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Medicine

एंडोथेलियल सेल ट्रांसकाइटोसिस परख आंतरिक रक्त-रेटिना बाधा पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल के रूप में

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/64076
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल कैवोले-मध्यस्थता ट्रांससेलुलर परिवहन प्रक्रियाओं में कोशिकाओं में हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज परिवहन के लिए मानव रेटिना माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की क्षमता को मापकर आंतरिक रक्त-रेटिना बाधा पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक मॉडल के रूप में एक इन विट्रो एंडोथेलियल सेल ट्रांसकाइटोसिस परख को दर्शाता है।

Abstract

रक्त-रेटिना बाधा (बीआरबी) की शिथिलता कई संवहनी आंख रोगों के पैथोफिज़ियोलॉजी में योगदान देती है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर रेटिना एडिमा और बाद में दृष्टि हानि होती है। आंतरिक रक्त-रेटिना बाधा (आईबीआरबी) मुख्य रूप से शारीरिक परिस्थितियों में कम पारगम्यता के साथ रेटिना संवहनी एंडोथेलियम से बना है। कम पारगम्यता की इस विशेषता को आसन्न रेटिना माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच पैरासेलुलर परिवहन की कम दरों के साथ-साथ उनके माध्यम से ट्रांससेलुलर परिवहन (ट्रांसकाइटोसिस) द्वारा कसकर विनियमित और बनाए रखा जाता है। रेटिना ट्रांससेलुलर बैरियर पारगम्यता का आकलन स्वास्थ्य और बीमारी में आईबीआरबी अखंडता में मौलिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इस अध्ययन में, हम मानव रेटिना माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआरएमईसी) का उपयोग करके आईबीआरबी पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल के रूप में एक एंडोथेलियल सेल (ईसी) ट्रांसकाइटोसिस परख का वर्णन करते हैं। यह परख क्रमशः रिसेप्टर- और कैवोले-मध्यस्थता ट्रांससेलुलर परिवहन प्रक्रियाओं में ट्रांसफरिन और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) के परिवहन के लिए एचआरएमईसी की क्षमता का आकलन करती है। छिद्रपूर्ण झिल्ली पर संवर्धित पूरी तरह से कंफ्लुएंट एचआरएमईसी को फ्लोरोसेंट-टैग किए गए ट्रांसफरिन (क्लैथ्रिन-निर्भर ट्रांसकाइटोसिस) या एचआरपी (कैवोले-मध्यस्थता ट्रांसकाइटोसिस) के साथ इनक्यूबेट किया गया था ताकि निचले कक्ष में स्थानांतरित ट्रांसफरिन या एचआरपी के स्तर को मापा जा सके, जो ईसी मोनोलेयर में ट्रांसकाइटोसिस के स्तर का संकेत है। डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग, आईबीआरबी को विनियमित करने वाला एक ज्ञात मार्ग, कैवोले-मध्यस्थता एचआरपी-आधारित ट्रांसकाइटोसिस परख विधि को प्रदर्शित करने के लिए संशोधित किया गया था। यहां वर्णित ईसी ट्रांसकाइटोसिस परख संवहनी विकृति में ईसी पारगम्यता और आईबीआरबी अखंडता के आणविक नियामकों की जांच और दवा वितरण प्रणालियों की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकता है।

Introduction

मानव रेटिना शरीर में उच्चतम ऊर्जा की मांग वाले ऊतकों में से एक है। तंत्रिका रेटिना के उचित कामकाज के लिए रेटिना पर्यावरण की रक्षा के लिए अन्य संभावित हानिकारक अणुओं के प्रतिबंधित प्रवाह के साथ ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की कुशल आपूर्ति की आवश्यकता होती है, जिसे रक्त-रेटिना बाधा (बीआरबी) 1 के माध्यम से मध्यस्थ किया जाता है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) के समान, बीआरबी आंखों में एक चयनात्मक बाधा के रूप में कार्य करता है, रेटिना के अंदर और बाहर आयनों, पानी, अमीनो एसिड और चीनी के आंदोलन को विनियमित करता है। बीआरबी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एंटीबॉडी और हानिकारक रोगजनकों जैसे संचार कारकों के संपर्क को रोककर रेटिना होमियोस्टैसिस और इसके प्रतिरक्षा विशेषाधिकार को भी बनाएरखता है। बीआरबी डिसफंक्शन कई संवहनी आंख रोगों के पैथोफिज़ियोलॉजी में योगदान देता है, जैसे कि मधुमेह रेटिनोपैथी, उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी), रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमेच्योरिटी (आरओपी), रेटिना नस रोड़ा, और यूवाइटिस, जिसके परिणामस्वरूप वासोजेनिक एडिमा और बाद में दृष्टि हानि 3,4,5 होती है।

बीआरबी में क्रमशः दो अलग-अलग ओकुलर संवहनी नेटवर्क के लिए दो अलग-अलग बाधाएं होती हैं: रेटिना वास्कुलचर और रेटिना के नीचे फेनेस्टेड कोरियोकेशिकार। आंतरिक बीआरबी (आईबीआरबी) मुख्य रूप से रेटिना माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (आरएमईसी) से बना होता है, जो रेटिना माइक्रोवास्कुलचर को अस्तर करता है, जो आंतरिक रेटिना न्यूरोनल परतों को पोषण देता है। दूसरी ओर, रेटिना वर्णक उपकला बाहरी बीआरबी का प्रमुख घटक बनाती है, जो न्यूरोसेंसरी रेटिना और कोरियोकेशिकाओं2 के बीच स्थित है। आईबीआरबी के लिए, आरएमईसी में आणविक परिवहन पैरासेल्युलर और ट्रांससेलुलर दोनों मार्गों के माध्यम से होता है (चित्रा 1)। आईबीआरबी में पदार्थ चयनात्मकता की उच्च डिग्री (i) जंक्शनल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की उपस्थिति पर निर्भर करती है जो आसन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) के बीच पैरासेलुलर परिवहन को प्रतिबंधित करती है, और (ii) एंडोथेलियल कोशिकाओं के भीतर कैवोले मध्यस्थों, ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स के निम्न अभिव्यक्ति स्तर जो ट्रांससेलुलर परिवहन की कम दर को बनाए रखते हैं 1,6,7,8 . पैरासेल्युलर फ्लक्स को विनियमित करने वाले जंक्शनल कॉम्प्लेक्स तंग जंक्शनों (क्लॉडिन, ऑक्लुडिन), पालन जंक्शनों (वीई कैडरिन), और गैप जंक्शनों (कॉनेक्सिन) से बने होते हैं, जिससे पानी और छोटे पानी में घुलनशील यौगिकों के पारित होने की अनुमति मिलती है। जबकि छोटे लिपोफिलिक अणु निष्क्रिय रूप से आरएमईसी के इंटीरियर में फैलते हैं, बड़े लिपोफिलिक और हाइड्रोफिलिक अणुओं की गति को एटीपी-संचालित ट्रांस-एंडोथेलियल मार्गों द्वारा विनियमित किया जाता है जिसमें वेसिकुलर परिवहन और झिल्ली ट्रांसपोर्टर 5,9 शामिल हैं।

वेसिकुलर ट्रांसकाइटोसिस को कैवोलिन-मध्यस्थता कैवोलर ट्रांससाइटोसिस, क्लैथ्रिन-निर्भर (और रिसेप्टर-मध्यस्थता) ट्रांसकाइटोसिस और क्लैथ्रिन-स्वतंत्र मैक्रोपिनोसाइटोसिस (चित्रा 2) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। इन वेसिकुलर परिवहन प्रक्रियाओं में अलग-अलग आकार के पुटिका शामिल होते हैं, जिसमें मैक्रोपिनोसोम सबसे बड़े (200-500 एनएम तक) होते हैं और कैवोले सबसे छोटे (औसतन 50-100 एनएम) होते हैं, जबकि क्लैथ्रिन-लेपित पुटिका70-150 एनएम10 तक होती है। कैवोले एक प्रोटीन कोट के साथ फ्लास्क के आकार के लिपिड-समृद्ध प्लाज्मा झिल्ली इनवेजाइन हैं, जो मुख्य रूप से कैवोलिन -1 से बना है जो लिपिड झिल्ली कोलेस्ट्रॉल और अन्य संरचनात्मक और सिग्नलिंग प्रोटीन को उनके कैवोलिन-मचान डोमेन11 के माध्यम से बांधता है। कैवोलिन प्लाज्मा झिल्ली12 पर कैवोले स्थिरीकरण को बढ़ावा देने के लिए परिधीय रूप से संलग्न कैविन के साथ मिलकर काम करते हैं। कैवोलर झिल्ली अन्य अणुओं जैसे इंसुलिन, एल्ब्यूमिन और परिसंचारी लिपोप्रोटीन के लिए रिसेप्टर्स भी ले जा सकती है, जिसमें उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) शामिल हैं ताकि एंडोथेलियल कोशिकाओं में उनके आंदोलन में सहायतामिल सके। विकास के दौरान, कार्यात्मक बीआरबी का गठन ईसी ट्रांसकाइटोसिस 8 के दमन पर निर्भर करताहै। परिपक्व रेटिना एंडोथेलियम, इसलिए, शारीरिक परिस्थितियों में अन्य एंडोथेलियल कोशिकाओं के संबंध में कैवोले, कैवोलिन -1 और एल्बुमिन रिसेप्टर्स के अपेक्षाकृत कम स्तर होते हैं,जो इसके बाधा गुणों 4,9 में योगदान देते हैं।

क्योंकि आईबीआरबी ब्रेकडाउन कई पैथोलॉजिकल आंखों की स्थितियों की एक प्रमुख पहचान है, विवो और इन विट्रो में रेटिना संवहनी पारगम्यता का आकलन करने के तरीकों को विकसित करना आवश्यक है। ये विधियां समझौता बीआरबी अखंडता के तंत्र में संभावित अंतर्दृष्टि प्रदान करने और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की प्रभावकारिता का आकलन करने में मदद करती हैं। विवो इमेजिंग या मात्रात्मक संवहनी रिसाव परख में वर्तमान आमतौर पर फ्लोरोसेंट (सोडियम फ्लोरेसिन और डेक्सट्रान), कलरमेट्रिक (इवांस ब्लू डाई और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज [एचआरपी] सब्सट्रेट), या रेडियोधर्मी ट्रेसर14 का उपयोग माइक्रोस्कोप इमेजिंग के साथ आसपास के रेटिना ऊतकों में वाहिका से अतिरिक्तता का पता लगाने के लिए या पृथक ऊतक लाइसेट में किया जाता है। संवहनी अखंडता को मापने के लिए एक आदर्श अनुरेखक निष्क्रिय और इतना बड़ा होना चाहिए कि स्वस्थ और बरकरार केशिकाओं के भीतर सीमित रहते हुए समझौता किए गए वाहिकाओं को स्वतंत्र रूप से पार किया जा सके। लाइव फंडस फ्लोरेसिन एंजियोग्राफी (एफएफए) या पृथक रेटिना फ्लैट माउंट में सोडियम फ्लोरेसिन या फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट-संयुग्मित डेक्सट्रान (एफआईटीसी-डेक्सट्रान) को नियोजित करने वाले तरीकों का व्यापक रूप से विवो या एक्स विवो में रेटिना एक्स्ट्रावेसेशन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। एफआईटीसी-डेक्सट्रान में आकार-चयनात्मक अध्ययन15,16,17 के लिए 4-70 केडीए से लेकर विभिन्न आणविक भार में उपलब्ध होने का लाभ है। एफआईटीसी-एल्बुमिन (~ 68 केडीए) संवहनी रिसाव अध्ययनके लिए जैविक प्रासंगिकता का एक वैकल्पिक बड़े आकार का प्रोटीन ट्रेसर है। इवांस ब्लू डाई, इंट्राकार्डियल रूप से19, रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से, या पूंछ की नस20 के माध्यम से, एक बड़ा अणु बनाने के लिए अंतर्जात एल्बुमिन के साथ इसके बंधन पर भी निर्भर करता है जिसे ज्यादातर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक डिटेक्शन या, कम सामान्यतः, फ्लैट माउंट20,21 में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, ये मात्रात्मक या प्रकाश इमेजिंग पद्धतियां अक्सर ट्रांस-एंडोथेलियल परिवहन से पैरासेलुलर परिवहन को अलग नहीं करती हैं। ट्रांससाइटोएड पुटिकाओं के अल्ट्रास्ट्रक्चरल विज़ुअलाइज़ेशन के साथ ट्रांसकाइटोसिस के विशिष्ट विश्लेषण के लिए, एचआरपी जैसे ट्रेसर अणुओं का उपयोग आमतौर पर एंडोथेलियल कोशिकाओं के भीतर ट्रांससाइटोज़ेड पुटिकाओं का पता लगाने के लिए किया जाता है जिन्हें इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप 22,23,24 (चित्रा 3 ए-सी) के तहत देखा जा सकता है।

एंडोथेलियल सेल पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो आईबीआरबी मॉडल का विकास और उपयोग विवो प्रयोगों में पूरक के लिए मजबूत और उच्च थ्रूपुट मूल्यांकन प्रदान कर सकता है और संवहनी रिसाव के आणविक नियामकों की जांच में सहायता कर सकता है। तंग जंक्शनों के पैरासेलुलर परिवहन और अखंडता का आकलन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले परखों में ट्रांस-एंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर), आयनिक चालकता का एक उपाय (चित्रा 4)2,25, और छोटे आणविक भार फ्लोरोसेंट ट्रेसर26 का उपयोग करके इन विट्रो संवहनी रिसाव परख शामिल हैं। इसके अलावा, ट्रांसफरिन-आधारित ट्रांसकाइटोसिस एसेस मॉडलिंग बीबीबी का उपयोग क्लैथ्रिन-निर्भर ट्रांसकाइटोसिस27 का पता लगाने के लिए किया गया है। इसके बावजूद, बीआरबी का मूल्यांकन करने के लिए परख और, विशेष रूप से, विट्रो में रेटिना ईसी कैवोलर ट्रांससाइटोसिस सीमित हैं।

इस अध्ययन में, हम आईबीआरबी पारगम्यता और ईसी ट्रांसकाइटोसिस निर्धारित करने के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में मानव रेटिना माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआरएमईसी) का उपयोग करके ईसी ट्रांसकाइटोसिस परख का वर्णन करते हैं। यह परख क्रमशः रिसेप्टर-मध्यस्थता या कैवोले-निर्भर ट्रांसकाइटोसिस मार्गों के माध्यम से ट्रांसफरिन या एचआरपी के परिवहन के लिए एचआरएमईसी की क्षमता पर निर्भर करती है (चित्रा 2)। एपिकल कक्ष (यानी, फिल्टर इंसर्ट) में पूर्ण संयोजन के लिए संवर्धित एचआरएमईसी को फ्लोरोसेंट-संयुग्मित ट्रांसफरिन (Cy3-Tf) या HRP के साथ इनक्यूबेट किया गया था ताकि केवल ईसी ट्रांसकाइटोसिस के माध्यम से निचले कक्ष में स्थानांतरित ट्रांसफरिन या एचआरपी के स्तर के अनुरूप प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा जा सके। सेल मोनोलेयर की स्थिरता की पुष्टि टीईईआर को मापकर की जा सकती है, जो तंग जंक्शन अखंडता25 को दर्शाता है। टीईईआर और ट्रांसकाइटोसिस परख तकनीक को प्रदर्शित करने के लिए, संवहनी पारगम्यता और ईसी ट्रांसकाइटोसिस के ज्ञात आणविक मॉड्यूलेटर का उपयोग किया गया था, जिसमें संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) 28 और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग (डब्ल्यूएनटी लिगेंड: डब्ल्यूएनटी 3 ए और नॉरिन) 29 शामिल थे।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों को प्रकाश माइक्रोस्कोपी और ईएम छवियों (चित्रा 3) की पीढ़ी के लिए बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। विवो अध्ययनों के लिए प्रोटोकॉल वांग एट अल 24 से प्राप्त किए जा सकते हैं। बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल में संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) द्वारा मानव रेटिना माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआरएमईसी) से जुड़े सभी प्रयोगों को मंजूरी दी गई थी।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. कोटिंग टिशू कल्चर डिश के लिए समाधान: बाँझ ऊतक संवर्धन ग्रेड 1x पीबीएस (पीएच = 7.4) के 500 एमएल में 1 एमएल जिलेटिन स्टॉक समाधान (40% -50%) को भंग करके 0.1% जिलेटिन समाधान तैयार करें। समाधान को 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% जिलेटिन समाधान स्टोर करें। इसे बाँझ स्थिति में अनिश्चित समय के लिए उक्त तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. विकास माध्यम: निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) के अनुसार एंडोथेलियल सेल ग्रोथ बेसल मीडियम (ईबीएम) में ईजीएम की खुराक को भंग करके 500 एमएल एंडोथेलियल सेल ग्रोथ कम्पलीट मीडियम (ईजीएम) तैयार करें। एलिकोट विकास माध्यम 50 एमएल ट्यूबों में और ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। विकास माध्यम की शेल्फ लाइफ 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 महीने है।
  3. ट्रिप्सिन समाधान: 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के लिए, स्टॉक शीशी से 50 एमएल ट्यूबों में एलिकोट करें और 4 डिग्री सेल्सियस (2 सप्ताह तक) या -20 डिग्री सेल्सियस (24 महीने तक) पर स्टोर करें।

2. HRMECs की खेती

  1. प्रारंभिक सेल संस्कृति
    1. कोट सेल कल्चर पेट्री व्यंजन (100 मिमी व्यास x 20 मिमी ऊंचाई) एक लामिनार प्रवाह हुड के तहत 0.1% जिलेटिन समाधान के 5 एमएल के साथ और उन्हें समान कोटिंग के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए हुड में अबाधित रखें।
      नोट: व्यंजनों की जिलेटिन कोटिंग सेल लगाव को बढ़ाती है। वैकल्पिक रूप से, जिलेटिन-लेपित टी 75 कल्चर फ्लास्क का भी उपयोग किया जा सकता है।
    2. कोशिकाओं को बीज देने से पहले, वैक्यूम पंप का उपयोग करके जिलेटिन समाधान को एस्पिरेट करें। उपयोग किए गए एस्पाइरेटर का वैक्यूम दबाव 724 मिमीएचजी तक था।
      नोट: कोटिंग समाधान से सूखने से रोकने के लिए कोशिकाओं को बोने से तुरंत पहले आकांक्षा की जानी चाहिए।
    3. एचआरएमईसी की जमी हुई शीशी (तरल नाइट्रोजन में भंडारण से) को या तो 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान का उपयोग करके या शीशी में गर्म विकास माध्यम जोड़कर पिघलाएं। पिघलने के बाद, सेल निलंबन को 9 एमएल विकास माध्यम में स्थानांतरित करें (यह मानते हुए कि एचआरएमईसी की पिघली हुई शीशी 1 एमएल है)।
      नोट: HRMECs व्यावसायिक रूप से प्राप्त किए गए थे (सामग्री की तालिका)। कोशिकाओं में जोड़े गए विकास माध्यम को हमेशा उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्वप्रमाणित किया जाना चाहिए।
    4. आरटी में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को 200 x g पर घुमाएं और सेल गोली को हटाने से बचने के लिए सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
    5. सेल पेलेट को 10 एमएल विकास माध्यम में पुन: निलंबित करें और परिणामी निलंबन को जिलेटिन-लेपित पेट्री डिश पर स्थानांतरित करें। इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें। आमतौर पर, एचआरएमईसी 72 घंटे के बाद 70% -80% कॉन्फ्लुएंट होते हैं।
      नोट: विकास माध्यम हर दूसरे दिन बदल दिया जाता है।
  2. पारगम्य झिल्ली पर एचआरएमईसी की उपसंस्कृति
    1. एक लैमिनर प्रवाह हुड के तहत 30 मिनट के लिए 0.1% जिलेटिन घोल के 200 μL के साथ प्रत्येक सम्मिलित (एपिकल कक्ष) को कोटिंग करके HRMECs को बोने के लिए सेल कल्चर फिल्टर इंसर्ट (0.4 μm छिद्र आकार पॉली कार्बोनेट झिल्ली के साथ 6.5 मिमी इंसर्ट, 24-वेल प्लेट में रखा गया) तैयार करें। सुनिश्चित करें कि समाधान फ़िल्टर सम्मिलित की पूरी निचली सतह को कवर करता है।
      नोट: प्रत्येक कुएं में एक छिद्रपूर्ण झिल्ली द्वारा अलग एक एपिकल और बेसोलेटरल कक्ष होता है।
    2. इनक्यूबेटर से सुसंस्कृत एचआरएमईसी (चरण 2.1.5.) के साथ पेट्री डिश को निकालें और विकास मीडिया को उत्तेजित करें। संभावित फ्लोटिंग/डेड कोशिकाओं से छुटकारा पाने के लिए एक लामिनार प्रवाह हुड के तहत 10 एमएल 1x PBS के साथ कोशिकाओं को धीरे से 2x कुल्ला करें।
    3. कोशिकाओं को 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 0.5-1 एमएल के साथ अलग करें और पेट्री डिश को 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) में रखें।
    4. 4.5-9 एमएल ग्रोथ मीडिया जोड़कर ट्रिप्सिन गतिविधि को बुझाएं और सेल निलंबन को 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. आरटी में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को 200 x g पर घुमाएं, सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें, और 3 एमएल विकास मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें।
    6. एक मैनुअल हेमोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें और प्रति फिल्टर सम्मिलित 4 x 104 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज (यानी, 1.25 x 105 कोशिकाएं / सेमी2)। प्रत्येक सम्मिलित के लिए सेल निलंबन की मात्रा 250 μL है।
    7. पारगम्य आवेषण वाले कुओं से कोटिंग घोल को एस्पिरेट करें और प्रति सम्मिलित (एपिकल कक्ष) सेल निलंबन के 250 μL को स्थानांतरित करें। एक आवेषण में केवल माध्यम (यानी, कोशिकाओं के बिना) जोड़ें, जिसका उपयोग टीईआर माप के लिए "रिक्त नियंत्रण" के रूप में किया जाएगा। इसके साथ ही, बेसोलेटरल कक्षों में प्रति कुएं 750 μL मध्यम भी जोड़ें।
    8. इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) में पारगम्य आवेषण के साथ 24-वेल प्लेट को 7-12 दिनों के लिए रखें जब तक कि सुसंस्कृत कोशिकाएं पूरी तरह से संकुचित न हो जाएं और ~ 20 Ω सेमी 2 का वांछित टीईआर मान प्राप्त न होजाए।
    9. हर दूसरे दिन विकास के माध्यम को बदलें। मीडिया परिवर्तन के दौरान, सेल मोनोलेयर के विघटन को कम करने के लिए मीडिया को सावधानीपूर्वक तैयार करें और क्रमशः एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों में 250 μL और 750 μL ताजा मीडिया जोड़ें।
      नोट: कुओं के एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों दोनों के लिए विकास माध्यम बदल दिया जाता है।

3. टीईआर माप (चित्रा 4)

  1. सेल सीडिंग के बाद 14 वें दिन (चरण 2.2.9.), उपकला वोल्ट-ओम मीटर (ईवीओएम) विद्युत प्रतिरोध (ईआर) प्रणाली (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके एचआरएमईसी के लिए टीईआर को निम्नानुसार मापें।
  2. ईआर सिस्टम को प्री-चार्ज करें और एसटीएक्स 04 परीक्षण इलेक्ट्रोड का उपयोग करके मीटर कार्यक्षमता की जांच करें। यदि आवश्यक हो, तो जांचें।
  3. इलेक्ट्रोड को मीटर से कनेक्ट करें और इलेक्ट्रोड को पहले 15-20 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में भिगोकर और फिर इसे सेल कल्चर ईजीएम विकास माध्यम में संक्षेप में डुबोकर बराबर करें।
  4. इस बीच, तापमान संतुलन के लिए आरटी पर लैमिनार फ्लो हुड में सेल युक्त 24-वेल प्लेट को 15-20 मिनट के लिए रखें।
    नोट: टीईआर माप तापमान से प्रभावित होते हैं, इसलिए संतुलन चरण आवश्यक है।
  5. टीईईआर माप के लिए, कुओं के एपिकल (250 μL) और बेसोलेटरल (750 μL) कक्षों दोनों में ताजा विकास माध्यम जोड़ें।
  6. इलेक्ट्रोड को सावधानीपूर्वक डुबोकर टीईईआर माप करें ताकि छोटी नोक सम्मिलित हो और लंबी नोक कुएं के निचले हिस्से को छूती है। पहले रिक्त नियंत्रण में प्रतिरोध को मापें। प्रत्येक सम्मिलित के लिए, टीईआर को तीन प्रतियों में मापें।
    नोट: माप के बीच इलेक्ट्रोड को कुल्ला करने के लिए, संस्कृति मीडिया का उपयोग किया जाता है। सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड स्थिर रीडिंग के लिए इंसर्ट के निचले भाग में 90 ° कोण पर रखा गया है।
  7. सूत्र का उपयोग करके मोनोलेयर में विद्युत प्रतिरोध (Ω सेमी2 में) की गणना करें, टीईईआर = शुद्ध प्रतिरोध (Ω) फिल्टर सम्मिलित (सेमी2) का x सतह क्षेत्र; यहां, शुद्ध प्रतिरोध प्रत्येक कुएं (कोशिकाओं के साथ विकास माध्यम) और रिक्त कुएं (केवल विकास माध्यम) के प्रतिरोध के बीच का अंतर है।
  8. टीईईआर मान ~ 20Ω सेमी 2 तक पहुंचने के बाद ही कोशिकाओं का आगे का उपचार करें। यदि वांछित टीईआर स्तर तक नहीं पहुंचा जाता है, तो प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें और अगले दिन टीईईआर को मापें।
    नोट: एचआरएमईसी कंफ्लुएंसी को विशिष्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान के साथ सेल आकार (माइक्रोस्कोप के तहत) की रूपात्मक परीक्षा और / या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला होने के साथ सेल जंक्शन प्रोटीन की उपस्थिति द्वारा भी मान्य किया जा सकता है।

4. ट्रांसकाइटोसिस परख

  1. Cy3-टैग किए गए ट्रांसफरिन का उपयोग करके क्लैथ्रिन-मध्यस्थता इन विट्रो ट्रांसकाइटोसिस परख (चित्रा 5)
    1. लगभग 20Ω सेमी 2 के आसपास टीईआर मानों के साथ संपर्क तक पहुंचने पर, सीरम लिगैंड के साथ उपचार से पहले दोनों कक्षों (एपिकल चैंबर:250 μL और बेसोलेटरल चैंबर: 750 μL) में ईबीएम (सीरम-कम माध्यम) में 0.5% एफबीएस का उपयोग करके कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 24 घंटे के लिए वंचित करता है। सीरम-कम ईबीएम का उपयोग पूरे परख में किया गया था।
    2. कोशिकाओं (चरण 4.1.1 में सीरम-कम माध्यम का उपयोग करके) को एपिकल कक्ष में फ्लोरोसेंट (साइनिन 3)-टैग किए गए ट्रांसफरिन लिगैंड (Cy3-Tf) (40 μg / mL की अंतिम एकाग्रता) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: Cy3-Tf युक्त प्लेटों को प्रकाश से बचाया जाना चाहिए ताकि उनमें एल्यूमीनियम पन्नी लपेटकर Cy3-Tf के फोटोब्लीचिंग से बचा जा सके और रोशनी बंद होने के साथ सेल कल्चर हुड में प्रयोग किया जा सके।
    3. 1 घंटे के बाद, प्लेट को बर्फ पर रखें और फ्री अनबाउंड Cy3-Tf को हटाने के लिए RT पर सीरम-कम माध्यम के साथ मोनोलेयर को एपिकली और बेसोलेटरल रूप से 4x (3-5 मिनट प्रति धोने) धो लें।
      नोट: मुक्त ट्रेसर अणुओं को हटाने और पैरासेलुलर मार्ग से संभावित रिसाव के बिना ट्रांसकाइटोसिस के सटीक पढ़ने की अनुमति देने के लिए धोना आवश्यक है।
    4. कोशिकाओं वाले अच्छी तरह से धोए गए फ़िल्टर इंसर्ट में ताजा सीरम-कम माध्यम (चरण 4.1.1 में) जोड़ें और इंसर्ट को पूर्व-गर्म सीरम-कम माध्यम वाले 24-वेल प्लेट के ताजा कुओं में स्थानांतरित करें।
    5. इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) में एक और 90 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और फिर बेसोलेटरल कक्ष से माध्यम एकत्र करें।
    6. फ्लोरेसेंस डिटेक्टर का उपयोग करके बेसोलेटरल कक्ष से समाधान की प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्ड करें। सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों (आरएफयू) के रूप में मापा जाने वाला प्रतिदीप्ति तीव्रता का स्तर, क्लैथ्रिन-निर्भर ट्रांसकाइटोसिस के माध्यम से एचआरएमईसी मोनोलेयर में Cy3-Tf कॉम्प्लेक्स ट्रांससाइटोस की मात्रा को इंगित करता है।
  2. एचआरपी का उपयोग करके कैवोले-मध्यस्थता इन विट्रो ट्रांसकाइटोसिस परख (चित्रा 6)
    1. लगभग 20Ω सेमी 2 के आसपास टीईआर मानों के साथ पूर्ण संयोजन तक पहुंचने पर, सीरम उपचार से पहले 0.5% एफबीएस युक्त ईबीएम माध्यम (सीरम-कम माध्यम) का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को वंचित करता है (चरण 4.1.1 में)। सीरम-कम ईबीएम माध्यम का उपयोग पूरे परख में किया गया था।
    2. वांछित उपचार और वाहन नियंत्रण के साथ एपिकल कक्ष में कोशिकाओं का इलाज करें।
      नोट: यहां, हमने एचआरएमईसी में डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग द्वारा कैवोले-मध्यस्थता ट्रांसकाइटोसिस के विनियमन को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में डब्ल्यूएनटी मॉड्यूलेटर का उपयोग किया है: मानव पुनः संयोजक नोरिन और डब्ल्यूएनटी अवरोधक एक्सएवी 939। एक विशिष्ट प्रयोग में, कोशिकाओं को निम्नलिखित सांद्रता के साथ एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) में24 घंटे के लिए इलाज किया गया था: नॉरिन (125 एनजी / एमएल), नॉरिन (125 एनजी / एमएल) + एक्सएवी 939 (10 μM), और वाहन नियंत्रण समाधान। इसके अलावा, WNT3a-वातानुकूलित माध्यम (L WNT-3A कोशिकाओं से निर्मित) का भी उपयोग किया गया था।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एचआरपी (5 मिलीग्राम / एमएल) के साथ एपिकल कक्ष में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    4. इसके बाद, बर्फ पर 24-वेल प्लेट रखें और मुक्त बाह्य एचआरपी को हटाने के लिए पी बफर (10 एमएम एचईपीईएस पीएच = 7.4, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 10 एमएम ग्लूकोज, 3 एमएम सीएसीएल2, 145 एमएम एनएसीएल) के साथ एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों को 6x की तीव्रता से धोएं।
      नोट: मुक्त ट्रेसर अणुओं को हटाने और पैरासेलुलर मार्ग से संभावित रिसाव के बिना ट्रांसकाइटोसिस के सटीक पढ़ने की अनुमति देने के लिए धोना आवश्यक है।
    5. एपिकल कक्ष में ताजा सीरम-कम माध्यम (चरण 4.1.1 में) जोड़ें और इंसर्ट को पूर्व-गर्म मीडिया वाले एक ताजा कुएं में स्थानांतरित करें।
    6. बेसोलेटरल कक्ष से माध्यम एकत्र करने से पहले इनक्यूबेटर में अतिरिक्त 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर मोनोलेयर को इनक्यूबेट करें।
    7. एकत्रित माध्यम में, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एचआरपी फ्लोरोजेनिक पेरोक्सीडेज सब्सट्रेट (सामग्री की तालिका) के 100 μL जोड़ें, और स्टॉप समाधान के 100 μL के साथ प्रतिक्रिया को रोकने से पहले 10 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
    8. फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर का उपयोग करके मीडिया में एचआरपी सब्सट्रेट प्रतिक्रिया उत्पाद के स्तर का पता लगाएं। प्रतिदीप्ति तीव्रता को 420 एनएम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य (325 एनएम उत्तेजना के साथ) और सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों (आरएफयू) के रूप में मापें। मान कैवोले-मध्यस्थता ट्रांससाइटोसिस के माध्यम से एचआरएमईसी परत में एचआरपी ट्रांससाइटोसिस के स्तर को इंगित करते हैं।
      नोट: यहां उपयोग किया जाने वाला फ्लोरोसेंट उत्पाद (सामग्री की तालिका) फोटोब्लीच नहीं करता है। फोटोब्लीचिंग के खिलाफ प्रकाश सुरक्षा की आवश्यकता नहीं है।

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Representative Results

रेटिना संवहनी एंडोथेलियम की ईएम छवियां विवो में एंडोथेलियल कोशिकाओं में ट्रांससाइटोटिक वेसिकुलर परिवहन और कैवोलर पुटिकाओं को दिखाती हैं।
ईसी ट्रांसकाइटोसिस को रेटिना क्रॉस-सेक्शन के भीतर विवो में एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 ए) के तहत एचआरपी युक्त रक्त वाहिकाओं को प्रतिबिंबित करने वाले गहरे भूरे रंग के अवक्षेप के साथ देखा जा सकता है और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) का उपयोग करके एचआरपी युक्त ट्रांससाइटोटिक पुटिकाओं (चित्रा 3 बी, सी) के इलेक्ट्रॉन-घने अवक्षेप संकेत के रूप में, इस प्रकार आईबीआरबी में ईसी ट्रांसकाइटोसिस का प्रदर्शन होता है। बड़े पुटिकाएं संभावित रूप से मैक्रोपिनोसाइटोसिस (सफेद तीर) को दर्शाती हैं; चित्रा 3 बी), और छोटे पुटिकाओं की संभावना कैवोलर पुटिकाओं (सफेद तीर के निशान) का प्रतिनिधित्व करती है; चित्रा 3 सी)। इसके अलावा, रेटिना रक्त वाहिकाओं में कैवोले के स्थानीयकरण को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 डी) के तहत रक्त वाहिका में आइसोलेक्टिन (ईसी मार्कर) के साथ कैवोले मार्कर सीएवी -1 एंटीबॉडी के सह-धुंधलापन के रूप में देखा जा सकता है। इम्यूनोगोल्ड-लेबल सीएवी -1 एंटीबॉडी (काले बिंदु; चित्र 3E) रेटिना संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं के भीतर। विवो अध्ययनों के लिए प्रोटोकॉल वांग एट अल 24 से प्राप्त किए जा सकते हैं।

वीईजीएफ उपचार ट्रांस-एंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) द्वारा मापा गया एचआरएमईसी में संवहनी पारगम्यता बढ़ाता है
ईसी ट्रांसकाइटोसिस परख करने से पहले, एचआरएमईसी को पूर्ण संयोजन के लिए संवर्धित किया जाना चाहिए, जो विशिष्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान दिखाता है, जिसे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है। पूर्ण सेल कंफ्लुएंसी को ट्रांस-एंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) माप (चित्रा 4 ए) द्वारा मान्य किया जा सकता है, जिसमें कंफ्लुएंट एचआरएमईसी30 के लिए ~20 Ω सेमी 2 तक पहुंचने वाली रीडिंग होती है, जो तंग या गैप जंक्शनों के माध्यम से मोनोलेयर में पैरासेलुलर परिवहन के निम्न स्तर का संकेत देती है। संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) का उपयोग टीईआर माप प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया गया था। वीईजीएफ के साथ एचआरएमईसी के उपचार ने टीईआर स्तर को काफी कम कर दिया, जो एचआरएमईसी पारगम्यता में वृद्धि को दर्शाता है (चित्रा 4 बी)। नियंत्रण कोशिकाओं में टीईआर मूल्यों में कमी भी देखी गई, संभवतः संस्कृति की अवधि और अलग-अलग समय अंतराल पर लिए गए कईमापों के कारण जो कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकते हैं।

CY3-transferrin के परिवहन का उपयोग HRMECs में क्लैथ्रिन-मध्यस्थता ईसी ट्रांससाइटोसिस का आकलन करने के लिए किया जा सकता है
क्लैथ्रिन-मध्यस्थता ईसी ट्रांसकाइटोसिस के लिए, छिद्रपूर्ण झिल्ली पर संवर्धित कंफ्लुएंट एचआरएमईसी को फ्लोरोसेंट (Cy3)-टैग किए गए ट्रांसफरिन के साथ इनक्यूबेट किया गया था ताकि ईसी (चित्रा 5 ए) में इसके परिवहन का पता लगाया जा सके। यह परख इस तथ्य का फायदा उठाती है कि ट्रांसफरिन का परिवहन एक रिसेप्टर-मध्यस्थता ट्रांसकाइटोसिस प्रक्रिया है। सी3-ट्रांसफरिन एंडोसाइटोसिस (लाल) को एचआरएमईसी मोनोलेयर में परमाणु दाग, डीएपीआई (नीला) (चित्रा 5 बी) के साथ सह-दाग में देखा गया था, जो कोशिकाओं में इसके उत्थान की पुष्टि करता है। (Cy3)-टैग किए गए ट्रांसफरिन की प्रतिदीप्ति तीव्रता को एंडोसाइटोसिस प्रक्रिया का आकलन करने के लिए छवियों से निर्धारित किया जा सकता है और / या क्लेथ्रिन-मध्यस्थता ट्रांसकाइटोसिस27 के स्तर को निर्धारित करने के लिए कुओं के बेसोलेटरल कक्ष से एकत्र किए गए माध्यम से मापा जा सकता है।

डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग एचआरपी-आधारित परख में एचआरएमईसी में कैवोले-मध्यस्थता ईसी ट्रांसकाइटोसिस को नियंत्रित करता है
इससे पहले, यह पाया गया है कि डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग आईबीआरबी24 को बनाए रखने के लिए रेटिना संवहनी ईसी में एमएफएसडी 2 ए-निर्भर कैवोले-मध्यस्थता ट्रांसकाइटोसिस को नियंत्रित करता है। डब्ल्यूएनटी मॉड्यूलेटर के प्रभावों का मूल्यांकन एचआरपी-आधारित इन विट्रो ट्रांसकाइटोसिस परख (चित्रा 6 ए) में किया गया था। डब्ल्यूएनटी पाथवे एक्टिवेटर्स के साथ पूरी तरह से कंफ्लुएंट एचआरएमईसी का इलाज किया गया था: डब्ल्यूएनटी 3 ए-वातानुकूलित माध्यम (डब्ल्यूएनटी 3 ए-सीएम) या मानव पुनः संयोजक नोरिन, डब्ल्यूएनटी / β-कैटेनिन सिग्नलिंग अवरोधक एक्सएवी 939 के साथ या उसके बिना, और एचआरएमईसी में ट्रांससाइटोस एचआरपी के स्तर का पता लगाया गया था। Wnt3a-CM या Norrin के साथ उपचार से ट्रांससाइटोसेड HRP के स्तर में काफी कमी आई है, जो कम कैवोलर ट्रांससाइटोसिस का संकेत है। इसके अलावा, डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग अवरोधक एक्सएवी 939 के साथ संयुक्त उपचार ने एचआरएमईसी में ट्रांससाइटोएस एचआरपी के अनियमित स्तर का प्रदर्शन किया, इसलिए एचआरएमईसी पारगम्यता (चित्रा 6 बी, सी) 24 पर डब्ल्यूएनटी एक्टिवेटर्स के प्रभावों को कम किया।

Figure 1
चित्रा 1: रेटिना संवहनी एंडोथेलियम में परिवहन के विभिन्न मार्ग। रेटिना माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (आरएमईसी) में आणविक प्रवाह के विभिन्न मार्गों को दिखाने वाला योजनाबद्ध चित्रण। आंतरिक रक्त-रेटिना बाधा के भीतर रेटिना संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं में परिवहन दो प्रमुख मार्गों के माध्यम से होता है: ट्रांससाइटोसिस सहित पैरासेल्युलर और ट्रांससेलुलर मार्ग। इस आंकड़े को येमान्यी एट अल.5 की अनुमति से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एंडोथेलियल कोशिकाओं में ट्रांससाइटोटिक वेसिकुलर परिवहन मार्गों का अवलोकन और उनके संबंधित इन विट्रो मूल्यांकन। एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) में, मैक्रोमोलेक्यूल्स का ट्रांससेलुलर ट्रांसलोकेशन तीन मुख्य प्रकार के पुटिकाओं के माध्यम से होता है: कैवोलर पुटिकाएं (50-100 एनएम), क्लैथ्रिन-लेपित पुटिकाएं (70-150 एनएम), या क्लैथ्रिन-स्वतंत्र मैक्रोपिनोसोम (200-500 एनएम)। कैवोले प्लाज्मा झिल्ली में फ्लास्क के आकार के, गोलाकार, लिपिड युक्त माइक्रोडोमेन होते हैं, जो कैवोलिन और कैविन से बने होते हैं। इन पुटिकाओं के माध्यम से ट्रांसकाइटोसिस के स्तर को ईसी संस्कृति में फ्लोरेसेंस-आधारित इन विट्रो परखों द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जिसमें फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट, फ्लोरोसेंट-टैग्ड ट्रांसफरिन (Cy3-Tf), या टेट्रामिथाइलरोडामाइन-टैग किए गए गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (टीएमआर-बीएसए) के साथ संयुक्त हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) का उपयोग किया जाता है। जबकि प्रत्येक मार्ग में अलग-अलग विशेषताएं और परिवहन तंत्र होते हैं, अतिव्यापी कार्य और पदार्थ परिवहन हो सकता है, विशेष रूप से कैवोलर परिवहन और मैक्रोपिनोसाइटोसिस के बीच, दोनों क्लैथ्रिन-स्वतंत्र हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(A) प्रकाश माइक्रोस्कोप छवि 3 महीने के जंगली प्रकार (WT) माउस रेटिना अनुभाग से एक HRP से भरी रक्त वाहिका लुमेन दिखाती है, जो 3,3'-डायमिनो बेंजिडाइन (DAB) (काला) से सना हुआ है। एचआरपी को डब्ल्यूटी चूहों में रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन दिया गया था, इसके बाद आंख अलगाव और ऊतक एम्बेडिंग हुई। हल्के भूरे रंग के अवक्षेप के रूप में एचआरपी के रंगीन पता लगाने के लिए इलेक्ट्रॉन-घने डीएबी सब्सट्रेट के साथ पतले वर्गों को दाग दिया गया था और रेटिना रक्त वाहिका लुमेन के भीतर एचआरपी को प्रकट करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत चित्रित किया गया था। (बी, सी) नमूनों को तब एचआरपी युक्त ट्रांससाइटोटिक पुटिकाओं की कल्पना करने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) अल्ट्राथिन सेक्शनिंग के साथ संसाधित किया गया था, जो आईबीआरबी में ईसी ट्रांसकाइटोसिस को दर्शाता है। टीईएम छवियों में आरएमईसी के भीतर एचआरपी से भरे रक्त वाहिका लुमेन और एचआरपी युक्त पुटिकाओं के साथ 3 महीने के डब्ल्यूटी माउस का रेटिना खंड दिखाई देता है। (बी) एक सामयिक बड़ी पुटिका संभावित रूप से ईसीएस के भीतर मैक्रोपिनोसोम (तीर) को दर्शाती है, जिसमें ल्यूमिनल साइड पर लाल रक्त कोशिकाओं (तारांकन) की उपस्थिति होती है। (सी) छोटे पुटिकाओं की संभावना कैवोलर पुटिकाओं (तीर) की होती है। (डी) सीएवी -1 एंटीबॉडी (हरा) और आइसोलेक्टिन बी 4 (आईबी4, लाल, ईसी मार्कर) का इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सह-धुंधलापन 3 महीने पुराने डब्ल्यूटी माउस रेटिना (डीएपीआई, नीला) में रेटिना रक्त वाहिकाओं में सीएवी -1 के स्थानीयकरण को दर्शाता है। (ई) रेटिना ईसी के भीतर इम्यूनोगोल्ड-लेबल सीएवी -1 (काले बिंदु, तीर) की टीईएम छवि; इनसेट एक सीएवी -1 पॉजिटिव कैवोलर पुटिका की एक आवर्धित छवि दिखाता है। संक्षेप: एचआरपी = हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज; जीसीएल = नाड़ीग्रन्थि कोशिका परत; आईपीएल = आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म परत; आईएनएल = आंतरिक परमाणु परत; ओपीएल = बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत; ओएनएल = बाहरी परमाणु परत; आरपीई = रेटिना वर्णक उपकला; ई = एंडोथेलियल सेल; और एल = रक्त वाहिका लुमेन। आवर्धन: (ए, डी) 20x। स्केल सलाखों: (ए) 50 μm, (B) 2 μm, (D) 100 μm, और (C, E) 200 nm। पैनल (ई) को वांग एट अल .24 की अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: वीईजीएफ उपचार के बाद एचआरएमईसी में पूरी तरह से कंफ्लुएंट एचआरएमईसी का सत्यापन और संवहनी पारगम्यता में वृद्धि। (ए) योजनाबद्ध आरेख जो सेल मोनोलेयर की संवहनी पारगम्यता और अखंडता के आकलन के रूप में ट्रांस-एंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) माप के लिए कुओं के एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों में इलेक्ट्रोड की स्थिति को दर्शाता है। (बी) संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) के साथ पूर्व उपचार के साथ और बिना एचआरएमईसी की पूरी तरह से कंफ्लुएंट एचआरएमईसी की टीईआर रिकॉर्डिंग दिखाने वाला ग्राफ। 18 घंटे (18 एच) के बाद वीईजीएफ के साथ उपचार के परिणामस्वरूप पूरी तरह से कंफ्लुएंट एचआरएमईसी31 में टीईआर कम हो जाता है। p≤0.001. पैनल (बी) को टोमिता एट अल .31 की अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ट्रांसफरिन (टीएफ) का उपयोग करके एचआरएमईसी में क्लैथ्रिन-मध्यस्थता ईसी ट्रांसकाइटोसिस परख का एक योजनाबद्ध चित्रण। (ए) एचआरएमईसी को जिलेटिन-लेपित इंसर्ट पर पूर्ण संयोजन के लिए विकसित किया गया था और परख से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर भूखा रहा सीरम। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए फ्लोरोसेंट Cy3-संयुग्मित ट्रांसफरिन (Cy3-Tf) के साथ एपिकल रूप से इनक्यूबेट किया गया था। इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को अनबाउंड बाह्य Cy3-Tf को हटाने के लिए एक ताजा माध्यम के साथ गहन रूप से धोया गया था। ताजा माध्यम वाले इंसर्ट को तब बेसोलेटरल कक्ष में गर्म माध्यम वाली एक नई प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया था, और कोशिकाओं को एंडोसाइटोस्ड Cy3-Tf जारी करने के लिए अतिरिक्त 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। बेसोलेटरल कक्ष से माध्यम एकत्र किया जा सकता है, और क्लैथ्रिन-निर्भर (Cy3-Tf) ईसी ट्रांसकाइटोसिस के अनुरूप प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग करके मापा जा सकता है। (ख) डीएपी (नीले) से सना एचआरएमईसी में साइ3-ट्रांसफरिन (लाल) देखा गया, जो एंडोसाइटोसिस की पुष्टि करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग एक इन विट्रो एचआरपी-आधारित परख में कैवोले-मध्यस्थता एचआरएमईसी ट्रांसकाइटोसिस को नियंत्रित करता है। (ए) योजनाबद्ध चित्रण कैवोले-मध्यस्थता ट्रांससाइटोसिस का आकलन करने के लिए एचआरपी-आधारित परख का प्रदर्शन करता है। जिलेटिन-लेपित इंसर्ट पर संवर्धित पूरी तरह से कंफ्लुएंट एचआरएमईसी को उपचार से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) + ईबीएम माध्यम में रात भर भूखा रखा गया था। एपिकल कक्ष में ईसी मोनोलेयर को 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए वांछित उपचार के साथ इलाज किया गया था। बाद में, कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) के साथ इनक्यूबेट किया गया और मुक्त बाह्य एचआरपी को हटाने के लिए गहन रूप से धोया गया। ताजा माध्यम वाले इंसर्ट को तब बेसोलेटरल कक्षों में गर्म माध्यम वाली एक नई प्लेट में स्थानांतरित किया गया था, और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था। बेसोलेटरल कक्ष से माध्यम एकत्र किया गया था, और एचआरपी स्तरों को फ्लोरोजेनिक पेरोक्सीडेज सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया द्वारा निर्धारित किया गया था। कैवोले-मध्यस्थता ईसी ट्रांसकाइटोसिस के अनुरूप प्रतिदीप्ति को प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया था। (बी, सी) इस उदाहरण में, कोशिकाओं को डब्ल्यूएनटी पाथवे मॉड्यूलेटर के साथ इलाज किया गया था: डब्ल्यूएनटी 3 ए-वातानुकूलित माध्यम (डब्ल्यूएनटी 3 ए-सीएम) या इसके नियंत्रण-वातानुकूलित माध्यम (Ctrl-CM), मानव पुनः संयोजक नोरिन या इसके नियंत्रण समाधान (Ctrl), और Wnt / β-कैटेनिन सिग्नलिंग अवरोधक (XAV939) या इसके वाहन नियंत्रण (वाहन) के साथ या उसके बिना। एचआरएमईसी कैवोलर ट्रांसकाइटोसिस पर उनके प्रभावों का मूल्यांकन एचआरपी-आधारित परख में किया गया था। उपचार के बाद, बेसोलेटरल कक्ष में स्थानांतरित एचआरपी के स्तर को मापा गया, जो एचआरएमईसी में कैवोले-मध्यस्थता ईसी ट्रांसकाइटोसिस स्तरों का संकेत देता है। डब्ल्यूएनटी एक्टिवेटर्स ने एचआरपी-आधारित ट्रांसकाइटोसिस के स्तर को कम कर दिया, जिसे एक्सएवी 939 द्वारा उलट दिया गया था। * पी≤0.05, ** पी≤0.01. पैनल (बी) और (सी) को वांग एट अल 24 की अनुमति से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

बीआरबी रेटिना स्वास्थ्य और बीमारी में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। संवहनी पारगम्यता का आकलन करने वाली इन विट्रो तकनीकें बाधा (बीआरबी / बीबीबी) विकास और कार्य से संबंधित अध्ययनों में महत्वपूर्ण उपकरण साबित हुई हैं। यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग ईसी ट्रांसकाइटोसिस अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने या बीआरबी पारगम्यता को प्रभावित करने वाले संबंधित आणविक मॉड्यूलेटर का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। इन विट्रो ईसी ट्रांसकाइटोसिस परख के पास संवहनी पारगम्यता के मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले विवो परख या तकनीकों में कई फायदे हैं। वे उच्च थ्रूपुट के साथ प्रदर्शन करने के लिए तेज हैं और आनुवंशिक और औषधीय मॉड्यूलेशन दोनों के साथ विशिष्ट सिग्नलिंग मार्गों के कई अलग-अलग चर या पृथक अणुओं के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। शुद्ध ईसी संस्कृति प्रणाली पशु भिन्नता को नष्ट कर देती है जैसा कि अक्सर विवो में देखा जाता है और अन्य सेलप्रकारों 32 द्वारा लक्ष्य अणुओं के संभावित संशोधन या एंडोसाइटोसिस के प्रभावों को भी सीमित करता है। एचआरएमईसी कोशिकाओं की हैंडलिंग आसान है, अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपलब्ध बुनियादी सेल कल्चर उपकरणों की आवश्यकता होती है, और सेल संस्कृति अक्सर विवो पशु प्रयोगों की तुलना में अधिक लागत कुशल होती है। यद्यपि इन विट्रो ट्रांसकाइटोसिस परख विवो शारीरिक स्थितियों33 में पूरी तरह से प्रतिकृति नहीं करते हैं, वे विवो अध्ययन में पूरक करने और बीआरबी नियंत्रण पर हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए मूल्यवान उपकरण हो सकते हैं।

कई महत्वपूर्ण तकनीकी मापदंडों पर विचार करने की आवश्यकता होती है, जिसमें फिल्टर डालने का छिद्र आकार, सबस्ट्रेटम का प्रकार और सेल सीडिंग घनत्व शामिल हैं। पारगम्य फिल्टर इंसर्ट के एक बड़े छिद्र आकार के परिणामस्वरूप अवांछनीय प्रवास और इंसर्ट के नीचे कोशिकाओं की वृद्धि हो सकती है, जिससे परिणामी माप और इसकी व्याख्या भ्रमित हो सकती है। हालांकि यह प्रवृत्ति विभिन्न सेल प्रकारों के साथ भिन्न हो सकती है, छिद्र व्यास ≤1 μm अधिकांश सेल प्रकारों के लिए अच्छी तरह से काम करता है, जिसमें ईसी34 भी शामिल है। एक उपयुक्त सबस्ट्रेटम का चयन एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि कुछ कोशिकाएं छिद्रपूर्ण सबस्ट्रेटम पर उगाए जाने पर उच्च ध्रुवीयता और अधिक भेदभाव का प्रदर्शन करती हैं और दोनों तरफ एक संस्कृति माध्यम में स्नान करती हैं। उपचारित माइक्रोपोरस पॉली कार्बोनेट फिल्टर ईसी के लिए एक बेहतर विकल्प हैं क्योंकि वे पतले होते हैं और इम्यूनोसेस35 के लिए न्यूनतम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के साथ मोनोलेयर के बेसोलेटरल ज़ोन में अभिकर्मकों की अधिक पहुंच प्रदान करते हैं। अंत में, पूरी तरह से कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए, सेल सीडिंग घनत्व को विशिष्ट सेल प्रकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। जबकि बहुत कम सीडिंग घनत्व भेदभाव की स्थिति को प्रभावित कर सकता है, दूसरी ओर, बहुत अधिक सीडिंग घनत्व, मोनोलेयर के बजाय कई सेल परतों का निर्माण करने वाली कोशिकाओं को तेजी से संलग्न करने का पक्ष ले सकता है, अंततः सेलुलर आकृति विज्ञान को बदल सकता है और इसके परिणामस्वरूप गलत ट्रांसकाइटोसिस माप37 हो सकता है।

ईसी मोनोलेयर का गठन और अखंडता इस परख के लिए महत्वपूर्ण है और वांछित टीईईआर की उपलब्धि सुनिश्चित करने के लिए टीईईआर मूल्यों को मापकर मान्य किया जा सकता है। एक रिक्त नियंत्रण, यानी, कोशिकाओं के बिना एक फिल्टर सम्मिलित, को हमेशा पारगम्य झिल्ली में प्रतिरोध के बेसल स्तर को मापने के लिए शामिल किया जाना चाहिए, जिसे सेल इंसर्ट से घटाया जाना चाहिए। तापमान, सेल मार्ग संख्या, संस्कृति माध्यम की संरचना, संस्कृति अवधि और जंक्शन लंबाई परिवर्तन जैसे विभिन्न कारक सभी टीईआरमानों 25,38,39 में मामूली बदलाव का कारण बन सकते हैं। टीईईआर मूल्य भी कुछ उपचारों से बहुत प्रभावित होते हैं, जैसे कि वीईजीएफ। प्रारंभ में पोत पारगम्यता40 के एक शक्तिशाली प्रेरक के रूप में खोजा गया, वीईजीएफ पैरासेल्युलर परिवहन को विनियमित करके संवहनी पारगम्यता को प्रभावित करता है, यानी, तंग जंक्शन प्रोटीन जेडओ -1, ऑक्लुडिन के फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से, और तंग जंक्शन प्रोटीन क्लॉडिन -541,42 के साथ-साथ ट्रांससेलुलर परिवहन43 के विघटन के माध्यम से। . मोनोलेयर गठन का अतिरिक्त सत्यापन रूपात्मक परीक्षा और धुंधला होने के साथ विशिष्ट जंक्शन प्रोटीन की उपस्थिति के साथ किया जा सकता है। संस्कृति के दौरान, नियमित अंतराल पर एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों दोनों में मीडिया को बदलने की सिफारिश की जाती है ताकि कोशिकाओं को आदर्श पीएच रेंज और पोषक तत्वों की उपलब्धता के साथ इष्टतम संस्कृति की स्थिति में रखा जा सके।

इस परख का उपयोग करने वाले शोधकर्ताओं को मस्तिष्क और रेटिना ईसी की एक महत्वपूर्ण अंतर्निहित विशेषता पर ध्यान देना चाहिए: एपिकोबेसल ध्रुवीयता, जो बीबीबी44 और इसी तरह, बीआरबी की एक सेलुलर पहचान है। ट्रांसकाइटोसिस की दिशा ईसी झिल्ली के एपिकल / ल्यूमिनल बनाम बेसोलेटरल / एब्ल्यूमिनल डोमेन में रुचि के प्रोटीन लक्ष्य रिसेप्टर्स और संबंधित ट्रांसकाइटोसिस मशीनरी के सापेक्ष वितरण से निर्धारित होती है। मस्तिष्क और रेटिना ईसी एपिकल / ल्यूमिनल और बेसोलेटरल / एब्ल्यूमिनल झिल्ली दोनों से कईकारकों को जारी करने में सक्षम हैं। ट्रांसफरिन का क्लैथ्रिन-निर्भर ट्रांसकाइटोसिस, दिलचस्प रूप से, रक्त पक्ष से मस्तिष्क या रेटिना तक ज्यादातर यूनिडायरेक्शनल रूप से होता है, क्योंकि ट्रांसफरिन रिसेप्टर्स मुख्य रूप से एपिकल / ल्यूमिनल झिल्ली45 पर स्थित होते हैं। दूसरी ओर, कैवेलर ट्रांसकाइटोसिस द्वि-दिशात्मक रूप से होता है और पुटिका कार्गो और उनके रिसेप्टर्स46 के स्थानीयकरण के आधार पर एपिकल / ल्यूमिनल या बेसोलेटरल / एब्ल्यूमिनल झिल्ली से और दूसरी तरफ उत्पन्न हो सकता है। एमएफएसडी 2 ए, एक ट्रांसमेम्ब्रेन लिपिड रिसेप्टर (ओमेगा -3 फैटी एसिड डोकोसाहेक्साएनोइक एसिड के लिए) और कैवोलर ट्रांससाइटोसिस का शमनकर्ता, ईसीएस23,47 के एपिकल / ल्यूमिनल डोमेन पर भी स्थित है। एमएफएसडी 2 ए की अभिव्यक्ति को बीआरबी नियंत्रण पर इसके प्रभाव को मध्यस्थ करने के लिए डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल रूप से विनियमित किया जाता है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल24 में एक उदाहरण के रूप में चित्रित किया गया है। इसलिए, यहां वर्णित तकनीक में ईसी मोनोलेयर द्वारा उत्थान के बाद ऊपरी / एपिकल कक्ष पर रखे गए एक ट्रेसर अणु का पता लगाना और नीचे / बेसोलेटरल कक्ष में छोड़ना शामिल है, जो एपिकल / ल्यूमिनल / रक्त में ट्रांससाइटोसिस को बेसोलेटरल / एब्ल्यूमिनल / ऊतक दिशा में नकल करता है। इस प्रोटोकॉल को नीचे के कक्ष में ट्रेसर अणुओं को रखकर और जांचकर्ताओं की आवश्यकता के अनुरूप एपिकल कक्ष में तेज और रिलीज की निगरानी करके विपरीत दिशा में ट्रांसकाइटोसिस का पता लगाने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, यदि आवश्यक हो, तो एंडोसाइटोसिस ट्रेसर-बाध्य लक्ष्य अणु के इंट्रासेल्युलर संचय / गिरावट को निर्धारित करने के लिए एक अतिरिक्त कदम साइटोसोल32 में शेष ट्रांससाइटोटिक पुटिकाओं का और माप देगा।

वर्णित परख के कई फायदे हैं और बीआरबी / बीबीबी से संबंधित अध्ययनों में एक आवश्यक उपकरण के रूप में कार्य करता है, लेकिन कुछ सीमाएं हैं। यह एक पृथक प्रणाली है जो आईबीआरबी के अन्य सेल प्रकारों, जैसे पेरिसाइट और ग्लियल कोशिकाओं से बातचीत से रहित है, और इसलिए शारीरिक इन-विवो वातावरण की नकल नहीं कर सकती है। इलेक्ट्रोड25,38 के तापमान या स्थिति में परिवर्तन के कारण टीईआर मान माप के बीच भिन्न हो सकते हैं। हालांकि, माप से पहले कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस से कमरे के तापमान तक बराबर करना, इलेक्ट्रोड की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग, और रिक्त नियंत्रण शामिल करने से उतार-चढ़ाव को कम करने में मदद मिल सकती है। इसके अतिरिक्त, पर्याप्त धुलाई के साथ भी, पैरासेलुलर मार्ग से रिसाव, हालांकि एक ट्रेस मात्रा में, पूरी तरह से खारिज नहीं किया जा सकता है। विभिन्न ट्रांसकाइटोसिस मार्गों के बीच एचआरपी परिवहन का ओवरलैप, उदाहरण के लिए, कैवोलर परिवहन और मैक्रोपिनोसाइटोसिस के बीच, दोनों क्लैथ्रिन-स्वतंत्र होने के कारण, भी हो सकते हैं। आवश्यकतानुसार, कैवोले और माइक्रोपिनोसाइटोसिस के विशिष्ट मॉड्यूलेटर और / या अवरोधकों का उपयोग करके भेद की आगे जांच की जा सकती है।

संक्षेप में, यह पेपर एक इन विट्रो ट्रांसकाइटोसिस परख का वर्णन करता है जो बीआरबी / बीबीबी में कैवोले- या वाहक-मध्यस्थता ट्रांससाइटोसिस की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देता है। इन विट्रो परख बीआरबी /बीबीबी नियंत्रण से संबंधित विभिन्न प्रो/एंटी-एंजियोजेनिक अणुओं31, सिग्नलिंग पाथवे मॉड्यूलेटर24, या दवा वितरण प्रणाली27,48 की स्क्रीनिंग में बहुत सहायता कर सकती है। ईसी ध्रुवीयता और दिशात्मक ट्रांसकाइटोसिस की जांच भी इस आसानी से उपयोग की जाने वाली प्रणाली से लाभ उठा सकती है। आईबीआरबी और ओकुलर रिसर्च के लिए इन विट्रो मॉडल की सीमित उपलब्धता को ध्यान में रखते हुए, यहां उल्लिखित प्रक्रिया को पेरीसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और 3-डी ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों49 के साथ एक सह-संस्कृति प्रणाली के रूप में भी संशोधित किया जा सकता है, या माइक्रोफिजियोलॉजिकल न्यूरोवास्कुलर सिस्टम50 जैसे उन्नत सेल-आधारित मॉडल का उपयोग करके, सेलुलर इंटरैक्शन की जांच करने और विवो में शारीरिक स्थितियों की बेहतर नकल करने के लिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों या वित्तीय हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को जेसी को एनआईएच अनुदान (आर01 ईवाई028100, ईवाई024963 और ईवाई031765) द्वारा समर्थित किया गया था। जेडडब्ल्यू को नाइट्स टेम्पलर आई फाउंडेशन करियर स्टार्टर ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180

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चिकित्सा अंक 184 रक्त-रेटिना बाधा कैवोले एंडोथेलियल कोशिकाएं ट्रांसकाइटोसिस डब्ल्यूएनटी
एंडोथेलियल सेल ट्रांसकाइटोसिस परख आंतरिक रक्त-रेटिना बाधा पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक <em>इन विट्रो</em> मॉडल के रूप में
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Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).

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