Summary
Methoden voor eenvoudige, snelle inductie van een rugpijnmodel bij muizen worden hier gegeven met behulp van een intraligamentaire injectie van urineplasminogeenactivator.
Abstract
Een model van aanhoudende lage rugpijn kan bij muizen worden geïnduceerd met de eenvoudige methodologie die hierin wordt beschreven. Stap-voor-stap methoden voor eenvoudige, snelle inductie van een persisterend rugpijnmodel bij muizen worden hier gegeven met behulp van een injectie van urokinase-type plasminogeenactivator (urokinase), een serineprotease dat aanwezig is bij mensen en andere dieren. De methodologie voor inductie van aanhoudende lage rugpijn bij muizen omvat een eenvoudige injectie van urokinase langs het ligamenteuze insertiegebied van de lumbale wervelkolom. Het urokinase-ontstekingsmiddel activeert plasminogeen tot plasmine. Doorgaans kan het model binnen 10 minuten worden geïnduceerd en houdt de overgevoeligheid ten minste 8 weken aan.
Overgevoeligheid, loopstoornissen en andere standaard angst- en depressie-achtige maatregelen kunnen worden getest in het persistente model. Rugpijn is de meest voorkomende vorm van pijn. Om het bewustzijn van rugpijn te verbeteren, heeft de International Association for the Study of Pain (IASP) 2021 uitgeroepen tot het "Global Year about Back Pain" en 2022 tot het "Global Year for Translating Pain Knowledge to Practice". Een beperking van de therapeutische vooruitgang van pijntherapieën is het gebrek aan geschikte modellen voor het testen van aanhoudende en chronische pijn. De kenmerken van dit model zijn geschikt voor het testen van potentiële therapieën gericht op de vermindering van rugpijn en de bijbehorende kenmerken, wat ertoe bijdraagt dat IASP 2022 heeft uitgeroepen tot het wereldwijde jaar voor het vertalen van pijnkennis naar de praktijk.
Introduction
Lage rugpijn is een van de meest voorkomende oorzaken van invaliditeit: wereldwijd lijdt 1 op de 5 mensen aan1. Ondanks deze inspanningen worden in de volksmond maar weinig betrouwbare diermodellen van rugpijn gebruikt in dieronderzoek op het gebied van pijn, vooral bij muizen. Eerdere modellen hebben bijna uitsluitend gebruik gemaakt van ratten voor de inductie van chronische rugpijn (CBP), zoals die veroorzaakt door injectie van urineplasminogeenactivator (uPA) in het lumbale facetgewricht 2,3, injectie van zenuwgroeifactor (NGF) in rompmusculatuur4, of mononatriumjodoacetaat (MIA)5 of interleukine-1beta6 injectie in de tussenwervelschijf. Natuurlijk hebben ratten de voorkeur voor deze modellen, voornamelijk vanwege hun grotere formaat en gemakkelijke toegang voor injectie van ontstekingsmiddelen.
Voor alle duidelijkheid: er bestaan wel muismodellen van rugpijn, zoals het SPARC-null muismodel van degeneratie van de tussenwervelschijf dat al vele jaren wordt gebruikt7, maar deze zijn duurder en tijdrovender om op te stellen dan op injectie gebaseerde modellen. Een recente muizenstudie heeft een model van lage rugpijn vastgesteld door NGF-injectie in lage rugspieren te combineren met verticale chronische fixatiestress8. In het volgende protocol hebben we het uPA-geïnduceerde CBP-model van ratten aangepast voor muizen2. Overgevoeligheid wordt binnen 1 week vastgesteld en houdt tot 6-8 weken aan. Daarnaast stellen we vast dat muizen angst- en depressie-achtig gedrag ontwikkelen. Gezien de prevalentie van rugpijn en het meer algemene gebruik van muizen in moleculair pijnonderzoek, is dit duurzame model gemakkelijk vast te stellen voor gebruik bij de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën voor verlichting van rugpijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven dierproeven zijn in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Studies werden goedgekeurd door de lokale Institutional Care and Use Committee (IACUC #23-201364-HSC) van het Health Sciences Center van de Universiteit van New Mexico. Alle studies voldoen aan het beleid onder auspiciën van een OLAW Assurance of Compliance (A3002-01) inzake het gebruik van dieren in onderzoek, zoals beschreven in deel III. II. Garanties en certificeringen. De dieren worden gehuisvest in de huisvestingsfaciliteit van het Animal Resources Center (ARC) die wordt onderhouden door het laboratoriumpersoneel en het personeel van de Division of Laboratory and Animal Resources (DLAR). De methode van euthanasie (100 μL van 59 mg/ml pentobarbital-injectie) is snel en betrouwbaar en maakt het mogelijk om verschillende weefsels te dissectieren en te verzamelen voor verder onderzoek.
1. Dieren
- Volwassen (~3-4 weken oud) mannelijke en vrouwelijke BALB/c-muizen (20-25 g) op een omgekeerde 12 uur:12 uur licht:donkercyclus, dus hun actieve tijd in het donker vindt plaats tijdens de werkuren van het laboratorium.
OPMERKING: Dit maakt het mogelijk om alle parameters te beoordelen tijdens de natuurlijke actieve tijd van de dieren, aangezien knaagdieren van nature nachtdieren zijn. Dit vermindert de bijdrage van veranderingen in de circadiane klok, zodat dieren kunnen worden getest tijdens hun actieve tijd, die nu overdag is. - Houd de dieren twee keer per dag in de gaten.
- Handhaaf de muizen op normaal muizenfokvoer, dat een lager soja-eiwitgehalte heeft in vergelijking met standaard knaagdiervoer (waarvan bekend is dat het de overgevoeligheid verandert) bij het beoordelen van geneesmiddeleffecten op pijngerelateerd gedrag.
- Weeg de dieren één keer per week om ervoor te zorgen dat ze een gezonde gewichtstoename behouden.
OPMERKING: Er werden geen groepsverschillen in gewicht waargenomen tijdens de 8-10 weken durende studies, waardoor studieblindering mogelijk was.
2. Model inductie
- Voer modelinductie uit op een warm, steriel, plat oppervlak dat is voorzien van een middel om stabilisatiebeperkingen te bevestigen om de muis op zijn plaats te houden (Figuur 1A). Voer de operatie uit met een dissectiemicroscoop op een gesteriliseerd oppervlak.
NOTITIE: Gebruik een zuurkast van chemische kwaliteit als er geen anesthesie-opname beschikbaar is. - Gebruik chirurgische zijde of zelfs garen met elastiekjes geknoopt aan het uiteinde van de touwtjes die aan de geribbelde randen van de plaat zijn gehaakt als beperkingen als u de grondplaat gebruikt die wordt aanbevolen in de Materiaaltabel.
- Plaats een herstelstation voor verwarmingskussen op een oppervlak naast de operatieopstelling voor het overbrengen van muizen naar het station onmiddellijk na injectie (Figuur 1B).
OPMERKING: Plaats ten minste 10 minuten voor de injectie een lege kooi op het verwarmingskussen om de kooi op te warmen tot een comfortabele temperatuur (37 °C). Plaats de kooi half van de pad, zodat de wakkere muis een voorkeur heeft voor hersteltemperaturen. - Bereid het urokinase voor en verdun het in steriel water. Reinig de Hamilton-spuit met alcohol en spoel af met steriel water. Zuig de oplossing van tevoren op, zodat de muis zo kort mogelijk onder narcose is. Gebruik 5 μL van 2 mg/ml plasminogeenactivator voor de urine voor het model; gebruik voor schijnvertoningen 5 μL steriele zoutoplossing.
- Stel het isofluraan-anesthesiestation in op een niveau van 4% of minder voor deze korte procedure. Plaats de muis in de inductiekamer; Doorgaans vertraagt de snelle ademhalingsfrequentie van de muis binnen 1-2 minuten, van de beweging van de bovenborst naar de onderborst.
- Gebruik een zuurstofgehalte van 1.5 l/min en een F-bus met actieve kool of werk onder een biologische stroom of een evacuatiekap boven het hoofd om de isofluraan te schrobben om blootstelling aan de dierchirurg te voorkomen. Als de procedure niet beschikbaar is, voer de procedure dan uit in een chemische veiligheidskap.
- Schakel de muis- en anesthesiestroom snel over naar het operatiegebied op een verwarmingskussen van 37°C, waarbij u de neus van de muis in de neuskegel plaatst om het anesthesieniveau te handhaven (Figuur 1C,D). Controleer of de muis geen reflexieve beweging heeft om de teen te beknellen en zet de muis vervolgens vast op de grondplaat.
NOTITIE: Als er überhaupt beweging is, plaatst u de muis terug in de inductiekamer en herhaalt u dit. - Reinig de achterkant van de huid met een alcoholdoekje. Pas de LED-verlichting naar behoefte aan om een duidelijk zicht te hebben op de rug van de verdoofde muis.
NOTITIE: Gebruik indien nodig een elektrisch scheerapparaat om haar van de rug van de muis te verwijderen, zodat er een onbelemmerd zicht is op de ribbels van de wervelkolom onder de huid. Als de experimentele muizen worden geschoren, scheer dan ook de rug van de naïeve en schijnmuizen voor studieblindering. - Injecteer de muis terwijl deze volledig verdoofd en geïmmobiliseerd is (geen oprichtreflex en terugtrekking van de teenknijp). Gebruik twee vingers om voorzichtig te voelen waar de onderkant van de ribbenkast van de muis de ruggengraat raakt (Figuur 2A). Onder dat punt bevinden zich de spinale segmenten van de lumber; richt de injectie hier op L2-L3.
- Plaats de punt van de Hamilton-spuit naast de ruggengraat (Figuur 2B,C). Richt de spuit in een hoek van ~45° in het interspinale ligament direct naast het bot.
OPMERKING: Afhankelijk van de taaiheid van de huid van de muis, kan het soms beter werken om te vertrouwen op de zwaartekracht in plaats van op actieve druk en een hoek van 90°. - Steek de punt van de naald voorzichtig maar stevig in het interspinale ligament (Figuur 3B,C) .
OPMERKING: Het doel is niet om de buikholte te doorbreken, maar om het ligament te injecteren. - Leeg de inhoud van de naald langzaam. Als er op enig moment vloeistof aan de punt zit, zit de naald niet door de huid. Ga door totdat alle 5 μL zijn geïnjecteerd.
- Houd de naald ~5 s op zijn plaats om terugstroming van de injectie te voorkomen. Het gebruik van blauwe kleurstof in terminale of acute pilotstudies wordt aanbevolen.
NOTITIE: Als het correct wordt gedaan, moet de vloeistof zich in het ligament verspreiden zoals afgebeeld (Figuur 3A). - Verwijder de naald voorzichtig en langzaam. Zorg ervoor dat er geen bloed of afscheiding is.
- Plaats de muis in het warmteterugwinningsstation met een bovenkant van de kooi totdat hij wakker wordt en mobiel is voordat u hem terugplaatst in de thuiskooi.
NOTITIE: Ervan uitgaande dat de procedure snel is uitgevoerd, zou het niet meer dan een minuut moeten duren voordat de muis wakker wordt. - Controleer de muizen tot 1 uur na de operatie om er zeker van te zijn dat alle normale motorische functies uit voorzorg doorgaan.
NOTITIE: Als het correct wordt gedaan, zouden er geen complicaties van deze procedure moeten optreden. - Controleer de muizen dagelijks gedurende de week na de operatie, inclusief gewichtsbeoordeling en inspectie van de injectieplaats om er zeker van te zijn dat er geen infectie of complicaties zijn opgetreden. Gebruik de muis niet voor verdere experimenten als er een gedragsverandering is, zoals gewichtsverlies en lethargie.
Figuur 1: Opstelling voor urokinase CBP-inductie. (A) De Fine Science Tools-bodemplaat die wordt aanbevolen voor muisoperaties. Aan de geribbelde randen kan een touwtje worden gehaakt om de muis op zijn plaats te houden. (B) Bergingsstation. Een lege kooi wordt aanbevolen, half op het verwarmingskussen, half eraf. Op de bodem wordt een schone doek gelegd om de muis een comfortabele rustplaats te geven. (C) Aanbeveling voor het instellen van het anesthesieapparaat. Gebruik een tweekanaals toedieningssysteem om een slang naar de inductiekamer te plaatsen en een andere naar het operatiestation. (D) Een weergave van de muisvergrendelingen. Twee touwtjes worden aan de geribbelde randen van de bodemplaat geknoopt en vervolgens voorzichtig over respectievelijk de nek en achterkant van de muis getrokken. Zorg ervoor dat u de muis niet te strak vasthoudt, zodat deze nog steeds normaal kan ademen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Inductie van de injectie van het CBP met urokinase. (A) Een overzicht van de plaatsing van de injectieplaats. Zoals afgebeeld, voelt u met uw vingers om de onderkant van de ribbenkast van de muis te vinden voor een referentiepunt voor L4-L5. (B) Een weergave van het injectieproces, met vermelding van de hoek voor de juiste injectie. (C) Een hoek van 45° heeft hier de voorkeur, maar pas deze indien nodig aan om ervoor te zorgen dat de naald komt waar hij moet komen. Scheer indien nodig de injectieplaats voor een betere visualisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Diagram van de injectieplaats. (A) Een foto van de locatie van de injectieplaats. Inkt wordt hier gebruikt om aan te geven waar de vloeistof het interspinale ligament tussen de L2- en L3-wervels zal binnendringen. (B) Een diagram met de juiste plaatsing van de naald en de locatie van de injectieplaats, weergegeven vanuit een zijaanzicht. (C) Een diagram met een bovenaanzicht van de wervels en injectieplaatsen voor de interspinale ligamenten. Injecties vinden meestal plaats op de interspinale ligamenten naast de wervelkolom, maar de naald kan ook in de ruimte tussen en de tussenwervels worden ingebracht. Het gebruik van blauwe kleurstof in pilotproeven wordt aanbevolen, zoals weergegeven in (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Gedragstesten
- von Frey mechanische reflexrespons drempel testen
OPMERKING: Mechanische terugtrekkingsdrempel is de minimale kracht die nodig is om 50% van de tijd een reactie op te wekken met een reeks van 8 von Frey-monofilamenten met een diameter van ~0.2 g toename, wat zorgt voor veranderingen in de mechanische kracht in logstappen (Tabel met materialen).- Test mechanische stimulatie met von Frey-vezels aangebracht op de achterpoot, het innervatiegebied van de lumbosacrale zenuwen. Bepaal de basiswaarden voor het terugtrekken van de poot vóór de operatie. Bepaal na de operatie eenmaal per week de mechanische drempel tijdens het chronische experiment.
- Verplaats de dieren uit de stalkamer en laat ze 30 minuten in hun eigen kooi acclimatiseren in de testruimte voorafgaand aan de test. Van daaruit verplaats je de dieren om ze individueel in kleine doorzichtige hokjes op de testtafel met scherm gedurende 15-20 minuten vast te zetten, afhankelijk van hun activiteitsniveau.
OPMERKING: Het testen kan beginnen nadat muizen zich in een rustpositie hebben gevestigd en niet draaien en bewegen in de kamer. Acclimatisatie aan de fixatiecabine minimaliseert door stress veroorzaakte effecten. Als muizen op een omgekeerde lichtcyclus zijn gehouden, moeten de tests worden uitgevoerd onder omstandigheden met rood licht. - Ga verder met testen met behulp van graduele reeksen von Frey-vezels zoals hieronder beschreven en in Chaplan et al.9.
- Peil de voetzool op een consistente plek op elk dier met behulp van het 3,61 von Frey-filament dat, wanneer gebogen, 0,4 g kracht uitlokt (Tabel met materialen). Vervolg met stimulatie met het 4.08 von Frey-filament dat 1.0 g kracht uitlokt.
OPMERKING: Geen van deze vezels lokt reacties uit bij naïeve, geacclimatiseerde dieren. - Breng elk filament 5x aan met tussenpozen van >5 s loodrecht op het voetkussen, en zorg ervoor dat u geen vouw/spleet of haar aanraakt. Een positieve reactie is een terugtrekking van de voet op drie van de vijf stimuli. Breng het volgende zwakkere filament in de reeks aan totdat het dier niet reageert op de mechanische stimulatie; Gebruik op dat moment het eerstvolgende hogere filament. Als het een reactie uitlokt, gebruik dan het onderste filament opnieuw totdat er vier proeven zijn toegepast na de verandering van de respons op mechanische stimulatie van het voetkussen.
- Gebruik het resulterende responspatroon om de mechanische terugtrekkingsdrempel te berekenen, de minimale hoeveelheid kracht die nodig is om 50% van de tijd een respons uit te lokken, met behulp van een algoritme voor het aanpassen van curven9. Een afname van de kracht die nodig is om een voetterugtrekkingsreactie op te wekken in vergelijking met naïeve muizen of de eigen basislijn van het dier duidt op een verhoogde gevoeligheid van het dier.
- Peil de voetzool op een consistente plek op elk dier met behulp van het 3,61 von Frey-filament dat, wanneer gebogen, 0,4 g kracht uitlokt (Tabel met materialen). Vervolg met stimulatie met het 4.08 von Frey-filament dat 1.0 g kracht uitlokt.
- Testen van de thermische reflexresponsdrempel
OPMERKING: Warmte- en kouderesponsdrempels worden vastgesteld met respectievelijk de Hargreaves- en de koudeplaattests.- De test van Hargreaves
- Plaats de muizen in hokjes op een glazen oppervlak dat van onderaf wordt verwarmd met een infraroodstraler. Noteer de latentie om de voet terug te trekken als de tijd in seconden vanaf de toepassing van de infrarood lichtprikkel (50 °C) die door het apparaat op de achterpoot van de muis wordt gegeven tot het terugtrekken uit de stimulatie.
- Koude plaat test
- Plaats de muizen op het koude plaatapparaat dat is afgekoeld tot -9 °C. Noteer de latentie om de voet terug te trekken als de tijd in seconden vanaf het plaatsen van de muis op het apparaat totdat de muis zijn voet begint op te tillen.
- U kunt ook een tot -9 °C afgekoelde koude sonde onder de achterpoot van de muis plaatsen terwijl de muis op een gaas is gekooid. Noteer de latentie om zich terug te trekken als de tijd in seconden vanaf het plaatsen van het apparaat onder de achterpoot totdat de muis begint met het optillen, likken of schudden van de voet. Om te voorkomen dat u een nociceptieve reactie oproept, moet u de muis laten wennen aan aanraking door de sonde bij kamertemperatuur.
- De test van Hargreaves
- Cognitie- en emotie-afhankelijke gedragstesten
OPMERKING: Langdurige overgevoeligheid bij dieren veroorzaakt emotionele en cognitie-afhankelijke disfunctie. Deze worden meestal slechts één keer gemeten in week 6 na inductie van het pijnmodel om oefeneffecten te voorkomen.- Angst testen
OPMERKING: Angst en depressie kunnen ook betrouwbaar worden getest om de effectiviteit van het model vast te stellen. Het is het beste om te wachten tot ten minste week 4-6 na de inductie-injectie om de comorbiditeiten te laten ontwikkelen. De voorkeur voor de donkere kamer in plaats van de lichte kamer is een maatstaf voor nociceptie-gerelateerde angst. In de nul- of plus-doolhoftesten brengen pijnmodelmuizen minder tijd door in de open kwadranten dan naïeve controledieren, een weergave van angstachtig gedrag10,11.- Licht/donker plaatsvoorkeurstest: plaats elk dier in de plaatsvoorkeurstestbox met een doorgang tussen twee kamers (10 x 10 x 10cm3). De ene kamer van het apparaat is fel verlicht, terwijl de andere kant donker blijft. Controleer tijdens elke test van 10 minuten de locatie van het dier met de computer om de bezettingstijden van licht en donker en het aantal overgangen te bepalen.
NOTITIE: U kunt ook een videocamera boven de testkamer monteren en handmatig de tijd registreren die in elke kamer wordt doorgebracht. - Verhoogde plus of nul doolhoven: plaats de modelknaagdieren of naïeve dieren op het doolhof en gebruik een stopwatch om de tijd te beoordelen die in de gesloten delen van het doolhof is doorgebracht. Bepaal de tijd die wordt doorgebracht in de twee ommuurde "veilige" gebieden en twee open "onveilige" gebieden. Dieren met pijn geven de voorkeur aan gesloten, veilige gebieden.
OPMERKING: Angstachtig gedrag kan worden getest in een nul- of plusdoolhof (10 min). Het nuldoolhof is een cirkelvormig parcours in tegenstelling tot het plusdoolhof, dat "plustekenvormig" is. Beide hebben twee open en twee gesloten kwadranten die continu verkennend gedrag mogelijk maken. Beide zijn 1 m boven de grond geheven, ofwel een cirkelvormige of plusvormige loopbrug verdeeld in vier kwadranten van gelijke grootte.
- Licht/donker plaatsvoorkeurstest: plaats elk dier in de plaatsvoorkeurstestbox met een doorgang tussen twee kamers (10 x 10 x 10cm3). De ene kamer van het apparaat is fel verlicht, terwijl de andere kant donker blijft. Controleer tijdens elke test van 10 minuten de locatie van het dier met de computer om de bezettingstijden van licht en donker en het aantal overgangen te bepalen.
- Sucrose splash depressie test
OPMERKING: De sucrose-spattest wordt gebruikt om depressie-achtig gedrag te bepalen. De splash-test maakt het mogelijk om de afwezigheid van normaal verzorgingsgedrag te meten als een symptoom van depressie als gevolg van chronische pijn.- Scoor de frequentie, duur en latentie van de verzorging gedurende 10 minuten na het spuiten van een 10-30% sucrose-oplossing op de rugvacht (~250 μL nabij de basis van de staart). Laat geblindeerde waarnemers het aantal verzorgingsmanoeuvres tellen op basis van videobandopnamen12.
OPMERKING: Er is gemeld dat deze index wordt beïnvloed in knaagdiermodellen van stemmingsstoornissen, zoals chronische milde stress, en wordt gecorrigeerd door chronische behandeling met antidepressiva13.
- Scoor de frequentie, duur en latentie van de verzorging gedurende 10 minuten na het spuiten van een 10-30% sucrose-oplossing op de rugvacht (~250 μL nabij de basis van de staart). Laat geblindeerde waarnemers het aantal verzorgingsmanoeuvres tellen op basis van videobandopnamen12.
- Nieuwe objecttest
OPMERKING: Cognitieve disfunctie is meetbaar met de nieuwe objecttest.- Laat muizen individueel acclimatiseren in een doorzichtige plastic kooi met een open bovenkant (56 x 30 x 20 cm) gedurende 1 uur. Zet twee identieke minifiguren in tegenovergestelde hoeken van de kooi gedurende 5 minuten.
- Laat de dieren op de testdag opnieuw 1 uur wennen aan de doorzichtige kooi voordat u de twee identieke minifiguren gedurende 5 minuten in dezelfde posities van de kooi plaatst voordat u ze terugplaatst in de thuiskooi.
- Vervang een van de originele figuren door een duidelijk ander nieuw object, breng de muizen 4 uur later terug naar de testkooi en noteer de tijd die ze hebben besteed aan het verkennen van de objecten.
- Bereken de gerapporteerde herkenningsindex (RI) als het percentage tijd dat is besteed aan het verkennen van het nieuwe object van de totale tijd die is besteed aan het verkennen van het nieuwe object14.
- Beoordeling van de motorische functie
OPMERKING: De inktvlek mobiliteit en loopstoornis test15 beoordeelt de motorische functie in het rugpijnmodel.- Bouw een tunnel van een papieren handdoekbuis die aan één kant in de lengte is doorgesneden. Spreid de tunnel open op een schoon stuk printerpapier.
- Houd de muizen voorzichtig in een handdoek gewikkeld totdat ze kalm zijn. Plaats de poten op een stempelkussen dat nat is met niet-giftige Oost-Indische inkt om ze met inkt te bedekken of schilder de inkt op de onderkant van de poten van de muis met een wattenstaafje. Laat de muizen los bij de ingang van de tunnel en laat ze door de tunnel rennen en vang ze aan het einde.
- Scoor pootafdrukken op basis van drie parameters: paslengte (de verticale afstand van de achterkant van de ene afdruk naar de volgende), pasbreedte (horizontale afstand tussen afdrukken) en teenspreiding (de afstand tussen de tenen aan weerszijden van de poot).
OPMERKING: Goedgekeurde traktaties kunnen ook worden gebruikt om de muis aan te moedigen door de tunnel te komen. Als de pootafdrukken besmeurd of onduidelijk zijn, moet het experiment worden herhaald.
- Angst testen
Figuur 4: Mechanische en thermische overgevoeligheid na CBP-inductie. Pijn is meetbaar een week na modelinductie en houdt 8 weken aan. (A) Von Frey-test. Mechanische drempeltests worden uitgevoerd met von Frey-filamenten die op het voetkussen worden aangebracht via een gaastafel met de up-down-methode, zoals hier weergegeven in de loop van 4 weken. De naïeve mannelijke drempel (groen) is verborgen onder de blauwe lijn voor de naïeve vrouwelijke muizen. De CBP-muizen (n = 4 mannetjes, 4 vrouwtjes) vertoonden een significant verhoogde mechanische gevoeligheid in vergelijking met de naïeve controles (n = 2 mannetjes, 2 vrouwtjes). Tweerichtings-ANOVA (Dunnett's meervoudige vergelijkingstest) werd uitgevoerd op deze gegevens: n = 4 per groep. In post-hoc analyses leverde Bonferroni-aanpassing aan alle P-waarden voor week-tot-week vergelijkingen van CBP versus Naïef alle 11 waarden < 0,0011 op. p < 0,0001. (B) Hargreaves-test. De warmtedrempel werd getest op de voetzool met de Hargreaves-test (50 °C). De CBP-muizen (n = 12 mannetjes, 12 vrouwtjes) vertoonden een significant verhoogde hittegevoeligheid in vergelijking met de naïeve controles (n = 6 mannetjes, 6 vrouwtjes). De tweezijdige t-toets van Mann-Whitney werd uitgevoerd om de significantie te testen (p < 0,0001). (C) Gevoeligheid voor koude. De koude sondetest werd uitgevoerd door muizen op het koude plaatapparaat te plaatsen dat was afgekoeld tot -9 °C. De latentie om zich terug te trekken werd geregistreerd als de tijd in seconden vanaf het plaatsen van de muis op het apparaat totdat de muis zijn voet begint op te tillen, te likken of te schudden. In de getoonde gegevens werd een koude sonde gekoeld tot -9 °C onder de achterpoot van de muis geplaatst, terwijl de muis op een gaas is gekooid. Alle muizen werden 1-3 weken na de injectie getest. De CBP-muizen (n = 4 mannetjes, 6 vrouwtjes) vertoonden een significant verhoogde koudegevoeligheid in vergelijking met de naïeve controles (n = 2 mannetjes, 4 vrouwtjes). De tweezijdige t-toets van Mann-Whitney werd uitgevoerd om de significantie te testen (p = 0,0002). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nociceptie-gerelateerde gedragstesten en data-analyse
Opgeroepen maatregelen
Overgevoeligheid op de voetzool ontwikkelt zich binnen een dag na de injectie met urokinase. Binnen 1 week wordt de ontwenningsdrempel aanzienlijk verlaagd en blijft deze bestaan tot euthanasie; dit wordt aangetoond tot en met postoperatieve week 4 (Figuur 4A). De latentie van het terugtrekken van de poot wordt geanalyseerd met behulp van de von Frey up-down-methode9 en de Hargreaves-test. In het uitgezette voorbeeld vertoonden muizen met CBP (n = 4 mannetjes, 4 vrouwtjes) een significant verhoogde mechanische gevoeligheid in vergelijking met controles (n = 2 mannetjes, 2 vrouwtjes). Het model verdwijnt in week 6-7. Dit tijdsverloop maakt de evaluatie mogelijk van verbindingen om overgevoeligheid op chronische tijdstippen te verminderen, wat overeenkomt met jarenlange pijnervaring bij klinische patiënten. De reflexieve von Frey-test kan meerdere keren op één dag worden herhaald wanneer de werkzaamheid van een kortdurende verbinding wordt bepaald.
von Frey mechanische gevoeligheidstest
De gevoeligheid van de voetzool, en dus de ernst van het rugpijnmodel, wordt gekwantificeerd door het aantal ontwenningsverschijnselen van graduele von Frey-filamenten met een gedefinieerde treksterkte. Stimulatie met de laagste vezel (0,008 g, 1,65) is meestal niet detecteerbaar, behalve in ernstige gevallen van allodynie; De grootste vezel (6,0 g, 4,74) is ongeveer zo groot als een stomp paperclipuiteinde, en hoewel het door een muis kan worden gevoeld, zal een naïeve muis meestal niet terugdeinzen bij het aanbrengen. Dieren zijn vrij om vrijwillig hun voet weg te bewegen van de stimulus. Het gemiddelde aantal gevallen van opname wordt uitgedrukt als het aantal reacties op vijf, waarbij nul betekent dat er geen intrekking is en vijf het maximale aantal opnames. Reacties op lagere vezels in vergelijking met controles duiden op een verhoogde gevoeligheid. Na inductie van dit model ontwikkelt zich binnen een week statistisch significante mechanische overgevoeligheid die meerdere weken na injectie aanhoudt (Figuur 4A).
Hargreaves thermische gevoeligheidsdrempeltest
Terugtrekking van de voet in seconden na blootstelling aan de IR-geïnduceerde warmteprikkel wordt vergeleken tussen (onder) groepen. Een afname van de onttrekkingslatentie in seconden duidt op warmteovergevoeligheid (Figuur 4B). Dieren zijn vrij om vrijwillig hun voet weg te bewegen van de stimulus.
Thermische overgevoeligheid van de koudesonde
Het rugpijnmodel veroorzaakt koudeovergevoeligheid op de voetzool. Dieren zijn vrij om vrijwillig hun voet weg te bewegen van de stimulus. Een afname van de ontwenningslatentie in seconden duidt op koudeovergevoeligheid (Figuur 4C). De terugtrekkingslatentie werd gemeten met een stopwatch vanaf het moment dat de koude stimulus werd toegepast op de muis die een terugtrekkingsgedrag vertoonde, likken, tikken of herhaaldelijk optillen van de aangedane achterpoot.
Niet-opgewekte spontane pijnmetingen
Figuur 5: Gewijzigde niet-opgewekte gedragsmetingen. (A) Angst in CBP-model. De totale tijd die wordt doorgebracht in de lichte kamer van de licht/donker-box en het aantal opfokgebeurtenissen zijn significant lager bij muizen met CBP, wat wijst op angst. One-way ANOVA (Dunnett's multiple comparisons test) werd uitgevoerd op deze gegevens: (n = 4 CBP, n = 6 Naïef). Tukey post-hoc test werd uitgevoerd om verschillen tussen specifieke groepsgemiddelden te bevestigen. * p < 0,05, ** p < 0,01. (B) Depressie in CBP-model. De totale tijd die wordt besteed aan de verzorging en het aantal keren dat ze worden verzorgd tijdens de sucrose-spattest zijn aanzienlijk lager bij muizen met CBP, terwijl de hoeveelheid tijd voordat de verzorging begint aanzienlijk werd verlengd. One-way ANOVA (Dunnett's multiple comparisons test) werd uitgevoerd op deze gegevens: (n = 4 CBP, n = 6 Naïef). Tukey post-hoc test werd uitgevoerd om verschillen tussen specifieke groepsgemiddelden te bevestigen. * p < 0,05, *** p < 0,001. (C) Veranderingen in de pas bij muizen met het CBP-model. De paslengte tussen muizen met CBP en naïeve muizen was significant verschillend. One-way ANOVA (Dunnett's multiple comparisons test) werd uitgevoerd op deze gegevens: n = 4 per groep. Tukey post-hoc test werd uitgevoerd om verschillen tussen specifieke groepsgemiddelden te bevestigen. ** p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Licht/donker test
Een standaard licht/donkerkamer kan worden gebruikt voor angstanalyse10. Muizen met het rugpijnmodel hebben aanzienlijk minder kans om tijd door te brengen in de lichte kamer en hebben minder opfokgedrag, wat een indicatie is van de angst en de ernst van het model. Als alternatief kunnen de verhoogde nul- of plusdoolhoven worden gebruikt om angstachtig gedrag te meten. Knaagdieren met een pijnmodel dat angstachtig gedrag vertoont, komen binnen en brengen minder tijd door in de open kwadranten dan naïeve controledieren (Figuur 5A).
Depressie-achtig gedrag
De sucrose-spattest kan worden gebruikt om depressie-achtig gedrag in het rugpijnmodel te beoordelen11. De test beoordeelt de afwezigheid van verzorgingsgedrag als een teken van depressie als gevolg van het geïnduceerde pijnmodel 12,13. Muizen met rugpijn vlooien beduidend minder vaak en in het algemeen minder lang, en het duurt ook langer om te beginnen met vlooien (latentie tot vachtverzorging) (Figuur 5B).
Mobiliteit motorisch gedrag
Ten slotte kan de inktvlektest worden gebruikt om loopverschillen tussen het model en de controlemuizen te onderscheiden15. Muizen met rugpijn vertonen significant kortere en bredere passen in vergelijking met controles (Figuur 5C). Meet de paslengte voor groepsvergelijkingen en noteer de verschillen in pasuiterlijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit model van chronische rugpijn is eenvoudig op te wekken en overgevoeligheid die binnen 1 week wordt vastgesteld, kan tot (en mogelijk langer) 8 weken aanhouden. Dit maakt een nauwkeurige studie van de chronische pijntoestand mogelijk in tegenstelling tot andere acute modellen die slechts een week of twee duren. Hoewel we het model bij muizen laten zien, kan het uPA-geïnduceerde CBP-model ook bij ratten wordenvastgesteld. Een voordeel van het model is dat het langdurige tijdsverloop de ontwikkeling van angst- en depressie-achtig gedrag uitlokt, dat wordt waargenomen bij patiënten met chronische lage rugpijn. Gezien de prevalentie van rugpijn16, is het een voordeel om te kunnen worden uitgevoerd in de meer algemeen gebruikte muismodellen in moleculair pijnonderzoek.
Deze inductie van een pijnmodel met behulp van uPA is op dezelfde manier gedaan met een intra-articulaire injectie om artrose te induceren3, maar de hier getoonde methode (intraligament) kan sneller worden gedaan en met veel minder risico op schade aan de muis. Er is geen hechting nodig en er is geen risico op bloedingen als gevolg van het aanprikken van de gewrichtsholte. Omdat het een enkele injectie is met weinig voorbereidend werk, is het ook gemakkelijk om technici te verblinden voor groepen voor nauwkeurigere resultaten.
De belangrijkste beperking van dit model is de juiste acclimatisering van de muizen aan de von Frey-tests; In feite wordt aanbevolen dat muizen ten minste een week voorafgaand aan de modelinductie worden geacclimatiseerd aan hun hokje en de filamenten om ervoor te zorgen dat de terugdeinzende reactie niet te wijten is aan de nieuwheid van de omgeving waarin ze zich bevinden of aan het zien van iets dat onder hun voeten beweegt.
Het is van cruciaal belang dat de injectie in de ligamenten wordt uitgevoerd om een maximale respons op het urokinase te garanderen en niet in de spier die ongeveer de helft van de respons produceert. Aangezien de injectie zich dicht bij de wervelkolom bevindt, is het nog steeds belangrijk om alle muizen dagelijks na de injectie gedurende ten minste 1 week te controleren om er zeker van te zijn dat er geen complicaties optreden van de procedure. Als een muis tekenen vertoont van lethargie, gewichtsverlies, verlamming, abnormaal gedrag of overmatige verzorging van de injectieplaats, overweeg dan om de muis uit het onderzoek te verwijderen.
Toekomstige studies zullen de dorsale wortelganglia (DRG) onderzoeken met in vitro patchklemopnames. Flowanalyse zal de neuro-immuunrespons en de aanwezigheid van binnendringende ontstekingscellen in de DRG bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige financiële belangen zijn. KNW erkent onbetaald overleg met NeuroChronix, Bessor Pharma en USA Elixeria BioPharm, Inc.
Acknowledgments
Subsidie werd verstrekt door NIH HEAL UG3 NS123958. De huisvestingsfaciliteiten werden geïnspecteerd en geaccrediteerd door AAALAC. De dieren werden gehuisvest in de huisvestingsfaciliteit van het Animal Resources Center (ARC) die werd onderhouden door het laboratoriumpersoneel en het personeel van de Division of Laboratory and Animal Resources (DLAR). De procedures voor gedragstesten zijn standaardmethoden in het veld zoals goedgekeurd door de American Pain Society en de International Association for the Study of Pain. De methode van euthanasie is in overeenstemming met de aanbevelingen van het Panel on Euthanasia van de American Veterinary Medical Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals and Consumables | |||
| 70% ethanol | Local Source | ||
| BALB/c mice | Envigo | 20-25 g | |
| Cotton balls | Fisher Scientific | 19-090-702 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 19-062-616 | |
| Isoflurane inhalant anesthetic | MedVet | RXISO-250 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | NGFP7002 | |
| Nitrile exam gloves | Fisher Scientific | ||
| Oxygen tank | Local Source | ||
| Surgical drape, Steri-Drape Utility Sheet, Absorbent Prevention | VWR | 76246-788 | cut into 15 x 15 cm pieces |
| Tygon tubing with 3 mm inner diameter | Grainger | 22XH87 | |
| Equipment | |||
| #11 carbon steel scalpel blades | VWR | 21909-612 | |
| Anesthesia induction chamber | Summit Medical Equipment Company | AS-01-0530-LG | |
| Autoclave | Local Unit | ||
| Biology Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Glass bead sterilizer Germinator 500 | VWR | 102095-946 | |
| IITC Life Sciences Series 8 Model PE34 Hot/Cold Plate Analgesia Meter | IITC | PE34 | |
| Integra Miltex cotton & dressing pliers | Safco Dental Supply | 66-317 | |
| OPTIKA CL31 double arm LED illuminator | New York Microscope Company | OPCL-31 | |
| Plantar Test System with InfraRed Emitter, i. e. Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370-001 and 37370-002 | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | 25607-947 | |
| Small animal heating pad | Valley Vet Supply | 47375 | |
| Student Vannas spring scissors, straight blade | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Table top animal research portable anesthesia workstation “PAM” | Patterson Scientific | AS-01-0007 | |
| Von Frey Filaments | Ugo Basile | 37450-275 |
References
- O'Sullivan, P. B., et al. Back to basics: 10 facts every person should know about back pain. British Journal of Sports Medicine. 54 (12), 698-699 (2020).
- Nauta, H. J., McIlwrath, S. L., Westlund, K. N. Punctate midline myelotomy reduces pain responses in a rat model of lumbar spine pain: evidence that the postsynaptic dorsal column pathway conveys pain from the axial spine. Cureus. 10 (3), 2371 (2018).
- Shuang, F., et al. Establishment of a rat model of lumbar facet joint osteoarthritis using intraarticular injection of urinary plasminogen activator. Scientific Reports. 5 (1), 9828 (2015).
- Reed, N. R., et al. Somatosensory behavioral alterations in a NGF-induced persistent low back pain model. Behavioural Brain Research. 418, 113617 (2022).
- Suh, H. R., Cho, H. -Y., Han, H. C. Development of a novel model of intervertebral disc degeneration by the intradiscal application of monosodium iodoacetate (MIA) in rat. The Spine Journal. 22 (1), 183-192 (2022).
- Kim, H., Hong, J. Y., Lee, J., Jeon, W. -J., Ha, I. -H. IL-1β promotes disc degeneration and inflammation through direct injection of intervertebral disc in a rat lumbar disc herniation model. The Spine Journal. 21 (6), 1031-1041 (2021).
- Millecamps, M., Tajerian, M., Sage, E. H., Stone, L. S. Behavioral signs of chronic back pain in the SPARC-null mouse. Spine. 36 (2), 95-102 (2011).
- La Porta, C., Tappe-Theodor, A. Differential impact of psychological and psychophysical stress on low back pain in mice. Pain. 161 (7), 1442-1458 (2020).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Takao, K., Miyakawa, T. Light/dark transition test for mice. Journal of Visualized Experiments JoVE. (1), e104 (2006).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- David, D. J., et al. Neurogenesis-dependent and -independent effects of fluoxetine in an animal model of anxiety/depression. Neuron. 62 (4), 479-493 (2009).
- Yalcin, I., et al. A time-dependent history of mood disorders in a murine model of neuropathic pain. Biological Psychiatry. 70 (10), 946-953 (2011).
- Madathil, S. K., et al. Astrocyte-specific overexpression of insulin-like growth factor-1 protects hippocampal neurons and reduces behavioral deficits following traumatic brain injury in mice. PloS One. 8 (6), e67204 (2013).
- Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost protocol of footprint analysis and hanging box test for mice applied the chronic restraint stress. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59027 (2019).
- Hassan, S., et al. Identifying chronic low back pain phenotypic domains and characteristics accounting for individual variation: a systematic review. Pain. , (2023).
