerter hos mus involverer en simpel injektion af urokinase langs ledbåndsindsættelsesområdet i lændehvirvelsøjlen. Det urokinase inflammatoriske middel aktiverer plasminogen til plasmin. Typisk kan modellen induceres inden for 10 minutter, og overfølsomheden vedvarer i mindst 8 uger.
Overfølsomhed, gangforstyrrelser og andre standard angst- og depressionslignende foranstaltninger kan testes i den vedvarende model. Rygsmerter er den mest udbredte type smerte. For at forbedre bevidstheden om rygsmerter udnævnte International Association for the Study of Pain (IASP) 2021 til "Global Year about Back Pain" og 2022 til "Global Year for Translating Pain Knowledge to Practice." En begrænsning af den terapeutiske udvikling af smerteterapi er manglen på egnede modeller til test af vedvarende og kroniske smerter. Funktionerne i denne model er egnede til at teste potentielle behandlinger rettet mod reduktion af rygsmerter og dets hjælpeegenskaber, hvilket bidrager til IASP's navngivning af 2022 som det globale år for oversættelse af smerteviden til praksis.
Introduction
Lændesmerter er en af de mest almindelige årsager til handicap med 1 ud af 5 mennesker, der lider over hele verden1. På trods af disse bestræbelser anvendes få pålidelige dyremodeller af rygsmerter populært i dyreforsøg på smerteområdet, især hos mus. Tidligere modeller har næsten udelukkende gjort brug af rotter til induktion af kroniske rygsmerter (CBP), såsom dem, der induceres ved injektion af urinplasminogenaktivator (uPA) i lændehvirvelsøjlen 2,3, injektion af nervevækstfaktor (NGF) i trunkmuskulatur4 eller mononatriumiodoacetat (MIA)5 eller interleukin-1beta6 injektion i den intravertebrale disk. Selvfølgelig foretrækkes rotter til disse modeller, hovedsageligt på grund af deres større størrelse og lette adgang til injektion af inflammatoriske midler.
For at være klar findes der musemodeller af rygsmerter, såsom SPARC-null-musemodellen for intervertebral diskdegeneration, der blev brugt i mange år7, men disse er dyrere og tidskrævende at etablere end injektionsbaserede modeller. En nylig museundersøgelse etablerede en model for lændesmerter ved at kombinere NGF-injektion i lændemuskler med lodret kronisk fastholdelsesstress8. I den følgende protokol har vi tilpasset den uPA-inducerede CBP-model fra rotter til mus2. Overfølsomhed etableres inden for 1 uge og vedvarer op til 6-8 uger. Derudover fastslår vi, at mus udvikler angst- og depressionslignende adfærd. I betragtning af forekomsten af rygsmerter og den mere almindelige brug af mus i molekylær smerteforskning, er denne holdbare model let etableret til brug i udviklingen af nye behandlingsstrategier til lindring af rygsmerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøg er i overensstemmelse med NIH-vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr. Undersøgelser blev godkendt af det lokale institutionelle pleje- og brugsudvalg (IACUC # 23-201364-HSC) ved University of New Mexico Health Sciences Center. Alle undersøgelser er i overensstemmelse med politikker i regi af en OLAW Assurance of Compliance (A3002-01) om anvendelse af dyr i forskning, som beskrevet i del III. II. Forsikringer og certificeringer. Dyrene er anbragt i Animal Resources Center (ARC) opstaldningsfacilitet, der vedligeholdes af laboratoriepersonalet og Division of Laboratory and Animal Resources (DLAR) personale. Metoden til eutanasi (100 μL af 59 mg / ml pentobarbitalinjektion) er hurtig og pålidelig og giver mulighed for dissektion og indsamling af forskellige væv til yderligere forskning.
1. Dyr
- Hus voksne (~ 3-4 uger gamle) mandlige og kvindelige BALB / c mus (20-25 g) på en omvendt 12 t: 12 h lys: mørk cyklus, så deres aktive tid i mørke sker i laboratoriets arbejdstid.
BEMÆRK: Dette vil gøre det muligt at vurdere alle parametre i dyrenes naturlige aktive tid, da gnavere er naturligt natdyr. Dette reducerer bidraget fra ændringer i døgnrytmen, så dyr kan testes i deres aktive tid, som nu er dagtimerne. - Overvåg dyrene to gange dagligt.
- Oprethold musene på normal museopdrætter chow, som er lavere i sojaproteinindhold sammenlignet med standard gnaverchow (kendt for at ændre overfølsomhed), hvis man vurderer lægemiddeleffekter på smerterelateret adfærd.
- Væg dyrene en gang om ugen for at sikre opretholdelsen af sund vægtforøgelse.
BEMÆRK: Der blev ikke observeret gruppeforskelle i vægt i løbet af de 8-10 ugers undersøgelser, hvilket tillod blinding af studiet.
2. Model induktion
- Udfør modelinduktion på en varm steril plan overflade udstyret med et middel til at fastgøre stabiliseringsfastholdelser for at holde musen på plads (figur 1A). Udfør operationen med et dissektionsmikroskop på en steriliseret overflade.
BEMÆRK: Brug en damphætte af kemisk kvalitet, hvis anæstesiopsamling ikke er tilgængelig. - Brug kirurgisk silke eller endda garn med gummibånd knyttet i enden af strengene, der er fastgjort til pladens ribbede kanter som begrænsninger, hvis du bruger bundpladen, der anbefales i materialetabellen.
- Placer en varmepudegenvindingsstation på en overflade ved siden af operationsopsætningen til overførsel af mus til stationen umiddelbart efter injektion (figur 1B).
BEMÆRK: Placer et tomt husbur på varmepuden mindst 10 minutter før injektion for at lade buret varme op til en behagelig temperatur (37 °C). Placer buret halvt af puden, så den vågne mus foretrækker restitutionstemperaturer. - Forbered urokinasen, fortynd den i sterilt vand. Alkohol rengør Hamilton-sprøjten og skyl i sterilt vand. Tegn opløsningen på forhånd, så musen er under bedøvelse i så kort tid som muligt. Brug 5 μL 2 mg / ml urinplasminogenaktivator til modellen; til skam skal du bruge 5 μL sterilt saltvand.
- Opsæt isoflurabedøvelsesstationen på et niveau på 4% eller mindre til denne korte procedure. Placer musen i induktionskammeret; Typisk vil musens hurtige vejrtrækning aftage inden for 1-2 minutter og bevæge sig fra øvre brystbevægelse til nedre bryst.
- Brug et iltniveau på 1,5 l/min og en F-beholder med aktivt kul, eller arbejd under en biologisk strømning eller overliggende evakueringshætte for at skrubbe isofluran for at undgå eksponering for dyrekirurgen. Hvis det ikke er tilgængeligt, skal du udføre proceduren i en kemisk sikkerhedshætte.
- Skift hurtigt musen og bedøvelsesstrømmen til det kirurgiske område på en 37 ° C opvarmningspude, og placer musens næse i næsekeglen for at opretholde bedøvelsesniveauet (figur 1C, D). Kontroller, at musen ikke har nogen refleksiv bevægelse for at klemme tæerne, og fasthold derefter musen på bundpladen.
BEMÆRK: Hvis der overhovedet er bevægelse, skal du placere musen tilbage i induktionskammeret og gentage dette. - Rengør ryghudområdet med en alkoholserviet. Juster LED-belysningen efter behov for at få et klart overblik over den bedøvede musens bagside.
BEMÆRK: Brug om nødvendigt en elektrisk barbermaskine til at fjerne hår fra musens ryg, så der er frit udsyn til rygsøjlen under huden. Hvis forsøgsmusene barberes, skal du også barbere ryggen af de naive og falske mus til studieblinding. - Injicer musen, mens den er fuldt bedøvet og immobiliseret (ingen oprettende refleks og tåklemmeudtagning). Brug to fingre til forsigtigt at føle, hvor bunden af musens brystkasse møder rygsøjlen (figur 2A). Under dette punkt er tømmerspinalsegmenterne; ret injektionen her mod L2-L3.
- Placer spidsen af Hamilton-sprøjten ved siden af rygsøjlen (figur 2B,C). Ret sprøjten i ~45° vinkel ind i det interspinøse ledbånd umiddelbart ved siden af knoglen.
BEMÆRK: Afhængigt af sejheden af musens hud kan det nogle gange fungere bedre at stole på tyngdekraften i stedet for aktivt tryk og en 90° vinkel. - Stik kanylespidsen forsigtigt, men fast ind i det interspinøse ledbånd (figur 3B,C) .
BEMÆRK: Målet er ikke at bryde bughulen, men at injicere ledbåndet. - Tøm kanylens indhold langsomt. Hvis der på noget tidspunkt er væske ved spidsen, er nålen ikke gennem huden. Fortsæt, indtil alle 5 μL er injiceret.
- Hold nålen på plads i ~5 s for at forhindre tilbageløb fra injektionen. Anvendelse af blåt farvestof i terminale eller akutte pilotforsøg anbefales.
BEMÆRK: Hvis det gøres korrekt, skal væsken spredes ind i ledbåndet som vist (figur 3A). - Fjern nålen forsigtigt og langsomt. Sørg for, at der ikke er blod eller udledning.
- Placer musen i varmegenvindingsstationen med en burtop, indtil den vågner og er mobil, før den returneres til hjemmeburet.
BEMÆRK: Forudsat at proceduren blev udført hurtigt, bør det ikke vare mere end et minut, før musen vågner. - Kontroller musene gennem 1 time efter operationen for at sikre, at al normal motorisk funktion fortsætter som en sikkerhedsforanstaltning.
BEMÆRK: Hvis det gøres korrekt, bør der ikke være komplikationer fra denne procedure. - Kontroller musene dagligt i ugen efter operationen, herunder vægtvurdering og inspektion af injektionsstedet for at sikre, at der ikke er opstået infektion eller komplikationer. Brug ikke musen til yderligere eksperimenter, hvis der er en ændring i adfærd, såsom vægttab og sløvhed.
Figur 1: Opsætning for urokinase CBP-induktion. (A) Fine Science Tools byggeplade, der anbefales til museoperationer. De ribbede kanter kan have kroget snor på dem for at holde musen på plads. (B) Bjærgningsstation. Et tomt husbur anbefales, halvt på varmepuden, halvt slukket. En ren klud placeres på bunden for at give musen et behageligt hvileområde. (C) Anbefaling til opsætning af anæstesimaskine. Brug et tokanals leveringssystem til at oprette en slange til induktionskammeret og en anden til operationsstationen. D) Et billede af musestøtterne. To strenge knyttes på bundpladens ribkanter og trækkes derefter forsigtigt hen over musens hals og bagside. Sørg for ikke at holde musen for stramt, så den stadig kan trække vejret normalt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Induktion af CBP ved intravenøse injektion af urokinase. (A) Et billede af injektionsstedets placering. Som vist skal du føle med fingrene for at finde bunden af musens brystkasse for et referencepunkt for L4-L5. (B) Et billede af injektionsprocessen, der viser vinklen for korrekt injektion. (C) En vinkel på 45° foretrækkes her, men juster efter behov for at sikre, at nålen kommer, hvor den skal. Barber om nødvendigt injektionsstedet for bedre visualisering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Diagram over injektionsstedet. A) Et fotografi af injektionsstedets beliggenhed. Blæk bruges her til at angive, hvor væsken kommer ind i det interspinøse ledbånd mellem L2 og L3 ryghvirvlerne. (B) Et diagram, der viser kanylens korrekte placering og injektionsstedets placering, vist fra siden. C) Et diagram, der viser ryghvirvlerne oppefra og ned og injektionsstederne for de interspinøse ledbånd. Injektioner vil typisk være på de interspinøse ledbånd ved siden af rygsøjlen, men nålen kan også indsættes i mellemrummet mellem og tværgående ryghvirvler. Det anbefales at anvende blåt farvestof i pilotforsøg som vist i punkt A. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Adfærdsmæssige assays
- von Frey mekanisk refleksresponstærskeltest
BEMÆRK: Mekanisk tilbagetrækningstærskel er den minimale kraft, der er nødvendig for at fremkalde et svar 50% af tiden med en serie på 8 von Frey monofilamenter klassificeret i diameter med ~ 0,2 g stigninger, hvilket giver logtrinændringer i mekanisk kraft (Materialetabel).- Test mekanisk stimulering med von Frey fibre påført bagpoten, lumbosakrale nervers innerveringsområde. Bestem baseline pote tilbagetrækning værdier før operationen. Efter operationen bestemmes den mekaniske tærskel en gang om ugen under det kroniske eksperiment.
- Flyt dyrene fra staldrummet og akklimatisere dem i testrummet i 30 minutter i deres hjemmebure inden testning. Derefter flyttes dyrene for at fastholde dem individuelt i små klare kabiner på testbordet med skærmtop i 15-20 minutter afhængigt af deres aktivitetsniveau.
BEMÆRK: Testen kan begynde, når musene har fundet sig til rette i hvilestilling og ikke drejer og bevæger sig i kammeret. Akklimatisering til fastholdelseskabinen minimerer stressinducerede virkninger. Hvis mus er blevet opretholdt på en omvendt lyscyklus, skal testen udføres under røde lysforhold. - Fortsæt med test ved hjælp af graduerede serier af von Frey-fibre som beskrevet nedenfor og i Chaplan et al.9.
- Undersøg fodpuden på et ensartet sted på hvert dyr ved hjælp af 3,61 von Frey-filamentet, som, når det bøjes, fremkalder 0,4 g kraft (materialetabel). Følg med stimulering med 4.08 von Frey-filamentet, der fremkalder 1.0 g kraft.
BEMÆRK: Ingen af disse fibre fremkalder reaktioner hos naive, akklimatiserede dyr. - Påfør hver filament 5x med >5 s intervaller vinkelret på fodpuden, og pas på ikke at røre ved en fold/sprække eller hår. Et positivt svar er en fodtilbagetrækning til tre af fem stimuli. Påfør den næste svagere filament i serien, indtil dyret ikke reagerer på den mekaniske stimulering; På det tidspunkt skal du bruge det næste højere filament. Hvis det fremkalder en reaktion, skal du bruge det nederste filament igen, indtil fire forsøg er blevet anvendt efter ændringen af respons på mekanisk stimulering af fodpuden.
- Brug det resulterende responsmønster til at beregne den mekaniske tilbagetrækningstærskel, den minimale mængde kraft, der er nødvendig for at fremkalde et svar 50% af tiden, ved hjælp af en kurvetilpasningsalgoritme9. Et fald i den kraft, der kræves for at fremkalde en fodtilbagetrækningsrespons sammenlignet med naive mus eller dyrets egen baseline, indikerer en øget følsomhed hos dyret.
- Undersøg fodpuden på et ensartet sted på hvert dyr ved hjælp af 3,61 von Frey-filamentet, som, når det bøjes, fremkalder 0,4 g kraft (materialetabel). Følg med stimulering med 4.08 von Frey-filamentet, der fremkalder 1.0 g kraft.
- Test af termisk refleksresponstærskel
BEMÆRK: Varme- og kulderesponstærskler konstateres med henholdsvis Hargreaves- og koldpladetestene.- Hargreaves test
- Placer musene i kabiner på en glasoverflade, der opvarmes med en infrarød emitter nedenfra. Registrer latenstiden for at trække foden tilbage som tiden i sekunder fra påføring af det infrarøde lys (50 °C) stimulus fra apparatet på musens bagpote til tilbagetrækningen fra stimuleringen.
- Test af kold plade
- Musene anbringes på koldpladeapparatet, der er afkølet til -9 °C. Registrer latenstiden for at trække foden tilbage som tiden i sekunder fra musens placering på apparatet, indtil musen begynder at løfte foden.
- Alternativt kan du placere en kold sonde afkølet til -9 °C under musens bagpote, mens musen er buret oven på et trådnet. Registrer latenstiden for at trække sig tilbage som tiden i sekunder fra placering af apparatet under bagpoten, indtil musen begynder at løfte, slikke eller ryste. For at undgå at fremkalde et nociceptivt respons skal du akklimatisere musen til at blive rørt af sonden ved stuetemperatur.
- Hargreaves test
- Kognitions- og følelsesafhængige adfærdsmæssige assays
BEMÆRK: Langvarig overfølsomhed hos dyr producerer følelsesmæssig og kognitionsafhængig dysfunktion. Disse måles typisk kun én gang i uge 6 efter smertemodelinduktion for at undgå praksiseffekter.- Angsttest
BEMÆRK: Angst og depression kan også pålideligt testes for at fastslå effektiviteten af modellen. Det er bedst at vente til mindst uge 4-6 efter induktionsinjektionen for at tillade comorbiditeterne at udvikle sig. Præference for mørket frem for det lyse kammer er et mål for nociceptionsrelateret angst. I nul- eller pluslabyrinttesten bruger smertemodelmus mindre tid i de åbne kvadranter end naive kontroldyr, en visning af angstlignende adfærd10,11.- Lys/mørk stedpræferencetest: placer hvert dyr i stedpræferencetestboksen med en passage mellem to kamre (10 x 10 x 10 cm3). Et kammer i apparatet er stærkt oplyst, mens den modsatte side forbliver mørk. I løbet af hver 10 minutters test skal du overvåge dyrets placering via computer for at bestemme lyse og mørke belægningstider og antallet af overgange.
BEMÆRK: Alternativt kan du montere et videokamera over testkammeret og manuelt registrere den tid, der bruges i hvert kammer. - Forhøjede plus eller nul labyrinter: Placer modellen gnavere eller naive dyr på labyrinten og brug et stopur til at vurdere den tid, der bruges i de lukkede dele af labyrinten. Bestem den tid, der bruges i de to murede "sikre" områder og to åbne "usikre" områder. Dyr med smerte foretrækker lukkede sikre områder.
BEMÆRK: Angstlignende adfærd kan testes i enten en nul- eller pluslabyrint (10 min). Nullabyrinten er et cirkulært spor i modsætning til pluslabyrinten, som er "plustegnformet". Begge har to åbne og to lukkede kvadranter, der giver mulighed for kontinuerlig udforskende adfærd. Begge er hævet 1 m fra jorden, enten en cirkulær eller plusformet gangbro opdelt i fire lige store kvadranter.
- Lys/mørk stedpræferencetest: placer hvert dyr i stedpræferencetestboksen med en passage mellem to kamre (10 x 10 x 10 cm3). Et kammer i apparatet er stærkt oplyst, mens den modsatte side forbliver mørk. I løbet af hver 10 minutters test skal du overvåge dyrets placering via computer for at bestemme lyse og mørke belægningstider og antallet af overgange.
- Saccharose splash depression test
BEMÆRK: Saccharose-stænktesten bruges til at bestemme depressionslignende adfærd. Stænktesten gør det muligt at måle fraværet af normal plejeadfærd som et symptom på depression som følge af kronisk smerte.- Bedøm hyppigheden, varigheden og latenstiden for pleje i 10 minutter efter sprøjtning af en 10-30% saccharoseopløsning på dorsalcoaten (~ 250 μL nær bunden af halen). Har blindede observatører talt antallet af plejemanøvrer fra videobåndoptagelser12.
BEMÆRK: Dette indeks er rapporteret at være påvirket i gnavermodeller af humørsygdomme, såsom kronisk mild stress, og korrigeres ved kronisk antidepressiv behandling13.
- Bedøm hyppigheden, varigheden og latenstiden for pleje i 10 minutter efter sprøjtning af en 10-30% saccharoseopløsning på dorsalcoaten (~ 250 μL nær bunden af halen). Har blindede observatører talt antallet af plejemanøvrer fra videobåndoptagelser12.
- Test af nye objekter
BEMÆRK: Kognitiv dysfunktion kan måles med den nye objekttest.- Akklimatisere mus individuelt til et klart plastbur med en åben top (56 x 30 x 20 cm) i 1 time. Tilføj to identiske legetøjsminifigurer i hvert sit hjørne af buret i 5 min.
- På testdagen skal dyrene anbringes i det klare bur igen i 1 time, inden de to identiske minifigurer placeres i samme position i buret i 5 minutter, før de sættes tilbage i hjemmeburet.
- Udskift en af de originale figurer med et tydeligt anderledes nyt objekt, returner musene til testburet 4 timer senere, og registrer den tid, der bruges på at udforske objekterne.
- Beregn det rapporterede genkendelsesindeks (RI) som den procentvise tid, der bruges på at udforske det nye objekt af den samlede objektudforskningstid14.
- Vurdering af motorisk funktion
BEMÆRK: Inkblot-mobilitets- og gangforstyrrelsestesten15 vurderer motorfunktionen i rygsmertemodellen.- Konstruer en tunnel fra et papirhåndklæderør skåret i længderetningen på den ene kant. Spred tunnelen ud på et rent stykke printerpapir.
- Hold musene forsigtigt pakket ind i et håndklæde, indtil de er rolige. Placer poterne på en stempelpude, der er våd med giftfri indisk blæk for at belægge dem med blæk, eller mal blækket på bunden af musens fødder ved hjælp af en vatpind. Slip musene løs ved tunnelindgangen og lad dem løbe gennem tunnelen og fange dem i slutningen.
- Score poteaftryk baseret på tre parametre: skridtlængde (den lodrette afstand fra bagenden af et print til det næste), skridtbredde (vandret afstand mellem udskrifter) og tåspredning (afstanden mellem tæerne på de modsatte sider af poten).
BEMÆRK: Godkendte godbidder kan også bruges til at tilskynde musen til at komme gennem tunnelen. Hvis poteaftryk er smurt eller uklart, skal eksperimentet gentages.
- Angsttest
Figur 4: Mekanisk og termisk overfølsomhed efter CBP-induktion. Smerter kan måles en uge efter modelinduktion og vedvarer i 8 uger. (A) von Frey-testen. Mekanisk tærskeltest udføres med von Frey-filamenter påført fodpuden gennem et netbord med op-ned-metoden som vist her i løbet af 4 uger. Den naive hantærskel (grøn) er skjult under den blå linje for de naive hunmus. CBP-musene (n = 4 hanner, 4 hunner) viste signifikant øget mekanisk følsomhed sammenlignet med de naive kontroller (n = 2 hanner, 2 hunner). Tovejs ANOVA (Dunnetts multiple sammenligningstest) blev udført på disse data: n = 4 pr. Gruppe. I post-hoc analyser gav Bonferroni-justering af alle P-værdier for uge-for-uge sammenligninger af CBP versus Naive alle 11 værdier < 0,0011. p < 0,0001. (B) Hargreaves-testen. Varmetærsklen blev testet på fodpuden med Hargreaves-testen (50 °C). CBP-musene (n = 12 hanner, 12 hunner) viste signifikant øget varmefølsomhed sammenlignet med de naive kontroller (n = 6 hanner, 6 hunner). Mann-Whitney to-tailed t-test blev udført for at teste signifikans (p < 0,0001). (C) Følsomhed over for kulde. Koldsondetesten blev udført ved at placere mus på koldpladeapparatet, der var afkølet til -9 °C. Latency til tilbagetrækning blev registreret som tiden i sekunder fra musens placering på apparatet, indtil musen begynder at løfte, slikke eller ryste. I de viste data blev en kold sonde afkølet til -9 °C placeret under musens bagpote, mens musen er buret oven på et trådnet. Alle mus blev testet 1-3 uger efter injektionen. CBP-musene (n = 4 hanner, 6 hunner) viste signifikant øget kuldefølsomhed sammenlignet med de naive kontroller (n = 2 hanner, 4 hunner). Mann-Whitney to-sidet t-test blev udført for at teste signifikans (p = 0,0002). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nociceptiv-relateret adfærdstest og dataanalyse
Fremkaldte foranstaltninger
Overfølsomhed på fodpuden udvikler sig inden for en dag efter urokinaseinjektion. Inden for 1 uge sænkes tilbagetrækningstærsklen betydeligt og fortsætter indtil eutanasi; Dette er vist gennem postkirurgisk uge 4 (figur 4A). Pote tilbagetrækning latens analyseres ved hjælp af von Frey op-ned metode9 og Hargreaves test. I det afbildede eksempel viste mus med CBP (n = 4 hanner, 4 hunner) signifikant øget mekanisk følsomhed sammenlignet med kontroller (n = 2 hanner, 2 hunner). Modellen forsvinder i uge 6-7. Dette tidsforløb tillader evaluering af forbindelser til at dæmpe overfølsomhed på kroniske tidspunkter, svarende til mange års smerteerfaring hos kliniske patienter. Den refleksive von Frey-test kan gentages flere gange på en enkelt dag, når effekten af en kortvarig forbindelse bestemmes.
von Frey mekanisk følsomhedstest
Fodpudens følsomhed og dermed sværhedsgraden af rygsmertemodellen kvantificeres ved antallet af abstinenshændelser fra klassificerede von Frey-filamenter med defineret trækstyrke. Stimulering med den laveste fiber (0,008 g, 1,65) kan normalt ikke påvises undtagen i alvorlige tilfælde af allodyni; Den største fiber (6,0 g, 4,74) er på størrelse med en stump papirclipsen, og selvom det kan mærkes af en mus, vil en naiv mus normalt ikke vige ved påføring. Dyr er fri til frivilligt at flytte deres fod væk fra stimulansen. Den gennemsnitlige forekomst af tilbagetrækningshændelser udtrykkes som antallet af svar ud af fem, hvor nul angiver ingen tilbagetrækning, og fem angiver det maksimale antal tilbagetrækninger. Reaktioner på lavere fibre sammenlignet med kontroller indikerer øget følsomhed. Efter induktion af denne model udvikles statistisk signifikant mekanisk overfølsomhed inden for en uge og vedvarer i flere uger efter injektion (figur 4A).
Hargreaves termisk følsomhedstærskeltest
Tilbagetrækning af foden i sekunder efter eksponering for IR-induceret varmestimulus sammenlignes mellem (blandt) grupper. Et fald i tilbagetrækningslatenstiden i sekunder indikerer varmeoverfølsomhed (figur 4B). Dyr er fri til frivilligt at flytte deres fod væk fra stimulansen.
Termisk overfølsomhed ved kold sonde
Rygsmertemodellen inducerer kold overfølsomhed på fodpuden. Dyr er fri til frivilligt at flytte deres fod væk fra stimulansen. Et fald i tilbagetrækningslatenstiden i sekunder indikerer kold overfølsomhed (figur 4C). Tilbagetrækningsforsinkelse blev taget med et stopur fra, når den kolde stimulus blev påført musen, der udviste en tilbagetrækningsadfærd, slikning, flicking eller gentagen løft af den berørte bagpote.
Ikke-fremkaldte spontane smerteforanstaltninger
Figur 5: Ændrede ikke-fremkaldte adfærdsmæssige foranstaltninger. (A) Angst i CBP-modellen. Den samlede tid brugt i lyskammeret i den lyse / mørke boks og antallet af opdrætshændelser er signifikant lavere hos mus med CBP, hvilket indikerer angst. Envejs ANOVA (Dunnetts multiple sammenligningstest) blev udført på disse data: (n = 4 CBP, n = 6 Naive). Tukey post-hoc test blev udført for at bekræfte forskelle mellem specifikke gruppemidler. * p < 0,05, ** p < 0,01. (B) Depression i CBP-modellen. Den samlede tid brugt på pleje og antallet af gange, der plejes under saccharose-stænktesten, er signifikant lavere hos mus med CBP, mens tiden før plejestart blev signifikant øget. Envejs ANOVA (Dunnetts multiple sammenligningstest) blev udført på disse data: (n = 4 CBP, n = 6 Naive). Tukey post-hoc test blev udført for at bekræfte forskelle mellem specifikke gruppemidler. * p < 0,05, *** p < 0,001. (C) Stride ændringer i mus med CBP model. Skridtlængden mellem mus med CBP og naive mus var signifikant forskellig. One-way ANOVA (Dunnetts multiple sammenligningstest) blev udført på disse data: n = 4 pr. Gruppe. Tukey post-hoc test blev udført for at bekræfte forskelle mellem specifikke gruppemidler. ** p < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Lys/mørk test
Et standard lys / mørkt kammer kan bruges til angstanalyse10. Mus med rygsmertermodellen er signifikant mindre tilbøjelige til at tilbringe tid i lyskammeret og har færre opdrætsadfærd, hvilket er tegn på angst og sværhedsgraden af modellen. Alternativt kan de forhøjede nul- eller pluslabyrinter bruges til at måle angstlignende adfærd. Gnavere med en smertemodel, der viser angstlignende adfærd, kommer ind og bruger mindre tid i de åbne kvadranter end naive kontroldyr (figur 5A).
Depression-lignende adfærd
Saccharose-stænktesten kan bruges til at vurdere depressionslignende adfærd i rygsmerter model11. Testen vurderer fraværet af plejeadfærd som et tegn på depression som følge af den inducerede smertemodel12,13. Mus med rygsmerter plejer betydeligt færre gange og i kortere tid generelt, samt tager længere tid at begynde pleje (latenstid til pleje) (figur 5B).
Mobilitet motorisk adfærd
Endelig kan inkblot-testen bruges til at skelne gangforskelle mellem modellen og kontrolmus15. Mus med rygsmerter viser signifikant kortere og bredere skridt sammenlignet med kontroller (figur 5C). Mål skridtlængden til gruppesammenligninger, og bemærk forskellene i skridtudseende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne model af kroniske rygsmerter er enkel at inducere, og overfølsomhed etableret inden for 1 uge kan vare i op til (og muligvis ud over) 8 uger. Dette giver mulighed for nøjagtig undersøgelse af kronisk smertetilstand i modsætning til andre akutte modeller, der kun varer i en uge eller to. Mens vi viser modellen i mus, kan den uPA-inducerede CBP-model også etableres i rotter2. En fordel ved modellen er, at det langvarige tidsforløb fremkalder udviklingen af angst- og depressionslignende adfærd, som observeres hos patienter med kroniske lændesmerter. I betragtning af forekomsten af rygsmerter16 er evnen til at blive udført i de mere almindeligt anvendte musemodeller i molekylær smerteforskning en fordel.
Denne induktion af en smertemodel ved hjælp af uPA er gjort på samme måde med en intraartikulær injektion for at inducere slidgigt3, men metoden vist her (intraligament) kan gøres hurtigere og med langt mindre risiko for skader på musen. Der er ingen suturering nødvendig, og ingen risiko for udblødning på grund af punktering af ledhulen. Da det er en enkelt injektion med lidt forberedende arbejde, er det også let at blinde teknikere til grupper for mere nøjagtige resultater.
Hovedbegrænsningen ved denne model involverer korrekt akklimatisering af musene til von Frey-testen; Faktisk anbefales det, at mus akklimatiseres til deres kabine og filamenterne mindst en uge før modelinduktion for at sikre, at flinchresponsen ikke skyldes nyheden i det miljø, de er i, eller på grund af at se noget bevæge sig under deres fødder.
Det er afgørende, at injektionen foretages i ledbåndene for at sikre maksimal respons på urokinase og ikke i musklen, der producerer omkring halvdelen af responsen. Da injektionen er tæt på rygsøjlen, er det stadig vigtigt at overvåge alle mus dagligt efter injektionen i mindst 1 uge for at sikre, at der ikke er komplikationer fra proceduren. Hvis en mus viser tegn på sløvhed, vægttab, lammelse, unormal adfærd eller overdreven pleje af injektionsstedet, skal du overveje at fjerne musen fra undersøgelsen.
Fremtidige undersøgelser vil undersøge dorsalrodsganglierne (DRG) med in vitro patch clamp-optagelser. Flowanalyse vil bestemme det neuroimmune respons og tilstedeværelsen af invaderende inflammatoriske celler i DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser. KNW anerkender ubetalt konsultation med NeuroChronix, Bessor Pharma og USA Elixeria BioPharm, Inc.
Acknowledgments
Tilskudsfinansiering blev leveret af NIH HEAL UG3 NS123958. Boligfaciliteterne blev inspiceret og akkrediteret af AAALAC. Dyrene blev anbragt i Animal Resources Center (ARC) opstaldningsfaciliteter, der blev vedligeholdt af laboratoriepersonalet og Division of Laboratory and Animal Resources (DLAR) personale. Procedurerne for adfærdstest er standardmetoder på området som godkendt af American Pain Society og International Association for Study of Pain. Metoden til eutanasi er i overensstemmelse med anbefalingerne fra panelet om eutanasi fra American Veterinary Medical Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals and Consumables | |||
| 70% ethanol | Local Source | ||
| BALB/c mice | Envigo | 20-25 g | |
| Cotton balls | Fisher Scientific | 19-090-702 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 19-062-616 | |
| Isoflurane inhalant anesthetic | MedVet | RXISO-250 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | NGFP7002 | |
| Nitrile exam gloves | Fisher Scientific | ||
| Oxygen tank | Local Source | ||
| Surgical drape, Steri-Drape Utility Sheet, Absorbent Prevention | VWR | 76246-788 | cut into 15 x 15 cm pieces |
| Tygon tubing with 3 mm inner diameter | Grainger | 22XH87 | |
| Equipment | |||
| #11 carbon steel scalpel blades | VWR | 21909-612 | |
| Anesthesia induction chamber | Summit Medical Equipment Company | AS-01-0530-LG | |
| Autoclave | Local Unit | ||
| Biology Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Glass bead sterilizer Germinator 500 | VWR | 102095-946 | |
| IITC Life Sciences Series 8 Model PE34 Hot/Cold Plate Analgesia Meter | IITC | PE34 | |
| Integra Miltex cotton & dressing pliers | Safco Dental Supply | 66-317 | |
| OPTIKA CL31 double arm LED illuminator | New York Microscope Company | OPCL-31 | |
| Plantar Test System with InfraRed Emitter, i. e. Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370-001 and 37370-002 | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | 25607-947 | |
| Small animal heating pad | Valley Vet Supply | 47375 | |
| Student Vannas spring scissors, straight blade | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Table top animal research portable anesthesia workstation “PAM” | Patterson Scientific | AS-01-0007 | |
| Von Frey Filaments | Ugo Basile | 37450-275 |
References
- O'Sullivan, P. B., et al. Back to basics: 10 facts every person should know about back pain. British Journal of Sports Medicine. 54 (12), 698-699 (2020).
- Nauta, H. J., McIlwrath, S. L., Westlund, K. N. Punctate midline myelotomy reduces pain responses in a rat model of lumbar spine pain: evidence that the postsynaptic dorsal column pathway conveys pain from the axial spine. Cureus. 10 (3), 2371 (2018).
- Shuang, F., et al. Establishment of a rat model of lumbar facet joint osteoarthritis using intraarticular injection of urinary plasminogen activator. Scientific Reports. 5 (1), 9828 (2015).
- Reed, N. R., et al. Somatosensory behavioral alterations in a NGF-induced persistent low back pain model. Behavioural Brain Research. 418, 113617 (2022).
- Suh, H. R., Cho, H. -Y., Han, H. C. Development of a novel model of intervertebral disc degeneration by the intradiscal application of monosodium iodoacetate (MIA) in rat. The Spine Journal. 22 (1), 183-192 (2022).
- Kim, H., Hong, J. Y., Lee, J., Jeon, W. -J., Ha, I. -H. IL-1β promotes disc degeneration and inflammation through direct injection of intervertebral disc in a rat lumbar disc herniation model. The Spine Journal. 21 (6), 1031-1041 (2021).
- Millecamps, M., Tajerian, M., Sage, E. H., Stone, L. S. Behavioral signs of chronic back pain in the SPARC-null mouse. Spine. 36 (2), 95-102 (2011).
- La Porta, C., Tappe-Theodor, A. Differential impact of psychological and psychophysical stress on low back pain in mice. Pain. 161 (7), 1442-1458 (2020).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Takao, K., Miyakawa, T. Light/dark transition test for mice. Journal of Visualized Experiments JoVE. (1), e104 (2006).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- David, D. J., et al. Neurogenesis-dependent and -independent effects of fluoxetine in an animal model of anxiety/depression. Neuron. 62 (4), 479-493 (2009).
- Yalcin, I., et al. A time-dependent history of mood disorders in a murine model of neuropathic pain. Biological Psychiatry. 70 (10), 946-953 (2011).
- Madathil, S. K., et al. Astrocyte-specific overexpression of insulin-like growth factor-1 protects hippocampal neurons and reduces behavioral deficits following traumatic brain injury in mice. PloS One. 8 (6), e67204 (2013).
- Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost protocol of footprint analysis and hanging box test for mice applied the chronic restraint stress. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59027 (2019).
- Hassan, S., et al. Identifying chronic low back pain phenotypic domains and characteristics accounting for individual variation: a systematic review. Pain. , (2023).
