Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Kiran Bora; Zhongxiao Wang; Felix Yemanyi; Meenakshi Maurya; Alexandra K. Blomfield; Yohei Tomita; Jing Chen

doi:10.3791/64076

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Methodenartikel

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

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DOI:

10.3791/64076

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7. Juni 2022

Kiran Bora^*¹ , Zhongxiao Wang^*¹ , Felix Yemanyi¹ , Meenakshi Maurya¹ , Alexandra K. Blomfield¹ , Yohei Tomita¹ , Jing Chen¹

¹Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll veranschaulicht einen In-vitro-Endothelzell-Transzytose-Assay als Modell zur Bewertung der Permeabilität der inneren blutretinalen Barriere durch Messung der Fähigkeit menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen, Meerrettichperoxidase über Zellen in caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren.

Zusammenfassung

Eine Dysfunktion der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) trägt zur Pathophysiologie mehrerer vaskulärer Augenerkrankungen bei, was häufig zu Netzhautödemen und anschließendem Sehverlust führt. Die innere Blut-Netzhaut-Barriere (iBRB) besteht hauptsächlich aus retinalem vaskulärem Endothel mit geringer Permeabilität unter physiologischen Bedingungen. Dieses Merkmal der geringen Permeabilität wird durch niedrige parazelluläre Transportraten zwischen benachbarten retinalen mikrovaskulären Endothelzellen sowie durch den transzellulären Transport (Transzytose) durch sie streng reguliert und aufrechterhalten. Die Bewertung der retinalen transzellulären Barrierepermeabilität kann grundlegende Einblicke in die Integrität von iBRB in Gesundheit und Krankheit liefern. In dieser Studie beschreiben wir einen Endothelzell (EC) Transzytose-Assay als in vitro Modell zur Bewertung der iBRB-Permeabilität unter Verwendung von humanen retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs). Dieser Assay bewertet die Fähigkeit von HRMECs, Transferrin und Meerrettichperoxidase (HRP) in rezeptor- bzw. caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren. Vollständig konfluente HRMECs, die auf poröser Membran kultiviert wurden, wurden mit fluoreszenzmarkiertem Transferrin (Clathrin-abhängige Transzytose) oder HRP (Caveolae-vermittelte Transzytose) inkubiert, um die Transferrin- oder HRP-Spiegel zu messen, die in die Bodenkammer übertragen wurden, was auf Transzytosespiegel in der gesamten EC-Monoschicht hinweist. Der Wnt-Signalweg, ein bekannter Signalweg, der iBRB reguliert, wurde moduliert, um die Caveolae-vermittelte HRP-basierte Transzytose-Assay-Methode zu demonstrieren. Der hier beschriebene EC-Transzytose-Assay kann ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der molekularen Regulatoren der EC-Permeabilität und iBRB-Integrität in vaskulären Pathologien und für das Screening von Arzneimittelabgabesystemen sein.

Einleitung

Die menschliche Netzhaut ist eines der am höchsten energieintensiven Gewebe im Körper. Das reibungslose Funktionieren der neuronalen Netzhaut erfordert eine effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen sowie einen begrenzten Fluss anderer potenziell schädlicher Moleküle zum Schutz der Netzhautumgebung, die über die Blut-Netzhaut-Schranke (BRB^{) vermittelt} wird1. Ähnlich wie die Blut-Hirn-Schranke (BBB) im zentralen Nervensystem wirkt die BRB als selektive Barriere im Auge und reguliert die Bewegung von Ionen, Wasser, Aminosäuren und Zucker in und aus der Netzhaut. BRB erhält auch die Netzhauthomöostase und ihr Immunprivileg aufrecht, ind....