Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Endotelcellstranscytosanalys som en in vitro-modell för att utvärdera inre blod-retinal barriärpermeabilitet

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/64076
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll illustrerar en in vitro-endotelcellstranscytosanalys som en modell för att utvärdera inre blod-retinal barriärpermeabilitet genom att mäta förmågan hos humana retinala mikrovaskulära endotelceller att transportera pepparrotsperoxidas över celler i caveolae-medierade transcellulära transportprocesser.

Abstract

Dysfunktion i blod-retinal barriären (BRB) bidrar till patofysiologin hos flera vaskulära ögonsjukdomar, vilket ofta resulterar i retinalt ödem och efterföljande synförlust. Den inre blod-retinala barriären (iBRB) består huvudsakligen av retinalt vaskulärt endotel med låg permeabilitet under fysiologiska förhållanden. Denna egenskap av låg permeabilitet regleras tätt och upprätthålls av låga hastigheter av paracellulär transport mellan intilliggande retinala mikrovaskulära endotelceller, såväl som transcellulär transport (transcytos) genom dem. Bedömningen av retinal transcellulär barriärpermeabilitet kan ge grundläggande insikter om iBRB-integritet i hälsa och sjukdom. I denna studie beskriver vi en endotelcell (EC) transcytosanalys, som en in vitro-modell för utvärdering av iBRB-permeabilitet, med hjälp av humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs). Denna analys bedömer HRMECs förmåga att transportera transferrin och pepparrotsperoxidas (HRP) i receptor- respektive caveolae-medierade transcellulära transportprocesser. Helt sammanflytande HRMECs odlade på poröst membran inkuberades med fluorescerande märkt transferrin (clathrinberoende transcytos) eller HRP (caveolae-medierad transcytos) för att mäta nivåerna av transferrin eller HRP som överfördes till den nedre kammaren, vilket indikerar transcytosnivåer över EC-monoskiktet. Wnt-signalering, en känd väg som reglerar iBRB, modulerades för att demonstrera den caveolae-medierade HRP-baserade transcytosanalysmetoden. EC-transcytosanalysen som beskrivs här kan ge ett användbart verktyg för att undersöka de molekylära regulatorerna för EC-permeabilitet och iBRB-integritet i vaskulära patologier och för screening av läkemedelsleveranssystem.

Introduction

Den mänskliga näthinnan är en av de högsta energikrävande vävnaderna i kroppen. Korrekt funktion av den neurala näthinnan kräver en effektiv tillförsel av syre och näringsämnen tillsammans med ett begränsat flöde av andra potentiellt skadliga molekyler för att skydda näthinnemiljön, som förmedlas via blod-retinal barriären (BRB)1. I likhet med blod-hjärnbarriären (BBB) i centrala nervsystemet fungerar BRB som en selektiv barriär i ögat och reglerar rörelsen av joner, vatten, aminosyror och socker in och ut ur näthinnan. BRB upprätthåller också retinal homeostas och dess immunprivilegium genom att förhindra exponering för cirkulationsfaktorer såsom immunceller, antikroppar och skadliga patogener2. BRB-dysfunktion bidrar till patofysiologin hos flera vaskulära ögonsjukdomar, såsom diabetisk retinopati, åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), retinopati av prematuritet (ROP), retinal venocklusion och uveit, vilket resulterar i vasogent ödem och efterföljande synförlust 3,4,5.

BRB består av två separata barriärer för två distinkta okulära vaskulära nätverk: retinal vaskulatur och fenestrated choriocapillaris under näthinnan. Den inre BRB (iBRB) består huvudsakligen av retinala mikrovaskulära endotelceller (RMEC) som kantar retinal mikrovaskulatur, som ger näring åt de inre retinala neuronala skikten. Å andra sidan utgör retinalpigmentepitelet huvudkomponenten i den yttre BRB, som ligger mellan den neurosensoriska näthinnan och choriocapillaris2. För iBRB sker molekylär transport över RMEC genom både paracellulära och transcellulära vägar (figur 1). Den höga graden av substansselektivitet över iBRB är beroende av (i) närvaron av korsningsproteinkomplex som begränsar paracellulär transport mellan intilliggande endotelceller (ECs) och (ii) låga uttrycksnivåer av caveolae-mediatorer, transportörer och receptorer inom endotelcellerna som upprätthåller låga hastigheter av transcellulär transport 1,6,7,8 . Korsningskomplex som reglerar paracellulärt flöde består av täta korsningar (claudiner, ockludiner), vidhäftande korsningar (VE-kadheriner) och gapkorsningar (connexiner), vilket möjliggör passage av vatten och små vattenlösliga föreningar. Medan små lipofila molekyler passivt diffunderar över det inre av RMEC, regleras rörelsen av större lipofila och hydrofila molekyler av ATP-drivna transendoteliala vägar inklusive vesikulär transport och membrantransportörer 5,9.

Vesikulär transcytos kan kategoriseras som caveolinmedierad caveolär transcytos, clathrinberoende (och receptormedierad) transcytos och clathrinoberoende makropinocytos (Figur 2). Dessa vesikulära transportprocesser involverar vesiklar av olika storlek, där makropinosomer är de största (från 200-500 nm) och caveolae är de minsta (i genomsnitt 50-100 nm), medan clathrinbelagda vesiklar sträcker sig från 70-150 nm10. Caveolae är kolvformade lipidrika plasmamembraninvaginationer med en proteinbeläggning, främst bestående av caveolin-1 som binder lipidmembrankolesterol och andra strukturella och signalerande proteiner via deras caveolin-byggnadsställningsdomän11. Caveoliner arbetar tillsammans med perifert fäst cavin för att främja caveolae-stabilisering vid plasmamembranet12. Caveolar membran kan också bära receptorer för andra molekyler såsom insulin, albumin, och cirkulerande lipoproteiner inklusive high-density lipoprotein (HDL) och low-density lipoprotein (LDL) för att hjälpa deras rörelse över endotelceller13. Under utvecklingen beror bildandet av funktionell BRB på undertryckandet av EC-transcytos8. Äldre retinalt endotel har därför relativt låga nivåer av caveolae-, caveolin-1- och albuminreceptorer med avseende på andra endotelceller under fysiologiska förhållanden, vilket bidrar till dess barriäregenskaper 4,9.

Eftersom iBRB-nedbrytning är ett viktigt kännetecken för många patologiska ögonsjukdomar är det viktigt att utveckla metoder för att bedöma retinal vaskulär permeabilitet in vivo och in vitro. Dessa metoder hjälper till att ge sannolika insikter i mekanismerna för komprometterad BRB-integritet och bedöma effekten av potentiella terapeutiska mål. Nuvarande in vivo-avbildning eller kvantitativa vaskulära läckageanalyser använder vanligtvis fluorescerande (natriumfluorescein och dextran), kolorimetriskt (Evans Blue-färgämne och pepparrotsperoxidas [HRP] substrat) eller radioaktiva spårämnen14 för att detektera extravasering från vaskulaturen till omgivande näthinnevävnader med mikroskopavbildning eller i isolerat vävnadslysat. Ett idealiskt spårämne för kvantifiering av vaskulär integritet bör vara inert och tillräckligt stort för att fritt tränga igenom komprometterade kärl medan det är inneslutet i friska och intakta kapillärer. Metoder som använder natriumfluorescein eller fluoresceinisotiocyanatkonjugerad dextran (FITC-dextran) i levande fundus fluoresceinangiografi (FFA) eller isolerade retinala platta fästen används ofta för kvantifiering av retinal extravasation in vivo eller ex vivo. FITC-dextran har fördelen att det finns i olika molekylvikter från 4-70 kDa för storlekselektiva studier15,16,17. FITC-albumin (~68 kDa) är ett alternativt storskaligt proteinspårare av biologisk relevans för kärlläckagestudier18. Evans Blue-färgämne, injicerat intrakardiellt19, retro-orbitalt eller genom svansvenen 20, förlitar sig också på dess bindning med endogent albumin för att bilda en stor molekyl som kan kvantifieras genom mestadels spektrofotometrisk detektion eller, mindre vanligt, fluorescensmikroskopi i platta fästen20,21. Dessa kvantitativa eller lätta avbildningsmetoder skiljer emellertid ofta inte paracellulär transport från transendoteltransport. För den specifika analysen av transcytos med ultrastrukturell visualisering av transcytoserade vesiklar används spårmolekyler såsom HRP vanligtvis för att lokalisera transcytoserade vesiklar i endotelceller som kan observeras under ett elektronmikroskop22,23,24 (Figur 3A-C).

Utvecklingen och användningen av in vitro iBRB-modeller för att utvärdera endotelcellpermeabiliteten kan ge robust och hög genomströmningsbedömning för att komplettera in vivo-experiment och hjälpa till att undersöka molekylära regulatorer för vaskulärt läckage. Vanliga analyser för att bedöma paracellulär transport och integritet hos täta korsningar inkluderar transendotelial elektrisk resistans (TEER), ett mått på jonisk konduktans (figur 4)2,25 och in vitro-vaskulär läckageanalys med hjälp av fluorescerande spårämnenmed liten molekylvikt 26. Dessutom har transferrinbaserade transcytosanalyser som modellerar BBB använts för att utforska clathrinberoende transcytos27. Trots detta är analyser för att utvärdera BRB och, mer specifikt, retinal EC caveolar transcytos in vitro begränsade.

I denna studie beskriver vi en EC-transcytosanalys med humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs) som en in vitro-modell för att bestämma iBRB-permeabilitet och EC-transcytos. Denna analys är beroende av HRMECs förmåga att transportera transferrin eller HRP via de receptormedierade respektive caveolae-beroende transcytosvägarna (figur 2). HRMECs odlade till full sammanflöde i den apikala kammaren (dvs. filterinsats) inkuberades med fluorescerande konjugerat transferrin (Cy3-Tf) eller HRP för att mäta fluorescensintensiteten som motsvarar nivåerna av transferrin eller HRP som överfördes till bottenkammaren genom enbart EC-transcytos. Sammanflödet av cellmonolagret kan bekräftas genom att mäta TEER, vilket indikerar den snäva korsningsintegriteten25. För att demonstrera TEER- och transcytosanalystekniken användes kända molekylära modulatorer av vaskulär permeabilitet och EC-transcytos, inklusive vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF)28 och de i Wnt-signalering (Wnt-ligander: Wnt3a och Norrin)29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Boston Children's Hospital för generering av ljusmikroskopi och EM-bilder (figur 3). Protokoll för in vivo-studierna kan erhållas från Wang et al.24. Alla experiment med humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs) godkändes av Institutional Biosafety Committee (IBC) vid Boston Children's Hospital.

1. Beredning av reagenser

  1. Lösning för beläggning av vävnadsodlingsskål: Förbered 0,1% gelatinlösning genom att lösa 1 ml gelatinstamlösning (40% -50%) i 500 ml steril vävnadsodlingskvalitet 1x PBS (pH = 7,4). Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter. Förvara 0,1% gelatinlösning vid 2-8 °C. Den kan förvaras vid nämnda temperatur på obestämd tid i sterilt tillstånd.
  2. Tillväxtmedium: Förbered 500 ml endotelcellstillväxt komplett medium (EGM) genom att lösa upp EGM-tillskott i endotelcelltillväxtbasalmediet (EBM) enligt tillverkarens instruktioner (Materialförteckning). Alikvot tillväxtmedium i 50 ml rör och förvara rören vid 4 °C. Tillväxtmediets hållbarhet är 12 månader vid 4 °C.
  3. Trypsinlösning: För 0,25% trypsin-EDTA-lösning, alikvot från stamflaskan i 50 ml rör och förvaras vid 4 ° C (upp till 2 veckor) eller −20 ° C (upp till 24 månader).

2. Odla HRMECs

  1. Initial cellodling
    1. Skiktcellsodling Petriskålar (100 mm diameter x 20 mm höjd) med 5 ml 0,1% gelatinlösning under en laminär flödeshuv och håll dem ostörda i huven i 30 min vid rumstemperatur (RT) för enhetlig beläggning.
      OBS: Gelatinbeläggning av rätter förbättrar cellfästet. Alternativt kan gelatinbelagda T75-kulturkolvar också användas.
    2. Innan du sår cellerna, aspirera gelatinlösningen med en vakuumpump. Vakuumtrycket hos den använda aspiratorn var upp till 724 mmHg.
      OBS: Aspiration måste göras omedelbart före sådd av celler för att förhindra uttorkning av beläggningslösningen.
    3. Tina en fryst injektionsflaska med HRMEC (från förvaring i flytande kväve) antingen med ett vattenbad vid 37 °C eller genom att tillsätta ett varmt tillväxtmedium i injektionsflaskan. När den har tinats, överför cellsuspensionen till 9 ml tillväxtmedium (förutsatt att upptinad injektionsflaska med HRMEC är 1 ml).
      OBS: HRMECs erhölls kommersiellt (materialtabell). Tillväxtmediet som tillsätts cellerna ska alltid förvärmas till 37 °C före användning.
    4. Snurra cellerna vid 200 x g i 5 minuter vid RT och aspirera försiktigt supernatanten för att undvika att cellpelleten tas bort.
    5. Återsuspendera cellpelleten i 10 ml tillväxtmedium och överför den resulterande suspensionen till en gelatinbelagd petriskål. Håll cellerna i inkubatorn vid 37 °C och 5%CO2. Vanligtvis är HRMECs 70% -80% sammanflytande efter 72 timmar.
      OBS: Tillväxtmediet byts varannan dag.
  2. Subkultur av HRMEC på permeabla membraninsatser
    1. Förbered cellodlingsfilterinsatser (6,5 mm skär med polykarbonatmembran med 0,4 μm porstorlek, placerade i en 24-brunnsplatta) för sådd av HRMEC genom att belägga varje insats (apikal kammare) med 200 μl 0,1% gelatinlösning i 30 minuter under en laminär flödeshuv. Se till att lösningen täcker hela filterinsatsens bottenyta.
      OBS: Varje brunn har en apikal och basolateral kammare åtskild av ett poröst membran.
    2. Ta ut petriskålen med odlade HRMECs (steg 2.1.5.) från inkubatorn och aspirera tillväxtmediet. Skölj försiktigt cellerna 2x med 10 ml 1x PBS under en laminär flödeshuv för att bli av med potentiella flytande / döda celler.
    3. Dissociera cellerna med 0,5-1 ml 0,25% trypsin-EDTA-lösning och placera petriskålen i inkubatorn (37 ° C och 5% CO2) i 5 minuter.
    4. Släck trypsinaktiviteten genom att tillsätta 4,5-9 ml tillväxtmedium och överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör med en 10 ml pipett.
    5. Snurra cellerna vid 200 x g i 5 minuter vid RT, ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 ml tillväxtmedia.
    6. Räkna antalet celler med hjälp av en manuell hemocytometer eller en automatiserad cellräknare och frö med en densitet av 4 x 104 celler per filterinsats (dvs. 1,25 x 105 celler / cm2). Volymen cellsuspension för varje insats är 250 μL.
    7. Aspirera beläggningslösningen från brunnarna som innehåller permeabla insatser och överför 250 μL av cellsuspensionen per insats (apikal kammare). Lägg endast till medium (dvs. utan celler) till en av insatserna, som kommer att användas som en "tom kontroll" för TEER-mätning. Samtidigt tillsätt också 750 μL medium per brunn i de basolaterala kamrarna.
    8. Förvara 24-brunnsplattan med permeabla insatser i inkubatorn (37 ° C och 5% CO 2) i 7-12 dagar tills de odlade cellerna blir helt sammanflytande och det önskade TEER-värdet på ~ 20 Ω · cm2 uppnås.
    9. Byt tillväxtmedium varannan dag. Under mediebyte, aspirera försiktigt mediet för att minimera störningar i cellmonolagret och tillsätt 250 μL och 750 μL färskt medium per brunn till de apikala respektive basolaterala kamrarna.
      OBS: Tillväxtmedium ändras för både de apikala och basolaterala kamrarna i brunnarna.

3. TEER-mätningar (figur 4)

  1. På dag 14 efter cellsådd (steg 2.2.9), mät TEER för HRMEC med hjälp av ett epitelvolt-ohm-mätare (EVOM) elektriskt motstånd (ER) -system (materialtabell) enligt följande.
  2. Förinstallera ER-systemet och kontrollera mätarens funktionalitet med STX04-testelektroden. Kalibrera, om det behövs.
  3. Anslut elektroden till mätaren och balansera elektroden genom att först blötlägga den i 70% etanol i 15-20 minuter och sedan nedsänka den kort i cellodlingens EGM-tillväxtmedium.
  4. Under tiden ska du förvara den cellinnehållande 24-brunnsplattan i den laminära flödeshuven vid RT i 15-20 minuter för temperaturutjämning.
    OBS: TEER-mätningar påverkas av temperaturen, så jämviktssteget är viktigt.
  5. För TEER-mätning, tillsätt färskt tillväxtmedium till både brunnarnas apikala (250 μl) och basolaterala (750 μl) kammare.
  6. Utför TEER-mätning genom att försiktigt sänka ner elektroden så att den kortare spetsen är i insatsen och den längre spetsen vidrör botten av brunnen. Mät motståndet över blankkontrollen först. För varje insats mäter du TEER i tre exemplar.
    OBS: För sköljning av elektroden mellan mätningarna används odlingsmedier. Se till att elektroden hålls i 90 ° vinkel mot skärets botten för stabila avläsningar.
  7. Beräkna elektriskt motstånd (i Ω·cm 2) över monolagret med formeln TEER = nettoresistans (Ω) x filterinsatsens ytarea (cm2); Här är nettoresistens skillnaden mellan motståndet hos varje brunn (tillväxtmedium med celler) och den tomma brunnen (endast tillväxtmedium).
  8. Utför ytterligare behandling av cellerna först efter att TEER-värdet når ~ 20 Ω · cm2. Om önskad TEER-nivå inte uppnås, behåll plattan i inkubatorn och mät TEER följande dag.
    OBS: HRMEC-sammanflöde kan också valideras genom morfologisk undersökning av cellform (under ett mikroskop) med typisk kullerstensmorfologi och / eller genom närvaron av cellkorsningsproteiner med immunohistokemifärgning separat.

4. Transcytosanalys

  1. Clathrinmedierad in vitro-transcytosanalys med Cy3-märkt transferrin (figur 5)
    1. Efter att ha nått sammanflöde med TEER-värden runt 20 Ω·cm 2, berövar serum cellerna i 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO2 med 0,5% FBS i EBM (serumreducerat medium) i båda kamrarna (apikal kammare: 250 μL och basolateral kammare: 750 μL) före behandling med liganden. Serumreducerad EBM användes under hela analysen.
    2. Inkubera cellerna (med hjälp av det serumreducerade mediet i steg 4.1.1) i den apikala kammaren med fluorescerande (cyanin 3)-märkt transferrinligand (Cy3-Tf) (slutlig koncentration på 40 μg/ml) i 60 min vid 37 °C.
      OBS: Plattor som innehåller Cy3-Tf bör skyddas från ljus för att undvika fotoblekning av Cy3-Tf genom att förpacka aluminiumfolie i dem och utföra experimentet i en cellodlingshuv med lamporna släckta.
    3. Efter 1 h, placera plattan på is och tvätta monolagret apikalt och basolateralt 4x (3-5 min per tvätt) med det serumreducerade mediet vid RT för att ta bort den fria obundna Cy3-Tf.
      OBS: Tvättning är viktigt för att avlägsna fria spårmolekyler och möjliggöra korrekt avläsning av transcytos utan potentiellt läckage från den paracellulära vägen.
    4. Tillsätt färskt serumreducerat medium (som i steg 4.1.1) till de noggrant tvättade filterinsatserna som innehåller celler och överför insatserna till färska brunnar på 24-brunnsplattan som innehåller förvärmt serumreducerat medium.
    5. Inkubera cellerna i ytterligare 90 minuter i inkubatorn (37 °C och 5%CO2) och samla sedan upp mediet från den basolaterala kammaren.
    6. Registrera fluorescensintensiteten hos lösningen från den basolaterala kammaren med hjälp av en fluorescensdetektor. Nivåerna av fluorescensintensitet, mätt som relativa fluorescerande enheter (RFU), indikerar mängden Cy3-Tf-komplex som transcytoseras över HRMEC-monolagret via clathrinberoende transcytos.
  2. Caveolae-medierad in vitro-transcytosanalys med HRP (figur 6)
    1. När serum uppnår full sammanflöde med TEER-värden runt 20 Ω·cm2, berövar serum cellerna i 24 timmar vid 37 °C och 5 %CO2 med hjälp av 0,5 % FBS-innehållande EBM-medium (serumreducerat medium) före behandling (som i steg 4.1.1.). Serumreducerat EBM-medium användes under hela analysen.
    2. Behandla cellerna i den apikala kammaren med önskade behandlingar och vehikelkontroller.
      OBS: Här har vi använt Wnt-modulatorer som ett exempel för att demonstrera regleringen av caveolae-medierad transcytos av Wnt-signalvägen i HRMECs: human rekombinant Norrin och Wnt-hämmare XAV939. I ett typiskt experiment behandlades celler i 24 timmar i en inkubator (37 °C och 5 %CO2) med följande koncentrationer: Norrin (125 ng/ml), Norrin (125 ng/ml) + XAV939 (10 μM) och vehikelkontrolllösning. Dessutom användes Wnt3a-konditionerat medium (framställt av L Wnt-3A-celler).
    3. Inkubera cellerna i den apikala kammaren med HRP (5 mg/ml) i 15 minuter vid 37 °C.
    4. Placera sedan 24-brunnsplattan på is och tvätta de apikala och basolaterala kamrarna intensivt 6x med P-buffert (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM glukos, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) för att avlägsna den fria extracellulära HRP.
      OBS: Tvättning är viktigt för att avlägsna fria spårmolekyler och möjliggöra korrekt avläsning av transcytos utan potentiellt läckage från den paracellulära vägen.
    5. Tillsätt färskt serumreducerat medium (som i steg 4.1.1.) till den apikala kammaren och överför insatserna till en ny brunn som innehåller förvärmda medier.
    6. Inkubera monolagret i ytterligare 90 minuter i inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2 innan mediet samlas upp från den basolaterala kammaren.
    7. Tillsätt 100 μl HRP-fluorogent peroxidassubstrat (materialtabell) enligt tillverkarens instruktioner till det uppsamlade mediet och inkubera vid RT i 10 minuter innan reaktionen stoppas med 100 μL stopplösning.
    8. Detektera nivåerna av HRP-substratreaktionsprodukt i mediet med hjälp av en fluorescensplattläsare. Mät fluorescensintensiteten vid 420 nm emissionsvåglängd (med 325 nm excitation) och som relativa fluorescerande enheter (RFU). Värdena anger nivån av HRP transcytoserad över HRMEC-skiktet genom caveolae-medierad transcytos.
      OBS: Den fluorescerande produkten som används här (materialtabell) fotobleker inte. Ljusskydd mot fotoblekning behövs inte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EM-bilder av retinalt vaskulärt endotel visar transcytotisk vesikulär transport och caveolära vesiklar i endotelceller in vivo.
EC-transcytos kan visualiseras in vivo i näthinnans tvärsnitt med mörkbrun fällning som reflekterar HRP-innehållande blodkärl under ett ljusmikroskop (figur 3A) och som elektrontät fällning som indikerar HRP-innehållande transcytotiska vesiklar (figur 3B,C) med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop (TEM), vilket visar EC-transcytos över iBRB. Stora vesiklar reflekterar potentiellt makropinocytos (vit pilspets; Figur 3B), och små blåsor representerar sannolikt caveolära vesiklar (vita pilspetsar; Figur 3C). Dessutom kan lokaliseringen av caveolae i retinala blodkärl ses som samfärgning av caveolae markör CAV-1-antikropp med isolektin (EC-markör) i blodkärlet under ett fluorescensmikroskop (Figur 3D). CAV-1-positiva caveolära vesiklar identifierades under TEM med immunogold-märkta CAV-1-antikroppar (svarta prickar; Figur 3E) inom retinala vaskulära endotelceller. Protokoll för in vivo-studierna kan erhållas från Wang et al.24.

VEGF-behandling ökar vaskulär permeabilitet i HRMEC mätt med transendotelialt elektriskt motstånd (TEER)
Innan EC transcytosanalyser utförs bör HRMECs odlas till full sammanflöde och visa karakteristisk kullerstensmorfologi, som kan observeras under ett ljusmikroskop. Fullcellssammanflöde kan valideras genom mätning av transendotelialt elektriskt motstånd (TEER) (figur 4A), med avläsningar som når ~ 20 Ω · cm2 för sammanflytande HRMECs30, vilket tyder på låga nivåer av paracellulär transport över monolagret genom täta eller gapkorsningar. Vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) användes som ett exempel för att demonstrera TEER-mätning. Behandling av HRMEC med VEGF minskade signifikant TEER-nivåerna, vilket återspeglar ökad HRMEC-permeabilitet (figur 4B). En minskning av TEER-värden observerades också i kontrollceller, potentiellt på grund av odlingstiden och flera mätningar som gjorts vid olika tidsintervall som kan vara skadliga för celler31.

Transport av Cy3-transferrin kan användas för att bedöma clathrinmedierad EC-transcytos i HRMECs
För clathrinmedierad EC-transcytos inkuberades sammanflytande HRMECs odlade på poröst membran med fluorescerande (Cy3) -märkt transferrin för att detektera dess transport över ECs (Figur 5A). Denna analys utnyttjar det faktum att transport av transferrin är en receptormedierad transcytosprocess. Cy3-transferrinendocytos (röd) observerades i HRMEC-monolager samfärgat med kärnfläck, DAPI (blått) (figur 5B), vilket bekräftar dess upptag i cellerna. Fluorescensintensiteten hos (Cy3)-märkt transferrin kan kvantifieras från bilder för att bedöma endocytosprocessen och/eller mätas från mediet som samlats in från brunnarnas basolaterala kammare för att kvantifiera nivåerna av clathrinmedierad transcytos27.

Wnt-signalvägen reglerar caveolae-medierad EC-transcytos över HRMECs i en HRP-baserad analys
Tidigare har det visat sig att Wnt-signalering reglerar MFSD2A-beroende caveolae-medierad transcytos över retinala vaskulära ECs för att upprätthålla iBRB24. Effekterna av Wnt-modulatorer utvärderades i en HRP-baserad in vitro-transcytosanalys (figur 6A). Helt sammanflytande HRMEC behandlades med Wnt-vägaktivatorer: Wnt3a-konditionerat medium (Wnt3a-CM) eller humant rekombinant Norrin, med eller utan Wnt/β-catenin-signalhämmare XAV939, och nivåerna av transcytoserad HRP över HRMECs detekterades. Behandling med Wnt3a-CM eller Norrin visade signifikant minskade nivåer av transcytoserad HRP, vilket indikerar minskad caveolär transcytos. Dessutom visade kombinerad behandling med Wnt-signalhämmaren XAV939 uppreglerade nivåer av transcytoserad HRP i HRMECs, vilket utplånade effekterna av Wnt-aktivatorer på HRMEC-permeabilitet (figur 6B,C)24.

Figure 1
Figur 1: Olika transportvägar över retinalt vaskulärt endotel. Schematisk illustration som visar olika vägar för molekylärt flöde över retinala mikrovaskulära endotelceller (RMEC). Transport över retinala vaskulära endotelceller i den inre blod-retinala barriären sker via två huvudvägar: paracellulära och transcellulära vägar inklusive transcytos. Denna siffra anpassades med tillstånd från Yemanyi et al.5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Översikt över transcytotiska vesikulära transportvägar över endotelceller och deras respektive in vitro-bedömning . I endotelceller (ECs) sker transcellulär translokation av makromolekyler genom tre huvudtyper av vesiklar: caveolära vesiklar (50-100 nm), clathrinbelagda vesiklar (70-150 nm) eller clathrinoberoende makropinosomer (200-500 nm). Caveolae är kolvformade, sfäriska, lipidrika mikrodomäner i plasmamembranet, bestående av caveolin och caviner. Nivåer av transcytos genom dessa vesiklar kan bestämmas genom fluorescensbaserade in vitro-analyser i EG-odling med pepparrotsperoxidas (HRP) kombinerat med fluorescerande substrat, fluorescerande märkt transferrin (Cy3-Tf) eller tetrametylrhodaminmärkt bovint serumalbumin (TMR-BSA) för caveolae-medierad transcytos, clathrinmedierad transcytos respektive makropinocytos för att utvärdera inre blod-retinal barriär (iBRB) permeabilitet. Medan varje väg har distinkta egenskaper och transportmekanismer, kan överlappande funktion och substanstransport förekomma, särskilt mellan caveolär transport och makropinocytos, båda är clathrinoberoende. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Visualisering av EC-transcytos i näthinnan. (A) Ljusmikroskopbild visar en HRP-fylld blodkärlslumen från en 3 månader gammal vild typ (WT) musretinalsektion, färgad med 3,3'-diamino benzidin (DAB) (svart). HRP injicerades retro-orbitalt i WT-möss, följt av ögonisolering och vävnadsinbäddning. Tunna sektioner färgades med elektrontätt DAB-substrat för kolorimetrisk detektion av HRP som mörkbrun fällning och avbildades under ett ljusmikroskop för att avslöja HRP i retinal blodkärlslumen. (B,C) Prover bearbetades sedan vidare med ultratunn sektion av transmissionselektronmikroskop (TEM) för att visualisera HRP-innehållande transcytotiska vesiklar, som visar EC-transcytos över iBRB. TEM-bilder visar en retinal sektion av en 3 månader gammal WT-mus med HRP-fylld blodkärlslumen och HRP-innehållande vesiklar i RMEC. (B) En och annan stor vesikel reflekterar potentiellt makropinosom (pilspets) inom ECs, med närvaron av röda blodkroppar (asterisk) på luminalsidan. (C) Små vesiklar är sannolikt caveolära vesiklar (pilspetsar). (D) Immunohistokemi samfärgning av CAV-1-antikropp (grön) och isolektin B 4 (IB4, röd, EG-markör) visar lokalisering av CAV-1 i retinala blodkärl i 3 månader gammal WT-musnäthinna (DAPI, blå). (E) TEM-bild av immunogold-märkt CAV-1 (svarta prickar, pilar) inom retinala ECs; infälld visar en förstorad bild av en CAV-1 positiv caveolar vesikel. Förkortningar: HRP = pepparrotsperoxidas; GCL = ganglioncellskikt; IPL = inre plexiformskikt; INL = inre kärnskikt; OPL = yttre plexiformskikt; ONL = yttre kärnskikt; RPE = retinalt pigmentepitel; E = endotelcell; och L = blodkärlslumen. Förstoring: (A, D) 20x. Skalstreck: (A) 50 μm, (B) 2 μm, (D) 100 μm och (C,E) 200 nm. Panel (E) anpassades med tillstånd från Wang et al.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Validering av helt sammanflytande HRMEC och ökad vaskulär permeabilitet i HRMEC efter VEGF-behandling . (A) Schematiskt diagram som visar placeringen av elektroder i de apikala och basolaterala kamrarna i brunnarna för mätning av transendotelial elektrisk resistans (TEER) som en bedömning av cellmonoskiktets vaskulära permeabilitet och integritet. (B) Diagram som visar TEER-registreringar av fullt sammanflytande HRMEC med och utan föregående behandling med vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF). Behandling med VEGF efter 18 timmar (18 H) resulterar i minskad TEER i fullt sammanflytande HRMECs31. s≤0.001. Panel (B) anpassades med tillstånd från Tomita et al.31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: En schematisk illustration av clathrinmedierad EC-transcytosanalys i HRMEC med transferrin (Tf). (A) HRMEC odlades till full sammanflöde på gelatinbelagda insatser och serum svälte över natten vid 37 °C före analys. Cellerna inkuberades apikalt med fluorescerande cy3-konjugerat transferrin (Cy3-Tf) i 60 minuter vid 37 °C. Efter inkubation tvättades cellerna intensivt med ett nytt medium för att avlägsna obundet extracellulärt Cy3-Tf. Insatserna som innehöll färskt medium överfördes sedan till en ny platta innehållande varmt medium i den basolaterala kammaren, och cellerna inkuberades vid 37 °C i ytterligare 90 minuter för att frigöra endocytoserad Cy3-Tf. Mediet från den basolaterala kammaren kan samlas in, och fluorescensintensiteten som motsvarar clathrinberoende (Cy3-Tf) EC-transcytos kan mätas med hjälp av en fluorescensplattläsare. (B) Cy3-transferrin (rött) observerades i HRMECs färgade med DAPI (blå), vilket bekräftar endocytos. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Wnt-signalering reglerar caveolae-medierad HRMEC-transcytos i en in vitro HRP-baserad analys . (A) Schematisk illustration som visar den HRP-baserade analysen för att bedöma caveolae-medierad transcytos. Helt sammanflytande HRMECs odlade på gelatinbelagda insatser serumsvalt över natten i 0,5% fetalt bovint serum (FBS) + EBM-medium vid 37 ° C före behandling. EC-monolagret i den apikala kammaren behandlades med önskad behandling i 24 timmar vid 37 °C. Därefter inkuberades cellerna med pepparrotsperoxidas (HRP) vid 37 °C i 15 minuter och tvättades intensivt för att avlägsna fri extracellulär HRP. Insatser som innehöll färskt medium överfördes sedan till en ny platta som innehöll varmt medium i basolaterala kammare, och cellerna inkuberades i ytterligare 90 minuter vid 37 °C. Mediet från den basolaterala kammaren samlades in och HRP-nivåerna kvantifierades genom reaktion med fluorogent peroxidassubstrat. Fluorescens motsvarande caveolae-medierad EC-transcytos mättes med hjälp av en fluorescensplattläsare. (B,C) I detta exempel behandlades celler med Wnt-vägmodulatorer: Wnt3a-konditionerat medium (Wnt3a-CM) eller dess kontrollkonditionerade medium (Ctrl-CM), humant rekombinant Norrin eller dess kontrolllösning (Ctrl) och med eller utan Wnt/β-catenin-signalhämmare (XAV939) eller dess fordonskontroll (fordon). Deras effekter på HRMEC caveolar transcytos utvärderades i den HRP-baserade analysen. Efter behandling mättes nivåerna av HRP som överfördes till den basolaterala kammaren, vilket indikerar caveolae-medierade EC-transcytosnivåer över HRMECs. Wnt-aktivatorer minskade nivåerna av den HRP-baserade transcytosen, som vändes av XAV939. * p≤0,05, ** p≤0,01. Panelerna (B) och (C) anpassades med tillstånd från Wang et al.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BRB spelar en viktig roll i retinal hälsa och sjukdom. In vitro-tekniker som bedömer vaskulär permeabilitet har visat sig vara avgörande verktyg i studier om barriärutveckling (BRB/BBB) och funktion. Förfarandet som beskrivs här kan användas för att studera de molekylära mekanismerna som ligger till grund för EC-transcytos eller utvärdera relaterade molekylära modulatorer som påverkar BRB-permeabiliteten. In vitro EC-transcytosanalyser har flera fördelar jämfört med in vivo-analyser eller tekniker som används för att utvärdera vaskulär permeabilitet. De är snabba att utföra med hög genomströmning och kan användas för att analysera effekterna av många olika variabler eller isolerade molekyler av specifika signalvägar med både genetisk och farmakologisk modulering. Det rena EG-odlingssystemet utplånar djurvariation som ofta observeras in vivo och begränsar också effekterna av eventuell modifiering eller endocytos av målmolekylerna av andra celltyper32. Hanteringen av HRMEC-celler är enkel, vilket kräver grundläggande cellodlingsutrustning som finns i de flesta laboratorier, och cellodling är ofta mer kostnadseffektiv jämfört med djurförsök in vivo. Även om in vitro-transcytosanalyser inte helt replikerar de fysiologiska in vivo-förhållandena33, kan de vara värdefulla verktyg för att komplettera in vivo-studier och främja vår kunskap om BRB-kontroll.

Flera viktiga tekniska parametrar kräver övervägande, inklusive filterinsatsens porstorlek, typen av underlag och cellsådddensiteten. En större porstorlek på de permeabla filterinsatserna kan resultera i oönskad migration och tillväxt av celler på undersidan av skäret, vilket förvirrar den resulterande mätningen och dess tolkning. Även om denna benägenhet kan variera med de olika celltyperna, fungerar pordiametrar ≤1 μm bra för de flesta celltyper, inklusive ECs34. Valet av ett lämpligt substrat är ett andra avgörande steg eftersom vissa celler uppvisar högre polaritet och större differentiering när de odlas på poröst underlag och badas i ett odlingsmedium på båda sidor35,36. Behandlade mikroporösa polykarbonatfilter är ett bättre alternativ för ECs eftersom de är tunnare och ger större tillgång till reagenserna till monoskiktets basolaterala zon med minimal bakgrundsfluorescens för immunanalyser35. Slutligen, för att uppnå ett helt sammanflytande monolager, måste cellsåddstätheten optimeras baserat på den specifika celltypen. Medan för låg sådddensitet kan påverka differentieringstillståndet, kan för hög sådddensitet å andra sidan gynna snabbt fästande celler som bildar flera cellskikt istället för ett monolager, vilket så småningom förändrar cellmorfologin och resulterar i felaktig transcytosmätning37.

EG-monoskiktets bildning och integritet är avgörande för denna analys och kan valideras genom mätning av TEER-värden för att säkerställa att önskad TEER uppnås. En tom kontroll, dvs. en filterinsats utan celler, bör alltid inkluderas för att mäta de basala motståndsnivåerna över det permeabla membranet som ska subtraheras från dem från cellinsatser. Olika faktorer som temperatur, cellpassagenummer, odlingsmediets sammansättning, odlingsvaraktighet och korsningslängdsförändringar kan alla orsaka mindre variationer i TEER-värden 25,38,39. TEER-värden påverkas också starkt av vissa behandlingar, såsom VEGF. VEGF upptäcktes initialt som en potent inducerare av kärlpermeabilitet40 och påverkar vaskulär permeabilitet genom att reglera paracellulär transport, dvs genom fosforylering av täta korsningsproteiner ZO-1, ockludin och störningen av tätt korsningsprotein claudin-5 41,42 samt transcellulär transport 43 . Ytterligare validering av monolagerbildning kan göras med morfologisk undersökning och närvaron av karakteristiska korsningsproteiner med färgning. Under hela kulturen rekommenderas att byta media i både apikala och basolaterala kamrar med jämna mellanrum för att hålla cellerna i optimalt odlingsförhållande med det ideala pH-intervallet och näringstillgängligheten.

Forskare som använder denna analys bör vara uppmärksamma på en kritisk inneboende egenskap hos hjärn- och retinala ECs: apicobasal polaritet, som är ett cellulärt kännetecken för BBB44 och på samma sätt BRB. Transcytosriktningen bestäms av den relativa fördelningen av proteinmålreceptorer av intresse och det associerade transcytosmaskineriet i de apikala/luminala kontra basolaterala/abluminala domänerna i EC-membranet. Hjärn- och retinala ECs kan frigöra många faktorer från både apikala / luminala och basolaterala / abluminala membran44. Clathrinberoende transcytos av transferrin, intressant nog, verkar förekomma mestadels enkelriktat från blodsidan till hjärnan eller näthinnan, eftersom transferrinreceptorer huvudsakligen är belägna på apikal / luminal membran45. Caveolar transcytos, å andra sidan, förekommer dubbelriktat och kan härröra från antingen apikalt / luminalt eller basolateralt / abluminalt membran och över till andra sidan beroende på lokaliseringen av vesikellast och deras receptorer46. MFSD2A, en transmembranlipidreceptor (för omega-3-fettsyradokosahexaensyra) och suppressor av caveolär transcytos, finns också på apikala/luminala domäner av ECs23,47. Uttrycket av MFSD2A regleras transkriptionellt av Wnt-signalering för att förmedla dess inverkan på BRB-kontroll, vilket illustreras som ett exempel i detta protokoll24. Den teknik som beskrivs här innefattar därför detektion av en spårmolekyl placerad på den övre/apikala kammaren efter upptag av EG-monolagret och släpper ut i botten/basolaterala kammaren, vilket efterliknar transcytos i apikal/luminal/blod till basolateral/abluminal/vävnadsriktning. Detta protokoll kan modifieras för att detektera transcytos i motsatt riktning genom att placera spårmolekyler i bottenkammaren och övervaka upptag och frisättning i den apikala kammaren för att passa utredarnas behov. Dessutom, om det behövs, skulle ett ytterligare steg för att bestämma intracellulär ackumulering / nedbrytning av den endocytoserade spårbundna målmolekylen ge ytterligare mätning av transcytotiska vesiklar kvar i cytosolen32.

Den beskrivna analysen har många fördelar och fungerar som ett viktigt verktyg i BRB/BBB-relaterade studier, men det finns några begränsningar. Det är ett isolerat system som saknar interaktioner från andra celltyper av iBRB, såsom pericyter och glialceller, och kunde därför inte exakt efterlikna den fysiologiska in vivo-miljön. TEER-värden kan variera mellan mätningarna på grund av en temperaturförändring eller positionering av elektroderna25,38. Att balansera cellerna från 37 °C till rumstemperatur före mätningar, noggrann hantering av elektroderna och inkludera tomma kontroller kan dock hjälpa till att minimera fluktuationerna. Dessutom, även med tillräcklig tvätt, kan läckage från den paracellulära vägen, men i en spårmängd, inte helt uteslutas. Överlappning av HRP-transport mellan olika transcytosvägar, till exempel mellan caveolär transport och makropinocytos, båda är clathrinoberoende, kan också förekomma. Vid behov kan skillnaden undersökas ytterligare med hjälp av specifika modulatorer och/eller hämmare av caveolae och mikropinocytos.

Sammanfattningsvis beskriver detta dokument en in vitro-transcytosanalys som möjliggör kvantifiering av caveolae- eller bärarmedierad transcytos över BRB / BBB. In vitro-analysen kan vara till stor hjälp vid screening av olika pro-/anti-angiogena molekyler31, signalvägsmodulatorer24 eller läkemedelsleveranssystem 27,48 avseende BRB / BBB-kontroll. Undersökning av EG-polaritet och riktningstranscytos kan också dra nytta av detta lättanvända system. Med tanke på den begränsade tillgången på in vitro-modeller för iBRB och okulär forskning kan proceduren som beskrivs här också modifieras som ett samodlingssystem tillsammans med pericyter, astrocyter och 3-D organotypiska kulturer49, eller med hjälp av avancerade cellbaserade modeller som mikrofysiologiska neurovaskulära system50, för att ytterligare undersöka cellulära interaktioner och bättre efterlikna fysiologiska förhållanden in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter eller ekonomiska intressen att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH-bidrag (R01 EY028100, EY024963 och EY031765) till JC. ZW stöddes av ett Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , Wiley. Hoboken, NJ. 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, Pt 4 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

Tags

Medicin Utgåva 184 Blod-retinal barriär caveolae endotelceller transcytos Wnt
Endotelcellstranscytosanalys som en <em>in vitro-modell</em> för att utvärdera inre blod-retinal barriärpermeabilitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F.,… More

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter