Summary
Metoder for enkel, rask induksjon av en ryggsmertemodell hos mus er gitt her ved bruk av en intraligamentinjeksjon av urin plasminogenaktivator.
Abstract
En modell av vedvarende smerter i korsryggen kan induseres hos mus med den enkle metodikken beskrevet her. Trinnvise metoder for enkel, rask induksjon av en vedvarende ryggsmertemodell hos mus er gitt her ved bruk av en injeksjon av urokinase-type plasminogenaktivator (urokinase), en serinprotease tilstede hos mennesker og andre dyr. Metoden for induksjon av vedvarende korsryggsmerter hos mus innebærer en enkel injeksjon av urokinase langs det ligamentale innføringsområdet i lumbalcolumna. Det urokinase inflammatoriske middelet aktiverer plasminogen til plasmin. Vanligvis kan modellen induseres innen 10 minutter og overfølsomhet vedvarer i minst 8 uker.
Overfølsomhet, gangforstyrrelser og andre standard angst- og depresjonslignende tiltak kan testes i den vedvarende modellen. Ryggsmerter er den mest utbredte typen smerte. For å øke bevisstheten om ryggsmerter, kåret International Association for the Study of Pain (IASP) 2021 til "Global Year about Back Pain" og 2022 "Global Year for Translateing Pain Knowledge to Practice." En begrensning av terapeutisk fremgang av smertebehandling er mangelen på egnede modeller for testing av vedvarende og kronisk smerte. Funksjonene i denne modellen er egnet for å teste potensielle terapier rettet mot reduksjon av ryggsmerter og tilhørende egenskaper, noe som bidrar til at IASP navngir 2022 som det globale året for å oversette smertekunnskap til praksis.
Introduction
Korsryggsmerter er en av de vanligste årsakene til funksjonshemming med 1 av 5 personer som lider over hele verden1. Til tross for disse anstrengelsene er få pålitelige dyremodeller av ryggsmerter populært brukt i dyreforsøk på smertefeltet, spesielt hos mus. Tidligere modeller har nesten utelukkende benyttet rotter for induksjon av kroniske ryggsmerter (CBP) som de som induseres ved injeksjon av urin plasminogen aktivator (uPA) i lumbale fasettledd 2,3, injeksjon av nervevekstfaktor (NGF) i trunkmuskulatur4, eller mononatriumiodoacetat (MIA)5 eller interleukin-1beta6 injeksjon i intravertebralskiven. Selvfølgelig er rotter foretrukket for disse modellene, hovedsakelig på grunn av deres større størrelse og enkel tilgang til injeksjon av inflammatoriske midler.
For å være tydelig, finnes musemodeller av ryggsmerter som SPARC-null musemodellen for intervertebralskivedegenerasjon brukt i mange år7, men disse er mer kostbare og tidkrevende å etablere enn injeksjonsbaserte modeller. En nylig musestudie etablerte en modell for korsryggsmerter ved å kombinere NGF-injeksjon i korsryggsmuskler med vertikal kronisk fastholdelsesstress8. I den følgende protokollen har vi tilpasset den uPA-induserte CBP-modellen fra rotter for mus2. Overfølsomhet er etablert innen 1 uke og vedvarer opptil 6-8 uker. I tillegg etablerer vi at mus utvikler angst- og depresjonslignende atferd. Gitt utbredelsen av ryggsmerter og den mer vanlige bruken av mus i molekylær smerteforskning, er denne holdbare modellen lett etablert for bruk i utviklingen av nye behandlingsstrategier for ryggsmertelindring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne dyreprosedyrer er i samsvar med NIHs veileder for stell og bruk av forsøksdyr. Studier ble godkjent av den lokale institusjonelle omsorgs- og brukskomiteen (IACUC # 23-201364-HSC) ved University of New Mexico Health Sciences Center. Alle studier er i samsvar med retningslinjer i regi av en OLAW Assurance of Compliance (A3002-01) om bruk av dyr i forskning, som beskrevet i del III. II. Forsikringer og sertifiseringer. Dyrene er plassert i Animal Resources Center (ARC) boliganlegg vedlikeholdt av laboratoriepersonalet og Division of Laboratory and Animal Resources (DLAR) ansatte. Metoden for eutanasi (100 μL av 59 mg / ml pentobarbital injeksjon) er rask og pålitelig og muliggjør disseksjon og innsamling av forskjellige vev for videre forskning.
1. Dyr
- Hus voksen (~ 3-4 uker gammel) mannlige og kvinnelige BALB / c mus (20-25 g) på en omvendt 12 t: 12 h lys: mørk syklus, slik at deres aktive tid i mørket oppstår i laboratoriearbeidstiden.
MERK: Dette vil tillate vurdering av alle parametere i løpet av dyrenes naturlige aktive tid siden gnagere er naturlig nattaktive dyr. Dette reduserer bidraget fra endringer i den sirkadiske klokken slik at dyr kan testes i løpet av sin aktive tid som nå er dagtid. - Overvåk dyrene to ganger daglig.
- Oppretthold musene på normal musoppdretter chow, som er lavere i soyaproteininnhold sammenlignet med standard gnager chow (kjent for å endre overfølsomhet) hvis du vurderer narkotikaeffekter på smerterelatert atferd.
- Vei dyrene en gang i uken for å sikre vedlikehold av sunn vektøkning.
MERK: Ingen gruppeforskjeller i vekt ble observert gjennom 8-10-ukers studier, noe som tillot studieblinding.
2. Modell induksjon
- Utfør modellinduksjon på en varm, steril, flat overflate utstyrt med et middel for å feste stabiliseringsbegrensninger for å holde musen på plass (figur 1A). Utfør operasjonen med et disseksjonsmikroskop på en sterilisert overflate.
MERK: Bruk en kjemisk avtrekkshette hvis anestesiopptak ikke er tilgjengelig. - Bruk kirurgisk silke eller garn med gummibånd knyttet på enden av strengene hektet til ribbekantene på platen som begrensninger hvis du bruker bunnplaten som anbefales i materialfortegnelsen.
- Plasser en gjenvinningsstasjon for varmeputer på en overflate ved siden av operasjonsoppsettet for overføring av mus til stasjonen umiddelbart etter injeksjon (figur 1B).
MERK: Plasser et tomt bur på varmeputen minst 10 minutter før injeksjon for å la buret varmes opp til en behagelig temperatur (37 °C). Plasser buret halvparten av puten, slik at den våkne musen en preferanse for utvinningstemperaturer. - Forbered urokinasen, fortynn den i sterilt vann. Rengjør Hamilton-sprøyten og skyll i sterilt vann. Trekk opp løsningen på forhånd slik at musen er under anestesi i så kort tid som mulig. Bruk 5 μL av 2 mg / ml urin plasminogen aktivator for modellen; For shams, bruk 5 μL steril saltvann.
- Sett opp isofluran anestesi stasjon på et nivå på 4% eller mindre for denne korte prosedyren. Plasser musen i induksjonskammeret; Vanligvis vil musens raske pustefrekvens avta innen 1-2 minutter, og bevege seg fra øvre brystbevegelse til nedre del av brystet.
- Bruk et oksygennivå på 1,5 l/min og en beholder med aktivt kull F, eller arbeid under en biologisk strømnings- eller avtrekksvifte for å skrubbe isofluran for å unngå eksponering for dyrekirurgen. Hvis ikke tilgjengelig, utfør prosedyren i en kjemisk sikkerhetshette.
- Bytt raskt musen og bedøvelsesstrømmen til operasjonsområdet på en 37 ° C oppvarmingspute, plasser musens nese i nesen for å opprettholde bedøvelsesnivået (figur 1C, D). Kontroller at musen ikke har noen refleksiv bevegelse for å knipe tå, og hold deretter musen fast på bunnplaten.
MERK: Hvis det er bevegelse i det hele tatt, plasser musen tilbake i induksjonskammeret og gjenta dette. - Rengjør bakhuden med en spritserviett. Juster LED-belysningen etter behov for å få et klart syn på den bedøvede musens rygg.
MERK: Hvis nødvendig, bruk en elektrisk barbermaskin for å fjerne hår fra musens rygg slik at det er en uhindret utsikt over ryggene i ryggraden under huden. Hvis de eksperimentelle musene er barbert, barberer du også ryggen til de naive og falske musene for å studere blinding. - Injiser musen mens den er fullstendig bedøvet og immobilisert (ingen høyrerefleks og tåklemmeuttak). Bruk to fingre til forsiktig å kjenne hvor bunnen av musens brystkasse møter ryggraden (figur 2A). Under dette punktet er tømmerryggsegmentene; Sikt injeksjonen her på L2-L3.
- Plasser spissen av Hamilton-sprøyten ved siden av ryggraden (figur 2B,C). Sikt sprøyten mot ~45° vinkel inn i det interspinøse ligamentet umiddelbart ved siden av beinet.
MERK: Avhengig av seigheten til musens hud, kan det noen ganger stole på tyngdekraften i stedet for aktivt trykk og en 90 ° vinkel fungere bedre. - Stikk spissen av nålen forsiktig, men bestemt inn i det interspinøse ligamentet (figur 3B,C).
MERK: Målet er ikke å bryte bukhulen, men å injisere leddbåndet. - Tøm innholdet i kanylen langsomt. Hvis det på noe tidspunkt er væske på spissen, er nålen ikke gjennom huden. Fortsett til alle 5 μl er injisert.
- Hold nålen på plass i ~5 s for å hindre tilbakestrømning fra injeksjonen. Bruk av blått fargestoff i terminale eller akutte pilotforsøk anbefales.
MERK: Hvis det gjøres riktig, skal væsken spre seg inn i ligamentet som vist (figur 3A). - Fjern nålen forsiktig og sakte. Pass på at det ikke er blod eller utslipp.
- Plasser musen i varmegjenvinningsstasjonen med en burtopp til den våkner og er mobil før du returnerer den til hjemmeburet.
MERK: Forutsatt at prosedyren ble utført raskt, bør det ikke være mer enn et minutt før musen våkner. - Kontroller musene gjennom 1 time etter operasjonen for å sikre at all normal motorfunksjon fortsetter som en forholdsregel.
MERK: Hvis det gjøres riktig, bør det ikke være noen komplikasjoner fra denne prosedyren. - Sjekk musene daglig i uken etter operasjonen, inkludert vektvurdering og inspeksjon av injeksjonsstedet for å sikre at ingen infeksjon eller komplikasjoner har oppstått. Ikke bruk musen til videre eksperimentering hvis det er endring i atferd, for eksempel vekttap og sløvhet.
Figur 1: Oppsett for urokinase CBP-induksjon. (A) Fine Science Tools baseplate anbefales for museoperasjoner. De ribbeformede kantene kan ha hektet hyssing på dem for å holde musen på plass. (B) Gjenopprettingsstasjon. Et tomt husbur anbefales, halvparten på varmeputen, halvparten av. En ren klut er plassert på bunnen for å gi musen et komfortabelt hvileområde. (C) Anbefaling av oppsett av anestesimaskin. Bruk et tokanals leveringssystem, sett opp en slange til induksjonskammeret og en annen til operasjonsstasjonen. (D) En visning av musestøttene. To strenger knyttes på de ribbeformede kantene på bunnplaten, og trekkes deretter forsiktig over henholdsvis musens hals og bakside. Pass på at du ikke holder musen for hardt slik at den fortsatt kan puste normalt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Induksjon av urokinaseinjeksjon av CBP. (A) En oversikt over plasseringen av injeksjonsstedet. Som vist, føl med fingrene for å finne bunnen av musens brystkasse for et referansepunkt for L4-L5. (B) En visning av injeksjonsprosessen, som viser vinkelen for riktig injeksjon. (C) En 45° vinkel er å foretrekke her, men juster etter behov for å sikre at nålen kommer dit den skal. Hvis nødvendig, barberer injeksjonsstedet for bedre visualisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Diagram over injeksjonsstedet. (A) Et fotografi av plasseringen av injeksjonsstedet. Blekk brukes her for å indikere hvor væsken kommer inn i det interspinøse ligamentet mellom L2- og L3-ryggvirvlene. (B) Et diagram som viser riktig plassering av nålen og plassering av injeksjonsstedet, vist sett fra siden. (C) Et diagram som viser en ovenfra og ned visning av ryggvirvlene, og injeksjonssteder for interspinøse leddbånd. Injeksjoner vil vanligvis være på interspinøse leddbånd ved siden av ryggraden, men nålen kan settes inn i rommet mellom og intertransverse ryggvirvler også. Bruk av blått fargestoff i pilotforsøk anbefales som vist i (A). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Atferdsmessige analyser
- von Frey mekanisk refleks respons terskel testing
MERK: Mekanisk uttaksterskel er den minimale kraften som trengs for å fremkalle en respons 50% av tiden med en serie på 8 von Frey monofilamenter gradert i diameter med ~ 0,2 g økninger, noe som gir loggtrinnendringer i mekanisk kraft (materialfortegnelse).- Test mekanisk stimulering med von Frey-fibre påført bakpoten, innervasjonsområdet til lumbosakralnervene. Bestem baseline pote tilbaketrekning verdier før operasjonen. Etter operasjonen, bestem den mekaniske terskelen en gang i uken under det kroniske eksperimentet.
- Flytt dyrene fra rommet og akklimatisere dem i testrommet i 30 minutter i hjemmeburene før testing. Derfra flytter du dyrene for å holde dem individuelt i små gjennomsiktige avlukker på testbordet i 15-20 minutter, avhengig av aktivitetsnivå.
MERK: Testing kan begynne etter at mus har slått seg ned i hvilestilling og ikke snur og beveger seg i kammeret. Akklimatisering til avlukket minimerer stressinduserte effekter. Hvis mus har blitt opprettholdt på en omvendt lyssyklus, bør testing gjøres under røde lysforhold. - Fortsett med testing ved hjelp av graderte serier av von Frey-fibre som beskrevet nedenfor og i Chaplan et al.9.
- Undersøk fotputen på et konsekvent sted på hvert dyr ved hjelp av 3,61 von Frey-filamentet, som når den er bøyd fremkaller 0,4 g kraft (materialfortegnelse). Følg med stimulering med 4,08 von Frey filament som fremkaller 1,0 g kraft.
MERK: Ingen av disse fibrene fremkaller responser i naive, akklimatiserte dyr. - Påfør hvert filament 5x med >5 s intervaller vinkelrett på fotputen, og vær forsiktig så du ikke berører en brett / sprekk eller hår. En positiv respons er en fotuttak til tre av fem stimuli. Påfør det neste svakere filamentet i serien til dyret ikke reagerer på den mekaniske stimuleringen; På det tidspunktet bruker du det neste høyere filamentet. Hvis det fremkaller en respons, bruk det nedre filamentet igjen til fire forsøk har blitt påført etter endringen av respons på mekanisk stimulering av fotputen.
- Bruk det resulterende responsmønsteret til å beregne den mekaniske uttaksterskelen, den minimale mengden kraft som trengs for å fremkalle en respons 50% av tiden, ved hjelp av en kurvetilpasningsalgoritme9. En reduksjon i kraften som kreves for å fremkalle en fotuttaksrespons sammenlignet med naive mus eller dyrets egen grunnlinje, indikerer en økt følsomhet hos dyret.
- Undersøk fotputen på et konsekvent sted på hvert dyr ved hjelp av 3,61 von Frey-filamentet, som når den er bøyd fremkaller 0,4 g kraft (materialfortegnelse). Følg med stimulering med 4,08 von Frey filament som fremkaller 1,0 g kraft.
- Testing av terskel for termisk refleksrespons
MERK: Varme- og kulderesponsterskler er fastslått med henholdsvis Hargreaves og kaldplatetestene.- Hargreaves test
- Plasser musene i avlukker på en glassoverflate som varmes opp med en infrarød emitter nedenfra. Registrer ventetiden for å trekke ut foten som tiden i sekunder fra påføring av infrarødt lys (50 °C) stimulus fra apparatet på musens bakpote til uttak fra stimulering.
- Kald plate test
- Plasser musene på kaldplateapparatet avkjølt til -9 °C. Registrer ventetiden for å trekke foten som tiden i sekunder fra plassering av musen på apparatet til musen begynner å løfte foten.
- Alternativt kan du plassere en kaldsonde avkjølt til -9 °C under musens bakpote mens musen er buret oppå et nettingnett. Registrer ventetiden for å trekke seg som tiden i sekunder fra plassering av apparatet under bakpoten til musen begynner å løfte, slikke eller riste. For å unngå å fremkalle en nociceptiv respons, akklimatisere musen til å bli berørt av sonden ved romtemperatur.
- Hargreaves test
- Kognisjons- og emosjonsavhengige atferdsanalyser
MERK: Langvarig overfølsomhet hos dyr produserer emosjonell og kognisjonsavhengig dysfunksjon. Disse måles vanligvis bare en gang i uke 6 etter smertemodellinduksjon for å unngå praksiseffekter.- Angsttester
MERK: Angst og depresjon kan også testes pålitelig for å fastslå effektiviteten av modellen. Det er best å vente til minst uke 4-6 etter induksjonsinjeksjonen for å la komorbiditetene utvikle seg. Preferanse for mørket i stedet for det lyse kammeret er et mål på nociception-relatert angst. I null- eller plusslabyrinttestingen bruker smertemodellmus mindre tid i de åpne kvadrantene enn naive kontrolldyr, en visning av angstlignende oppførsel10,11.- Preferansetest for lys/mørkt sted: plasser hvert dyr i testboksen for stedsinnstilling med en passasje mellom to kamre (10 x 10 x 10 cm3). Ett kammer av apparatet er sterkt opplyst, mens motsatt side forblir mørkt. Under hver 10 min test, overvåke dyrets plassering ved hjelp av datamaskinen for å bestemme lys og mørke belegg ganger og antall overganger.
MERK: Alternativt kan du montere et videokamera over testkammeret og manuelt registrere tiden i hvert kammer. - Forhøyede pluss- eller nulllabyrinter: plasser modellgnagere eller naive dyr på labyrinten og bruk en stoppeklokke for å vurdere tiden som brukes i de lukkede delene av labyrinten. Bestem tiden som brukes i de to inngjerdede "trygge" områdene og to åpne "usikre" områder. Dyr med smerte foretrekker lukkede trygge områder.
MERK: Angstlignende atferd kan testes i enten en null- eller plusslabyrint (10 min). Nulllabyrinten er et sirkulært spor i motsetning til pluslabyrinten, som er "plusstegnformet". Begge har to åpne og to lukkede kvadranter som muliggjør kontinuerlig utforskende oppførsel. Begge er hevet 1 m fra bakken, enten en sirkulær eller plussformet gangvei delt inn i fire like store kvadranter.
- Preferansetest for lys/mørkt sted: plasser hvert dyr i testboksen for stedsinnstilling med en passasje mellom to kamre (10 x 10 x 10 cm3). Ett kammer av apparatet er sterkt opplyst, mens motsatt side forblir mørkt. Under hver 10 min test, overvåke dyrets plassering ved hjelp av datamaskinen for å bestemme lys og mørke belegg ganger og antall overganger.
- Sukrose sprut depresjon test
MERK: Sukrosespruttesten brukes til å bestemme depresjonslignende oppførsel. Splash-testen tillater måling av fraværet av normal pleieadferd som et symptom på depresjon som følge av kronisk smerte.- Score frekvensen, varigheten og latensen av pelsstell i 10 minutter etter å ha sprayet en 10-30% sukroseoppløsning på dorsallaget (~ 250 μL nær haleroten). Har blindede observatører teller antall grooming manøvrer fra videobåndopptak12.
MERK: Denne indeksen har blitt rapportert å være påvirket i gnagermodeller av humørsykdommer, som kronisk mildt stress, og å bli korrigert ved kronisk antidepressiv behandling13.
- Score frekvensen, varigheten og latensen av pelsstell i 10 minutter etter å ha sprayet en 10-30% sukroseoppløsning på dorsallaget (~ 250 μL nær haleroten). Har blindede observatører teller antall grooming manøvrer fra videobåndopptak12.
- Ny objekttest
MERK: Kognitiv dysfunksjon er målbar med den nye objekttesten.- Akklimatisere mus individuelt til et klart plastbur med en åpen topp (56 x 30 x 20 cm) i 1 time. Legg to identiske lekeminifigurer i motsatte hjørner av buret i 5 minutter.
- På testdagen må du akklimatisere dyrene til klarburet igjen i 1 time før du plasserer de to identiske minifigurene i samme posisjon i buret i 5 minutter før du returnerer dem til hjemmeburet.
- Bytt ut en av de opprinnelige figurene med et tydelig annet nytt objekt, returner musene til testburet 4 timer senere, og registrer tiden du bruker på å utforske objektene.
- Beregn den rapporterte anerkjennelsesindeksen (RI) som prosentvis tid brukt på å utforske det nye objektet av total objektutforskningstid14.
- Vurdering av motorisk funksjon
MERK: Blekkflekkmobilitets- og gangforstyrrelsestest15 vurderer motorisk funksjon i ryggsmertemodellen.- Konstruer en tunnel fra et papirhåndklerør kuttet på langs på den ene kanten. Spre tunnelen på et rent stykke skriverpapir.
- Hold musene forsiktig pakket inn i et håndkle til de er rolige. Plasser potene på en stempelpute våt med giftfri India blekk for å belegge dem med blekk eller male blekket på bunnen av musens føtter ved hjelp av en bomullspinne. Slipp musene ved tunnelinngangen og la dem løpe gjennom tunnelen, fange dem på slutten.
- Score poteavtrykk basert på tre parametere: skrittlengde (den vertikale avstanden fra bakenden av ett trykk til det neste), skrittbredde (horisontal avstand mellom avtrykk) og tåspredning (avstanden mellom tærne på motsatte sider av poten).
MERK: Godkjente godbiter kan også brukes til å oppmuntre musen til å komme gjennom tunnelen. Hvis poteavtrykk er smurt eller uklart, må forsøket gjentas.
- Angsttester
Figur 4: Mekanisk og termisk overfølsomhet etter CBP-induksjon. Smerte er målbar en uke etter modellinduksjon og vedvarer i 8 uker. (A) von Frey test. Mekanisk terskeltesting utføres med von Frey-filamenter påført fotputen gjennom et toppbord med opp-ned-metoden som vist her i løpet av 4 uker. Den naive hannterskelen (grønn) er skjult under den blå linjen for de naive hunnmusene. CBP-musene (n = 4 hanner, 4 hunner) viste signifikant økt mekanisk følsomhet sammenlignet med de naive kontrollene (n = 2 hanner, 2 hunner). Toveis ANOVA (Dunnetts multiple comparisons test) ble utført på disse dataene: n = 4 per gruppe. I post-hoc-analyser ga Bonferroni-justering til alle P-verdier for uke-for-uke-sammenligninger av CBP versus naiv alle 11-verdiene < 0,0011. p < 0,0001. (B) Hargreaves test. Varmeterskelen ble testet på fotputen med Hargreaves-testen (50 °C). CBP-musene (n = 12 hanner, 12 hunner) viste signifikant økt varmefølsomhet sammenlignet med de naive kontrollene (n = 6 hanner, 6 hunner). Mann-Whitneys tosidige t-test ble utført for å teste signifikans (p < 0,0001). (C) Kuldefølsomhet. Kuldesondetesten ble utført ved å plassere mus på kuldeplateapparatet avkjølt til -9 °C. Latens for å trekke seg ble registrert som tiden i sekunder fra musens plassering på apparatet til musen begynner å løfte, slikke eller riste. I dataene som er vist, ble en kaldsonde avkjølt til -9 °C plassert under musens bakpote mens musen er buret på toppen av et netting. Alle musene ble testet 1-3 uker etter injeksjon. CBP-musene (n = 4 hanner, 6 hunner) viste signifikant økt kuldefølsomhet sammenlignet med de naive kontrollene (n = 2 hanner, 4 hunner). Mann-Whitneys tosidige t-test ble utført for å teste signifikans (p = 0,0002). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nociceptiv-relatert atferdstesting og dataanalyse
Fremkalte tiltak
Overfølsomhet på fotputen utvikles innen en dag etter urokinaseinjeksjon. Innen 1 uke reduseres terskelen for tilbaketrekking betydelig og vedvarer til eutanasi; Dette er vist gjennom postkirurgisk uke 4 (figur 4A). Paw withdrawal latency analyseres ved hjelp av von Frey up-down metode9 og Hargreaves test. I eksempelet som ble plottet, viste mus med CBP (n = 4 hanner, 4 hunner) signifikant økt mekanisk følsomhet sammenlignet med kontroller (n = 2 hanner, 2 hunner). Modellen forsvinner i uke 6-7. Dette tidskurset tillater evaluering av forbindelser for å dempe overfølsomhet ved kroniske tidspunkter, tilsvarende mange års smerteerfaring hos kliniske pasienter. Den refleksive von Frey-testen kan gjentas flere ganger på en enkelt dag når effekten av en kortvarig forbindelse blir bestemt.
von Frey mekanisk følsomhetstest
Sensitiviteten til fotputen, og dermed alvorlighetsgraden av ryggsmertemodellen, kvantifiseres av antall abstinenshendelser fra graderte von Frey-filamenter med definert strekkfasthet. Stimulering med den laveste fiberen (0,008 g, 1,65) er vanligvis ikke påviselig unntatt i alvorlige tilfeller av allodyni; Den største fiberen (6,0 g, 4,74) er omtrent på størrelse med en stump bindersende, og selv om den kan føles av en mus, vil en naiv mus vanligvis ikke vike ved påføring. Dyr står fritt til frivillig å flytte foten bort fra stimulansen. Den gjennomsnittlige forekomsten av uttakshendelser uttrykkes som antall svar av fem, med null som indikerer ingen uttak, og fem indikerer maksimalt antall uttak. Respons på lavere fibre sammenlignet med kontroller indikerer økt følsomhet. Etter induksjon av denne modellen utvikles statistisk signifikant mekanisk hypersensitivitet innen en uke og vedvarer i flere uker etter injeksjon (figur 4A).
Hargreaves terskeltest for termisk følsomhet
Tilbaketrekking av foten i sekunder etter eksponering for IR-indusert varmestimulus sammenlignes mellom (blant) grupper. En reduksjon i tilbaketrekningsforsinkelsen i sekunder indikerer varmeoverfølsomhet (figur 4B). Dyr står fritt til frivillig å flytte foten bort fra stimulansen.
Kaldsonde termisk overfølsomhet
Ryggsmertemodellen induserer kuldeoverfølsomhet på fotputen. Dyr står fritt til frivillig å flytte foten bort fra stimulansen. En reduksjon i tilbaketrekningsforsinkelsen i sekunder indikerer kuldeoverfølsomhet (figur 4C). Abstinensforsinkelse ble tatt med stoppeklokke fra når kuldestimulansen ble påført musen som viste abstinensatferd, slikking, flikking eller gjentatt løfting av den berørte bakpoten.
Ikke-fremkalte spontane smertetiltak
Figur 5: Endrede ikke-fremkalte atferdsmål. (A) Angst i CBP-modellen. Total tid brukt i det lyse kammeret i den lyse/mørke boksen og antall oppdrettshendelser er signifikant lavere hos mus med CBP, noe som indikerer angst. Enveis ANOVA (Dunnetts multiple comparisons test) ble utført på disse dataene: (n = 4 CBP, n = 6 Naive). Tukey post-hoc test ble utført for å bekrefte forskjeller mellom spesifikke gruppegjennomsnitt. * p < 0,05, ** p < 0,01. (B) Depresjon i CBP-modellen. Den totale tiden brukt på pelsstell og antall ganger preparert under sukrosespruttesten er signifikant lavere hos mus med CBP, mens tiden før pelsstellet starter ble betydelig økt. Enveis ANOVA (Dunnetts multiple comparisons test) ble utført på disse dataene: (n = 4 CBP, n = 6 Naive). Tukey post-hoc test ble utført for å bekrefte forskjeller mellom spesifikke gruppegjennomsnitt. * p < 0,05, *** p < 0,001. (C) Skrittendringer hos mus med CBP-modell. Skrittlengden mellom mus med CBP og naive mus var signifikant forskjellig. Enveis ANOVA (Dunnetts multiple comparisons test) ble utført på disse dataene: n = 4 per gruppe. Tukey post-hoc test ble utført for å bekrefte forskjeller mellom spesifikke gruppegjennomsnitt. ** p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Test av lys/mørke
Et standard lys/mørkt kammer kan brukes til angstanalyse10. Mus med ryggsmertemodellen er betydelig mindre sannsynlig å tilbringe tid i lyskammeret og har færre oppdragelsesadferd, noe som indikerer angst og alvorlighetsgrad av modellen. Alternativt kan de forhøyede null- eller plusslabyrinter brukes til å måle angstlignende atferd. Gnagere med en smertemodell som viser angstlignende atferd, kommer inn og tilbringer mindre tid i de åpne kvadrantene enn naive kontrolldyr (figur 5A).
Depresjon-lignende atferd
Sukrose splash test kan brukes til å vurdere depresjon-lignende atferd i ryggsmerter modell11. Testen vurderer fraværet av pleieatferd som et tegn på depresjon som følge av den induserte smertemodellen12,13. Mus med ryggsmerter steller betydelig færre ganger og i kortere tid totalt, samt tar lengre tid å begynne å stelle (latens til stell) (figur 5B).
Mobilitet motorisk oppførsel
Til slutt kan blekkflekktesten brukes til å skille gangforskjeller mellom modellen og kontrollmus15. Mus med ryggsmerter viser signifikant kortere og bredere skritt sammenlignet med kontroller (figur 5C). Mål skrittlengden for gruppesammenligninger, og legg merke til forskjellene i skrittutseende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne modellen av kroniske ryggsmerter er enkel å indusere, og overfølsomhet etablert innen 1 uke kan vare i opptil (og muligens utover) 8 uker. Dette muliggjør nøyaktig studie av kronisk smertetilstand i motsetning til andre akutte modeller som bare varer i en uke eller to. Mens vi viser modellen i mus, kan den uPA-induserte CBP-modellen også etableres hos rotter2. En fordel med modellen er at det forlengede tidsforløpet provoserer utviklingen av angst- og depresjonslignende atferd, som observeres hos pasienter med kroniske korsryggsmerter. Gitt forekomsten av ryggsmerter16, er det en fordel å kunne utføres i de mer brukte musemodellene i molekylær smerteforskning.
Denne induksjonen av en smertemodell ved bruk av uPA har blitt gjort på samme måte med en intraartikulær injeksjon for å indusere slitasjegikt3, men metoden vist her (intraligament) kan gjøres raskere og med langt mindre risiko for skade på musen. Det er ikke behov for suturering, og ingen risiko for utblødning på grunn av punktering av leddhulen. Siden det er en enkelt injeksjon med lite forberedende arbeid, er det også enkelt å blinde teknikere til grupper for mer nøyaktige resultater.
Hovedbegrensningen til denne modellen innebærer riktig akklimatisering av musene til von Frey-testingen; Faktisk anbefales det at mus akklimatiseres til avlukket og filamentene minst en uke før modellinduksjon for å sikre at flinchresponsen ikke skyldes nyheten i miljøet de er i eller på grunn av å se noe som beveger seg under føttene.
Det er viktig at injeksjonen gjøres i leddbåndene for å sikre maksimal respons på urokinasen og ikke i muskelen som produserer omtrent halvparten av responsen. Siden injeksjonen er nær ryggraden, er det fortsatt viktig å overvåke alle mus daglig etter injeksjon i minst 1 uke for å sikre at det ikke er noen komplikasjoner fra prosedyren. Hvis en mus viser tegn på sløvhet, vekttap, lammelser, unormal oppførsel eller overdreven pelsstell av injeksjonsstedet, bør du vurdere å fjerne musen fra studien.
Fremtidige studier vil undersøke dorsalrotgangliene (DRG) med in vitro patchklemmeopptak. Strømningsanalyse vil bestemme den nevroimmune responsen og tilstedeværelsen av invaderende inflammatoriske celler i DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser. KNW bekrefter ubetalt konsultasjon med NeuroChronix, Bessor Pharma og USA Elixeria BioPharm, Inc.
Acknowledgments
Tilskuddsmidler ble gitt av NIH HEAL UG3 NS123958. Boligfasilitetene ble inspisert og akkreditert av AAALAC. Dyrene ble plassert i Animal Resources Center (ARC) boliganlegg vedlikeholdt av laboratoriepersonalet og Division of Laboratory and Animal Resources (DLAR) ansatte. Prosedyrene for atferdstesting er standardmetoder i feltet som godkjent av American Pain Society og International Association for the Study of Pain. Metoden for eutanasi er i samsvar med anbefalingene fra panelet for eutanasi fra American Veterinary Medical Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals and Consumables | |||
| 70% ethanol | Local Source | ||
| BALB/c mice | Envigo | 20-25 g | |
| Cotton balls | Fisher Scientific | 19-090-702 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 19-062-616 | |
| Isoflurane inhalant anesthetic | MedVet | RXISO-250 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | NGFP7002 | |
| Nitrile exam gloves | Fisher Scientific | ||
| Oxygen tank | Local Source | ||
| Surgical drape, Steri-Drape Utility Sheet, Absorbent Prevention | VWR | 76246-788 | cut into 15 x 15 cm pieces |
| Tygon tubing with 3 mm inner diameter | Grainger | 22XH87 | |
| Equipment | |||
| #11 carbon steel scalpel blades | VWR | 21909-612 | |
| Anesthesia induction chamber | Summit Medical Equipment Company | AS-01-0530-LG | |
| Autoclave | Local Unit | ||
| Biology Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Glass bead sterilizer Germinator 500 | VWR | 102095-946 | |
| IITC Life Sciences Series 8 Model PE34 Hot/Cold Plate Analgesia Meter | IITC | PE34 | |
| Integra Miltex cotton & dressing pliers | Safco Dental Supply | 66-317 | |
| OPTIKA CL31 double arm LED illuminator | New York Microscope Company | OPCL-31 | |
| Plantar Test System with InfraRed Emitter, i. e. Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370-001 and 37370-002 | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | 25607-947 | |
| Small animal heating pad | Valley Vet Supply | 47375 | |
| Student Vannas spring scissors, straight blade | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Table top animal research portable anesthesia workstation “PAM” | Patterson Scientific | AS-01-0007 | |
| Von Frey Filaments | Ugo Basile | 37450-275 |
References
- O'Sullivan, P. B., et al. Back to basics: 10 facts every person should know about back pain. British Journal of Sports Medicine. 54 (12), 698-699 (2020).
- Nauta, H. J., McIlwrath, S. L., Westlund, K. N. Punctate midline myelotomy reduces pain responses in a rat model of lumbar spine pain: evidence that the postsynaptic dorsal column pathway conveys pain from the axial spine. Cureus. 10 (3), 2371 (2018).
- Shuang, F., et al. Establishment of a rat model of lumbar facet joint osteoarthritis using intraarticular injection of urinary plasminogen activator. Scientific Reports. 5 (1), 9828 (2015).
- Reed, N. R., et al. Somatosensory behavioral alterations in a NGF-induced persistent low back pain model. Behavioural Brain Research. 418, 113617 (2022).
- Suh, H. R., Cho, H. -Y., Han, H. C. Development of a novel model of intervertebral disc degeneration by the intradiscal application of monosodium iodoacetate (MIA) in rat. The Spine Journal. 22 (1), 183-192 (2022).
- Kim, H., Hong, J. Y., Lee, J., Jeon, W. -J., Ha, I. -H. IL-1β promotes disc degeneration and inflammation through direct injection of intervertebral disc in a rat lumbar disc herniation model. The Spine Journal. 21 (6), 1031-1041 (2021).
- Millecamps, M., Tajerian, M., Sage, E. H., Stone, L. S. Behavioral signs of chronic back pain in the SPARC-null mouse. Spine. 36 (2), 95-102 (2011).
- La Porta, C., Tappe-Theodor, A. Differential impact of psychological and psychophysical stress on low back pain in mice. Pain. 161 (7), 1442-1458 (2020).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Takao, K., Miyakawa, T. Light/dark transition test for mice. Journal of Visualized Experiments JoVE. (1), e104 (2006).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- David, D. J., et al. Neurogenesis-dependent and -independent effects of fluoxetine in an animal model of anxiety/depression. Neuron. 62 (4), 479-493 (2009).
- Yalcin, I., et al. A time-dependent history of mood disorders in a murine model of neuropathic pain. Biological Psychiatry. 70 (10), 946-953 (2011).
- Madathil, S. K., et al. Astrocyte-specific overexpression of insulin-like growth factor-1 protects hippocampal neurons and reduces behavioral deficits following traumatic brain injury in mice. PloS One. 8 (6), e67204 (2013).
- Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost protocol of footprint analysis and hanging box test for mice applied the chronic restraint stress. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59027 (2019).
- Hassan, S., et al. Identifying chronic low back pain phenotypic domains and characteristics accounting for individual variation: a systematic review. Pain. , (2023).
