Summary
このプロトコルは、ヒト網膜微小血管内皮細胞がカベオラ媒介性細胞輸送プロセスにおいて細胞間で西洋ワサビペルオキシダーゼを輸送する能力を測定することにより、内部血液網膜バリア透過性を評価するモデルとしての in vitro 内皮細胞トランスサイトーシスアッセイを示しています。
Abstract
血液網膜関門(BRB)の機能不全は、いくつかの血管性眼疾患の病態生理に寄与し、しばしば網膜浮腫およびその後の視力喪失をもたらす。内血網膜関門(iBRB)は、主に生理的条件下での透過性が低い網膜血管内皮で構成されています。低透過性のこの特徴は、隣接する網膜微小血管内皮細胞間の低速度の傍細胞輸送、ならびにそれらを通る経細胞輸送(トランスサイトーシス)によって厳密に調節および維持される。網膜経細胞バリア透過性の評価は、健康と疾患におけるiBRBの完全性に関する基本的な洞察を提供する可能性があります。この研究では、ヒト網膜微小血管内皮細胞(HRMEC)を使用して、iBRB透過性を評価する ためのin vitro モデルとして、内皮細胞(EC)トランスサイトーシスアッセイについて説明します。このアッセイでは、受容体およびカベオラを介した経細胞輸送プロセスにおいてトランスフェリンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)をそれぞれ輸送するHRMECの能力を評価します。多孔質膜上で培養した完全にコンフルエントなHRMECを、蛍光タグ付きトランスフェリン(クラスリン依存性トランスサイトーシス)またはHRP(カベオラ媒介性トランスサイトーシス)とともにインキュベートし、EC単層全体のトランスサイトーシスレベルを示す、底部チャンバーに転写されたトランスフェリンまたはHRPのレベルを測定しました。iBRBを調節する既知の経路であるWntシグナル伝達を調節して、カベオラを介したHRPベースのトランスサイトーシスアッセイ法を実証しました。ここで説明するECトランスサイトーシスアッセイは、血管病理におけるEC透過性およびiBRB完全性の分子調節因子を調査するための有用なツールを提供し、薬物送達システムをスクリーニングするための有用なツールを提供する可能性がある。
Introduction
人間の網膜は、体内で最もエネルギーを要求する組織の1つです。神経網膜が適切に機能するためには、血液網膜関門(BRB)を介して媒介される網膜環境を保護するために、酸素と栄養素の効率的な供給と、他の潜在的に有害な分子の制限されたフラックスが必要です1。中枢神経系の血液脳関門(BBB)と同様に、BRBは眼の選択的障壁として機能し、網膜に出入りするイオン、水、アミノ酸、糖の動きを調節します。BRBはまた、免疫細胞、抗体、有害な病原体などの循環因子への曝露を防ぐことにより、網膜の恒常性とその免疫特権を維持します2。BRB機能障害は、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)、未熟児網膜症(ROP)、網膜静脈閉塞症、ブドウ膜炎などのいくつかの血管眼疾患の病態生理に寄与し、血管原性浮腫とその後の視力喪失をもたらします3,4,5。
BRBは、網膜血管系と網膜下の開窓脈絡毛細血管という2つの異なる眼血管ネットワークに対する2つの別々の障壁で構成されています。内側BRB(iBRB)は、主に網膜微小血管系の内側を覆う網膜微小血管内皮細胞(RMEC)で構成され、網膜内神経層に栄養を与えます。一方、網膜色素上皮は、神経感覚網膜と絨毛毛細血管の間にある外側BRBの主要成分を形成しています2。iBRBの場合、RMEC間の分子輸送は、傍細胞経路と経細胞経路の両方を介して行われます(図1)。iBRB全体の高度な物質選択性は、(i)隣接する内皮細胞(EC)間の傍細胞輸送を制限する接合タンパク質複合体の存在、および(ii)低い細胞輸送速度を維持する内皮細胞内のカベオラメディエーター、トランスポーター、および受容体の発現レベルが低いことに依存しています1,6,7,8 .傍細胞フラックスを調節する接合複合体は、タイトジャンクション(クローディン、オクルジン)、アドヘレンスジャンクション(VEカドヘリン)、ギャップジャンクション(コネキシン)で構成されており、水と小さな水溶性化合物の通過を可能にします。小さな親油性分子はRMECの内部を受動的に拡散しますが、より大きな親油性分子と親水性分子の動きは、小胞輸送体や膜輸送体を含むATP駆動の経内皮経路によって調節されています5,9。
水疱性トランスサイトーシスは、カベオリン媒介性カベオラトランスサイトーシス、クラスリン依存性(および受容体媒介性)トランスサイトーシス、およびクラスリン非依存性マクロピノサイトーシスに分類できます(図2)。これらの小胞輸送プロセスにはさまざまなサイズの小胞が含まれ、マクロピノソームが最大(200〜500 nmの範囲)、カベオラが最小(平均50〜100 nm)であり、クラスリンコーティングされた小胞の範囲は70〜150 nm 10です。カベオラは、主にカベオリン足場ドメインを介して脂質膜コレステロールおよび他の構造およびシグナル伝達タンパク質に結合するカベオリン-1で構成される、タンパク質コートを備えたフラスコ型の脂質に富む原形質膜陥入です11。カベオリンは、末梢に付着したキャビンと一緒に働き、原形質膜12におけるカベオラ安定化を促進する。カベオラ膜はまた、インスリン、アルブミン、および高密度リポタンパク質(HDL)および低密度リポタンパク質(LDL)を含む循環リポタンパク質などの他の分子に対する受容体を担持して、内皮細胞を横切るそれらの移動を補助し得る13。発生中、機能的BRBの形成はECトランスサイトーシスの抑制に依存する8。したがって、成熟網膜内皮は、生理学的条件下で他の内皮細胞と比較して、カベオラ、カベオリン-1、およびアルブミン受容体のレベルが比較的低く、そのバリア特性に寄与しています4,9。
iBRBの分解は多くの眼疾患の大きな特徴であるため、網膜血管透過性をin vivoおよびin vitroで評価する方法を開発することが不可欠です。これらの方法は、BRBの完全性の低下のメカニズムに関する可能性のある洞察を提供し、潜在的な治療標的の有効性を評価するのに役立ちます。現在のin vivoイメージングまたは定量的血管漏出アッセイは、典型的には、蛍光(フルオレセインナトリウムおよびデキストラン)、比色(Evans Blue色素および西洋ワサビペルオキシダーゼ[HRP]基質)、または放射性トレーサー14を使用して、顕微鏡イメージングまたは単離された組織ライセート中の血管系から周囲の網膜組織への血管外漏出を検出する。血管の完全性を定量化するための理想的なトレーサーは、不活性で、健康で無傷の毛細血管内に閉じ込められた状態で、侵害された血管に自由に浸透するのに十分な大きさである必要があります。フルオレセインナトリウムまたはフルオレセインイソチオシアネート結合デキストラン(FITC-デキストラン)を生眼底フルオレセイン血管造影(FFA)または単離された網膜フラットマウントに使用する方法は、インビボまたはex vivoでの網膜血管外漏出の定量に広く使用されています。FITCデキストランには、サイズ選択的研究用に4〜70 kDaの範囲の異なる分子量で利用できるという利点があります15,16,17。FITCアルブミン(~68 kDa)は、血管漏出研究に生物学的に関連する代替の大型タンパク質トレーサーです18。心臓内19、眼窩後、または尾静脈20を通して注入されたEvans Blue色素も、内因性アルブミンとの結合に依存して、主に分光光度検出またはあまり一般的ではないがフラットマウント20,21の蛍光顕微鏡によって定量できる大きな分子を形成します。しかしながら、これらの定量的または光イメージング方法論は、しばしば傍細胞輸送と経内皮輸送を区別しない。トランスサイトーシス小胞の微細構造可視化によるトランスサイトーシスの特異的解析のために、HRPなどのトレーサー分子が典型的に使用され、電子顕微鏡下で観察できる内皮細胞内のトランスサイトーシス小胞の位置を特定する22,23,24(図3A-C)。
内皮細胞透過性を評価するためのin vitro iBRBモデルの開発と使用は、in vivo実験を補完し、血管漏出の分子調節因子の研究を支援するための堅牢でハイスループットな評価を提供する可能性があります。タイトジャンクションの傍細胞輸送と完全性を評価するために一般的に使用されるアッセイには、経内皮電気抵抗(TEER)、イオンコンダクタンスの測定値(図4)2,25、および低分子量蛍光トレーサー26を使用したin vitro血管漏出アッセイが含まれます。加えて、BBBをモデル化するトランスフェリンベースのトランスサイトーシスアッセイは、クラスリン依存性トランスサイトーシスを探索するために利用されている27。それにもかかわらず、BRB、より具体的には、インビトロでの網膜ECカベオラートランスサイトーシスを評価するアッセイは限られている。
本研究では、ヒト網膜微小血管内皮細胞(HRMEC)を in vitro モデルとして使用して、iBRB透過性とECトランスサイトーシスを決定するECトランスサイトーシスアッセイについて説明します。このアッセイは、受容体媒介性またはカベオラ依存性トランスサイトーシス経路を介してトランスフェリンまたはHRPを輸送するHRMECの能力に依存しています(図2)。頂端チャンバー(すなわち、フィルターインサート)で完全にコンフルエントになるまで培養したHRMECを蛍光結合トランスフェリン(Cy3-Tf)またはHRPとともにインキュベートし、ECトランスサイトーシスのみを介してボトムチャンバーに転写されたトランスフェリンまたはHRPのレベルに対応する蛍光強度を測定しました。細胞単層のコンフルエンシーは、TEERを測定することにより確認することができ、タイトジャンクション完全性を示す図25。TEERおよびトランスサイトーシスアッセイ技術を実証するために、血管内皮増殖因子(VEGF)28 およびWntシグナル伝達におけるもの(Wntリガンド:Wnt3aおよびNorrin)29を含む、血管透過性およびECトランスサイトーシスの既知の分子調節因子が使用されました。
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Protocol
すべての動物実験は、ボストン小児病院の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって、光学顕微鏡とEM画像の生成について承認されました(図3)。 インビボ 研究のためのプロトコルは、Wangら24から得ることができる。ヒト網膜微小血管内皮細胞(HRMEC)を含むすべての実験は、ボストン小児病院の施設内バイオセーフティ委員会(IBC)によって承認されました。
1. 試薬の調製
- 組織培養皿をコーティングするための溶液:1 mLのゼラチンストック溶液(40%-50%)を500 mLの滅菌組織培養グレード1x PBS(pH = 7.4)に溶解することにより、0.1%ゼラチン溶液を調製します。溶液を0.22 μmフィルターでろ過します。0.1%ゼラチン溶液を2〜8°Cで保存します。 無菌状態で無期限に前記温度で保存することができる。
- 増殖培地:製造元の指示に従ってEGMサプリメントを内皮細胞増殖基礎培地(EBM)に溶解することにより、500 mLの内皮細胞増殖完全培地(EGM)を調製します。増殖培地を50 mLチューブに分注し、チューブを4°Cで保存します。 増殖培地の貯蔵寿命は4°Cで12ヶ月です。
- トリプシン溶液:0.25%トリプシン-EDTA溶液の場合、ストックバイアルから50 mLチューブに分注し、4°C(最大2週間)または-20°C(最大24か月)で保存します。
2. HRMECの培養
- 初期細胞培養
- 細胞培養ペトリ皿(直径100 mm x 高さ20 mm)を5 mLの0.1%ゼラチン溶液で層流フードの下にコーティングし、均一なコーティングのために室温(RT)で30分間フード内で乱されないように保ちます。
注:ディッシュのゼラチンコーティングは細胞の接着を強化します。あるいは、ゼラチン被覆T75培養フラスコも使用することができる。 - 細胞を播種する前に、真空ポンプを用いてゼラチン溶液を吸引する。使用したアスピレーターの真空圧は最大724mmHgでした。
注:コーティング溶液の乾燥を防ぐために、細胞を播種する直前に吸引を行う必要があります。 - HRMECの凍結バイアル(液体窒素中での保存中)を、37°Cの水浴を使用するか、温かい増殖培地をバイアルに加えて解凍します。解凍したら、細胞懸濁液を9 mLの増殖培地に移します(解凍したHRMECのバイアルが1 mLであると仮定します)。
注:HRMECは商業的に入手されました(材料表)。細胞に添加する増殖培地は、使用前に常に37°Cに予熱する必要があります。 - 細胞を200 x g でRTで5分間回転させ、細胞ペレットが除去されないように上清を注意深く吸引します。
- 細胞ペレットを10 mLの増殖培地に再懸濁し、得られた懸濁液をゼラチンコーティングされたペトリ皿に移します。細胞をインキュベーター内で37°Cおよび5%CO2に保つ。典型的には、HRMECは72時間後に70%〜80%コンフルエントである。
注:増殖培地は一日おきに交換されます。
- 細胞培養ペトリ皿(直径100 mm x 高さ20 mm)を5 mLの0.1%ゼラチン溶液で層流フードの下にコーティングし、均一なコーティングのために室温(RT)で30分間フード内で乱されないように保ちます。
- 透過性メンブレンインサートでのHRMECの継代培養
- 各インサート(頂端チャンバー)を200 μLの0.1%ゼラチン溶液で層流フード下で30分間コーティングすることにより、HRMECを播種するための細胞培養フィルターインサート(孔径0.4 μmのポリカーボネート膜を備えた6.5 mmインサート、24ウェルプレートに入れます)を準備します。溶液がフィルターインサートの底面全体を覆っていることを確認してください。
注:各ウェルには、多孔質膜で区切られた頂端室と基底側室があります。 - 培養したHRMECを含むペトリ皿(ステップ2.1.5)をインキュベーターから取り出し、増殖培地を吸引します。層流フードの下で10 mLの1x PBSで細胞を2回静かにすすぎ、潜在的な浮遊/死細胞を取り除きます。
- 細胞を0.5〜1 mLの0.25%トリプシン-EDTA溶液で解離し、ペトリ皿をインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に5分間入れます。
- 4.5〜9 mLの増殖培地を加えてトリプシン活性を消光し、10 mLピペットを使用して細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。
- 細胞を200 x g でRTで5分間スピンさせ、上清を注意深く除去し、ペレットを3 mLの成長培地に再懸濁します。
- 手動血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞数をカウントし、フィルターインサートあたり4 x 104 細胞の密度でシードします(つまり、1.25 x 105 細胞/ cm2)。各インサートの細胞懸濁液の容量は250 μLです。
- 透過性インサートを含むウェルからコーティング溶液を吸引し、インサート(頂端チャンバー)あたり250 μLの細胞懸濁液を移します。インサートの1つに培地(つまり、セルなし)のみを追加し、TEER測定の「ブランクコントロール」として使用します。同時に、基底外側チャンバーにウェルあたり750 μLの培地も加えます。
- 培養細胞が完全にコンフルエントになり、~20 Ω・cm2の所望のTEER値が達成されるまで、透過性インサートを備えた24ウェルプレートをインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に7〜12日間保持します。
- 成長培地を一日おきに交換してください。培地交換中は、細胞単層の破壊を最小限に抑えるために培地を注意深く吸引し、ウェルあたりそれぞれ250 μLおよび750 μLの新鮮な培地を頂端室および基底外側チャンバーに追加します。
注:増殖培地は、ウェルの頂端室と基底外側室の両方で変更されます。
- 各インサート(頂端チャンバー)を200 μLの0.1%ゼラチン溶液で層流フード下で30分間コーティングすることにより、HRMECを播種するための細胞培養フィルターインサート(孔径0.4 μmのポリカーボネート膜を備えた6.5 mmインサート、24ウェルプレートに入れます)を準備します。溶液がフィルターインサートの底面全体を覆っていることを確認してください。
3. TEER測定(図4)
- 細胞播種後14日目(ステップ2.2.9)に、上皮ボルトオームメーター(EVOM)電気抵抗(ER)システム(材料表)を使用してHRMECのTEERを次のように測定します。
- ERシステムをプリチャージし、STX04テスト電極を使用してメーターの機能を確認します。必要に応じて調整します。
- 電極をメーターに接続し、最初に70%エタノールに15〜20分間浸してから、細胞培養EGM増殖培地に短時間浸して電極を平衡化します。
- それまでの間、温度平衡化のために、セルを含む24ウェルプレートを層流フード内のRTで15〜20分間保持します。
注:TEER測定は温度の影響を受けるため、平衡化ステップが不可欠です。 - TEER測定では、ウェルの頂端(250 μL)チャンバーと基底外側チャンバー(750 μL)の両方に新鮮な増殖培地を追加します。
- 短い方の先端がインサートに入り、長い方の先端がウェルの底に触れるように電極を注意深く浸して、TEER測定を実行します。最初にブランクコントロールの両端の抵抗を測定します。各インサートについて、TEARを三重で測定します。
注:測定の合間に電極をすすぐために、培地が使用されます。安定した読み取りのために、電極がチップの底に対して90°の角度で保持されていることを確認してください。 - TEER =正味抵抗(Ω)xフィルターインサートの表面積(cm2)の式を使用して、単層全体の電気抵抗(Ω・cm2)を計算します。ここで、正味抵抗は、各ウェル(細胞を含む増殖培地)とブランクウェル(増殖培地のみ)の抵抗値の差である。
- TEER値が~20 Ω・cm2に達した後にのみ、細胞のさらなる処理を行います。希望のTEERレベルに達していない場合は、プレートをインキュベーターに保管し、翌日TEERを測定します。
注:HRMECコンフルエントは、典型的な石畳の形態による細胞形状の形態学的検査(顕微鏡下)および/または免疫組織化学染色による細胞接合タンパク質の存在によっても検証できます。
4.トランスサイトーシスアッセイ
- Cy3タグトランスフェリンを用いたクラスリン媒介 in vitro トランスサイトーシスアッセイ(図5)
- 20 Ω·cm2付近のTEER値でコンフルエントに達したら、リガンドで処理する前に、血清は両チャンバー(頂端室:250 μLおよび基底外側チャンバー:750 μL)のEBM(血清還元培地)中の0.5%FBSを使用して、37°Cおよび5%CO2 で24時間細胞を奪います。血清還元EBMをアッセイ全体を通して使用した。
- 細胞を(ステップ4.1.1の血清還元培地を使用して)蛍光(シアニン3)タグ付きトランスフェリンリガンド(Cy3-Tf)(最終濃度40 μg/mL)とともに頂端室で37°Cで60分間インキュベートします。
注:Cy3-Tfを含むプレートは、Cy3-Tfの光退色を防ぐために、アルミホイルで包み、ライトをオフにして細胞培養フードで実験を行うことにより、光から保護する必要があります。 - 1時間後、プレートを氷上に置き、単層をRTで血清還元培地で4倍(洗浄あたり3〜5分)に単層を尖端および基底外側に洗浄して、遊離の未結合Cy3-Tfを除去します。
注:洗浄は、遊離トレーサー分子を除去し、傍細胞経路からの潜在的な漏出なしにトランスサイトーシスの正確な読み取りを可能にするために不可欠です。 - 細胞を含む徹底的に洗浄されたフィルターインサートに新鮮な血清還元培地を追加し(ステップ4.1.1と同様)、事前に温めた血清還元培地を含む24ウェルプレートの新鮮なウェルにインサートを移します。
- 細胞をインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)内でさらに90分間インキュベートし、次いで基底外側チャンバーから培地を回収する。
- 蛍光検出器を用いて基底外側チャンバーからの溶液の蛍光強度を記録する。相対蛍光単位(RFU)として測定された蛍光強度のレベルは、クラスリン依存性トランスサイトーシスを介してHRMEC単層全体でトランスサイトーゼされたCy3-Tf複合体の量を示します。
- HRPを用いたカベオラを介した in vitro トランスサイトーシスアッセイ(図6)
- 約20 Ω·cm2のTEER値で完全なコンフルエントに達したら、血清は、処理前に0.5%FBS含有EBM培地(血清還元培地)を使用して、37°Cおよび5%CO2 で24時間細胞を奪います(ステップ4.1.1と同様)。血清還元EBM培地は、アッセイ全体を通して使用した。
- 頂端室の細胞を所望の処理およびビヒクルコントロールで処理する。
注:ここでは、HRMECのWntシグナル伝達経路によるカベオラ媒介性トランスサイトーシスの調節を実証するために、例としてWntモジュレーターを使用しました:ヒト組換えノリンおよびWnt阻害剤XAV939。典型的な実験では、細胞をインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)で24時間処理し、次の濃度で:ノリン(125 ng / mL)、ノリン(125 ng / mL)+ XAV939(10 μM)、およびビヒクルコントロール溶液。さらに、Wnt3a馴化培地(L Wnt-3A細胞から産生)も使用した。 - 頂端チャンバー内の細胞をHRP(5 mg/mL)とともに37°Cで15分間インキュベートします。
- その後、24ウェルプレートを氷上に置き、尖端および基底外側チャンバーをPバッファー(10 mM HEPES pH = 7.4、1 mM ピルビン酸ナトリウム、10 mM グルコース、3 mM CaCl2、145 mM NaCl)で集中的に洗浄して、遊離細胞外HRPを除去します。
注:洗浄は、遊離トレーサー分子を除去し、傍細胞経路からの潜在的な漏出なしにトランスサイトーシスの正確な読み取りを可能にするために不可欠です。 - 新鮮な血清還元培地(ステップ4.1.1と同様)を頂端チャンバーに追加し、インサートを予熱した培地を含む新鮮なウェルに移します。
- 基底外側チャンバーから培地を回収する前に、37°Cおよび5%CO2 のインキュベーター内で単層をさらに90分間インキュベートします。
- 回収した培地に、製造元の指示に従って100 μLのHRP蛍光発生ペルオキシダーゼ基質(材料表)を加え、RTで10分間インキュベートしてから、100 μLのStop溶液で反応を停止します。
- 蛍光プレートリーダーを使用して、培地中のHRP基質反応生成物のレベルを検出します。420 nmの発光波長(325 nmの励起時)および相対蛍光単位(RFU)での蛍光強度を測定します。値は、カベオラ媒介性トランスサイトーシスを介してHRMEC層全体にトランスサイトーゼされたHRPのレベルを示します。
注:ここで使用されている蛍光製品(材料表)は光退色しません。光退色に対する光保護は必要ありません。
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Representative Results
網膜血管内皮のEM画像は、in vivoの内皮細胞における経サイトーシス小胞輸送およびカベオラ小胞を示す。
ECトランスサイトーシスは、光学顕微鏡下でHRP含有血管を反射する暗褐色の沈殿物を有する網膜断面内でin vivoで視覚化することができ(図3A)、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いてHRP含有トランスサイトーシス小胞を示す電子密度の高い沈殿物として(図3B、C)、iBRB全体のECトランスサイトーシスを実証することができます。大きな小胞は潜在的にマクロピノサイトーシスを反映しています(白い矢じり;図3B)、そして小さな小胞はおそらくカベオラ小胞(白い矢じり;図3C)。さらに、網膜血管におけるカベオラの局在は、蛍光顕微鏡下で血管内のカベオラマーカーCAV-1抗体とイソレクチン(ECマーカー)との共染色として見ることができます(図3D)。CAV-1陽性のカベオラ小胞は、免疫金標識CAV-1抗体(黒い点;図3E)網膜血管内皮細胞内。インビボ研究のためのプロトコルは、Wangら24から得ることができる。
VEGF治療は、経内皮電気抵抗(TEER)によって測定されるHRMECの血管透過性を増加させます
ECトランスサイトーシスアッセイを実施する前に、HRMECを完全なコンフルエントまで培養し、光学顕微鏡で観察できる特徴的な石畳の形態を示す必要があります。フルセルコンフルエンシーは、経内皮電気抵抗(TEER)測定(図4A)によって検証でき、コンフルエントHRMEC 30の読み取り値は~20 Ω·cm2に達し、タイトまたはギャップジャンクションを介した単層を横切る傍細胞輸送のレベルが低いことを示唆しています。血管内皮増殖因子(VEGF)を例として使用して、TEER測定を実証しました。VEGFによるHRMECの治療は、HRMEC透過性の増加を反映して、TEERレベルを有意に低下させました(図4B)。TEER値の低下は、おそらく培養期間および細胞31に有害である可能性のある異なる時間間隔で行われた複数の測定に起因する、対照細胞でも観察された。
Cy3-トランスフェリンの輸送は、HRMECにおけるクラスリン媒介ECトランスサイトーシスの評価に利用できます
クラスリンを介したECトランスサイトーシスでは、多孔質膜上で培養したコンフルエントなHRMECを蛍光(Cy3)タグ付きトランスフェリンとともにインキュベートし、EC間の輸送を検出しました(図5A)。このアッセイは、トランスフェリンの輸送が受容体媒介性トランスサイトーシスプロセスであるという事実を利用しています。Cy3-トランスフェリンエンドサイトーシス(赤色)は、核染色剤DAPI(青色)と共染色したHRMEC単層で観察され(図5B)、細胞への取り込みが確認されました。(Cy3)タグ付きトランスフェリンの蛍光強度は、画像から定量化してエンドサイトーシスプロセスを評価したり、ウェルの基底外側チャンバーから収集された培地から測定してクラスリン媒介性トランスサイトーシスのレベルを定量化したりできます27。
Wntシグナル伝達経路は、HRPベースのアッセイにおいて、HRMEC全体でカベオラを介したECトランスサイトーシスを調節します
これまで、Wntシグナル伝達は、網膜血管EC全体でMFSD2A依存性のカベオラ媒介性トランスサイトーシスを調節してiBRB24を維持することがわかっています。Wntモジュレーターの効果を、HRPベースの インビトロ トランスサイトーシスアッセイで評価した(図6A)。完全にコンフルエントなHRMECをWnt経路アクチベーター(Wnt3a-CM)またはヒト組換えNorrin、Wnt/β-カテニンシグナル伝達阻害剤XAV939の有無にかかわらず処理し、HRMEC全体でトランスサイトーゼーションHRPのレベルを検出しました。Wnt3a-CMまたはNorrinによる治療は、カベオラトランスサイトーシスの減少を示すトランスサイトーシスHRPのレベルが有意に低下したことを明らかにしました。.さらに、Wntシグナル阻害剤XAV939との併用治療では、HRMECにおけるトランスサイトーゼされたHRPのレベルがアップレギュレートされ、HRMEC透過性に対するWntアクチベーターの影響が消失しました(図6B、C)24。
図1:網膜血管内皮を横切るさまざまな輸送経路。 網膜微小血管内皮細胞(RMEC)を横切る分子フラックスの異なる経路を示す概略図。網膜内関門内の網膜血管内皮細胞を横断する輸送は、トランスサイトーシスを含む傍細胞経路と経細胞経路の2つの主要な経路を介して行われます。この図は、Yemanyiらの許可を得て翻案された5。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:内皮細胞を横断する経サイトーシス小胞輸送経路の概要とそれぞれの in vitro 評価。 内皮細胞(EC)では、高分子の経細胞移行は、カベオラ小胞(50-100 nm)、クラスリン被覆小胞(70-150 nm)、またはクラスリン非依存性マクロピノソーム(200-500 nm)の3つの主要なタイプの小胞を介して発生します。カベオラは、原形質膜のフラスコ形状の球形の脂質が豊富なマイクロドメインであり、カベオリンとキャビンで構成されています。これらの小胞を介したトランスサイトーシスのレベルは、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と蛍光基質、蛍光タグ付きトランスフェリン(Cy3-Tf)、またはテトラメチルローダミンタグ付きウシ血清アルブミン(TMR-BSA)を組み合わせたEC培養における蛍光ベースの in vitro アッセイによって決定できます。各経路には異なる特徴と輸送メカニズムがありますが、特にカベオラ輸送とマクロピノサイトーシスの間で、機能と物質輸送が重複する可能性があり、どちらもクラスリンに依存しません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:網膜におけるECトランスサイトーシスの可視化。 (A)光学顕微鏡画像は、3,3'−ジアミノベンジジン(DAB)で染色された3ヶ月齢の野生型(WT)マウス網膜切片からのHRPで満たされた血管内腔を示す(黒色)。HRPをWTマウスに眼窩後注射し、続いて眼の単離および組織包埋を行った。暗褐色の沈殿物としてのHRPの比色検出のために、薄い切片を電子密度の高いDAB基板で染色し、光学顕微鏡で画像化して網膜血管内腔内のHRPを明らかにしました。(B,C)次に、サンプルを透過型電子顕微鏡(TEM)超薄膜切片でさらに処理して、HRPを含むトランスサイトーシス小胞を視覚化し、iBRB全体のECトランスサイトーシスを示しました。TEM画像は、RMEC内にHRPで満たされた血管内腔とHRPを含む小胞を持つ生後3か月のWTマウスの網膜切片を示しています。(B)時折大きな小胞は、EC内のマクロピノソーム(矢じり)を反映する可能性があり、管腔側に赤血球(アスタリスク)が存在します。(C)小さな小胞はおそらくカベオラー小胞(矢じり)です。(D)CAV-1抗体(緑)とイソレクチンB4(IB4、赤、ECマーカー)の免疫組織化学共染色は、3ヶ月齢WTマウス網膜(DAPI、青)の網膜血管におけるCAV-1の局在を実証する。(E)網膜EC内の免疫金標識CAV-1のTEM画像(黒い点、矢印);挿入図は、CAV-1陽性のカベオラ小胞の拡大像を示す。略語:HRP =西洋ワサビペルオキシダーゼ;GCL =神経節細胞層;IPL =内側の網状層;INL =内顆粒層;OPL =外側の網状層;ONL =外顆粒層;RPE =網膜色素上皮;E =内皮細胞;L =血管内腔。倍率:(A、D)20倍。スケールバー:(A)50μm、(B)2μm、(D)100μm、および(C、E)200nm。パネル(E)は、Wangらの許可を得て翻案された24。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:VEGF治療後のHRMECにおける完全にコンフルエントなHRMECと血管透過性の増加の検証 。 (A)細胞単層の血管透過性および完全性の評価としての経内皮電気抵抗(TEER)測定のためのウェルの頂端および基底外側チャンバー内の電極の位置を示す概略図。(B)血管内皮増殖因子(VEGF)による前治療の有無にかかわらず、完全にコンフルエントなHRMECのTEER記録を示すグラフ。18時間(18時間)後のVEGFによる治療は、完全にコンフルエントなHRMECにおけるTEERの低下をもたらす31。 p≤0.001。パネル(B)は、富田らの許可を得て翻案した31。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:トランスフェリン(Tf)を用いたHRMECにおけるクラスリン媒介ECトランスサイトーシスアッセイの概略図 。 (A)HRMECsをゼラチンコートインサート上で完全にコンフルエントになるまで増殖させ、アッセイ前に血清を37°Cで一晩飢餓状態にした。細胞を蛍光Cy3結合トランスフェリン(Cy3-Tf)と共に37°Cで60分間アピカルインキュベートした。 インキュベーション後、細胞を新鮮な培地で集中的に洗浄し、結合していない細胞外Cy3-Tfを除去した。次に、新しい培地を含むインサートを基底外側チャンバー内の温かい培地を含む新しいプレートに移し、細胞を37°Cでさらに90分間インキュベートして、エンドサイトーゼされたCy3-Tfを放出しました。基底外側チャンバーから培地を採取し、クラスリン依存性(Cy3-Tf)ECトランスサイトーシスに対応する蛍光強度を蛍光プレートリーダーを用いて測定することができる。(B)DAPI(青色)で染色したHRMECにおいてCy3-トランスフェリン(赤色)が観察され、エンドサイトーシスが確認された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:Wntシグナル伝達は、in vitro HRPベースのアッセイにおいて、カベオラを介したHRMECトランスサイトーシスを調節します。 (A)カベオラ媒介性トランスサイトーシスを評価するためのHRPベースのアッセイを示す概略図。ゼラチンコーティングインサート上で培養した完全にコンフルエントなHRMECを、処理前に0.5%ウシ胎児血清(FBS)+ EBM培地で37°Cで一晩飢餓状態にした。頂端室内のEC単分子膜を、37°Cで24時間所望の処理で処理した。 その後、細胞を西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)とともに37°Cで15分間インキュベートし、集中的に洗浄して遊離細胞外HRPを除去した。次に、新鮮な培地を含むインサートを基底外側チャンバー内の温かい培地を含む新しいプレートに移し、細胞を37°Cでさらに90分間インキュベートしました。 基底外側チャンバーから培地を回収し、蛍光発生ペルオキシダーゼ基質との反応によりHRPレベルを定量した。カベオラ媒介ECトランスサイトーシスに対応する蛍光を蛍光プレートリーダーを用いて測定した。(B,C)この例では、細胞をWnt経路モジュレーターで処理しました:Wnt3a調節培地(Wnt3a-CM)またはその対照調節培地(Ctrl-CM)、ヒト組換えノリンまたはその対照溶液(Ctrl)、およびWnt/β-カテニンシグナル伝達阻害剤(XAV939)またはそのビヒクル制御(ビヒクル)の有無にかかわらず。HRMECカベオラトランスサイトーシスに対するそれらの効果は、HRPベースのアッセイで評価されました。治療後、基底外側チャンバーに移されたHRPのレベルが測定され、HRMEC全体のカベオラ媒介ECトランスサイトーシスレベルが示されました。WntアクチベーターはHRPベースのトランスサイトーシスのレベルを低下させ、XAV939によって逆転した。* p≤0.05, ** p≤0.01.パネル(B)および(C)は、Wangらの許可を得て翻案された24。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
BRBは網膜の健康と病気に不可欠な役割を果たしています。血管透過性を評価するin vitro技術は、バリア(BRB / BBB)の発生と機能に関する研究において重要なツールであることが証明されています。ここで説明する手順は、ECトランスサイトーシスの根底にある分子メカニズムを研究したり、BRB透過性に影響を与える関連する分子調節因子を評価したりするために利用できます。インビトロECトランスサイトーシスアッセイは、血管透過性を評価するために使用されるin vivoアッセイまたは技術に比べて複数の利点があります。これらは高速に高いスループットで実行でき、遺伝的および薬理学的調節の両方を使用して、多くの異なる変数または特定のシグナル伝達経路の単離された分子の影響を分析するために利用できます。純粋なEC培養システムは、インビボでしばしば観察されるような動物の変動を消し去り、他の細胞型による標的分子の可能な修飾またはエンドサイトーシスの影響も制限します32。HRMEC細胞の取り扱いは簡単で、ほとんどの実験室で利用可能な基本的な細胞培養装置が必要であり、細胞培養はin vivo動物実験と比較してコスト効率が高いことがよくあります。in vitroトランスサイトーシスアッセイは、in vivoの生理学的条件を完全に再現するわけではありませんが33、in vivo研究を補完し、BRB 制御に関する知識を進歩させるための貴重なツールになる可能性があります。
フィルターインサートの孔径、基層の種類、細胞播種密度など、いくつかの重要な技術的パラメータを考慮する必要があります。透過性フィルターインサートの孔径が大きいと、インサートの下側の細胞の望ましくない移動と成長が生じ、結果として得られる測定とその解釈が混乱する可能性があります。この傾向は細胞タイプによって異なりますが、孔径≤1 μmはEC34を含むほとんどの細胞タイプで良好に機能します。一部の細胞は、多孔質基層上で増殖し、両側の培養培地に浸すと、より高い極性およびより大きな分化を示すため、適切な基層の選択は第2の重要なステップである35,36。処理された微多孔性ポリカーボネートフィルターは、より薄く、イムノアッセイ用の最小限のバックグラウンド蛍光で単層の基底外側ゾーンへの試薬のより大きなアクセスを提供するため、ECのより良い代替品です35。最後に、完全にコンフルエントな単分子膜を達成するためには、特定の細胞タイプに基づいて細胞播種密度を最適化する必要があります。播種密度が低すぎると分化状態に影響を与える可能性がありますが、播種密度が高すぎると、単層ではなく複数の細胞層を形成する細胞を迅速に付着させ、最終的には細胞の形態を変化させ、トランスサイトーシス測定が不正確になる可能性があります37。
EC単分子膜の形成と完全性は、このアッセイにとって非常に重要であり、TEER値を測定して目的のTEERを確実に達成することによって検証できます。ブランクコントロール、すなわち細胞のないフィルターインサートは、細胞インサートからの抵抗から差し引かれる透過性膜全体の抵抗の基礎レベルを測定するために常に含める必要があります。温度、細胞継代数、培地の組成、培養期間、接合部の長さの変化などのさまざまな要因はすべて、TEER値にわずかな変動を引き起こす可能性があります25、38、39。TEER値は、VEGFなどの特定の処理の影響も大きく受けます。血管透過性の強力な誘導因子として最初に発見されたVEGFは、傍細胞輸送、すなわちタイトジャンクションタンパク質ZO-1、オクルージンのリン酸化、およびタイトジャンクションタンパク質クローディン-5の破壊41,42および経細胞輸送43を介して血管透過性に影響を与えます。.単層形成のさらなる検証は、形態学的検査および染色による特徴的な接合タンパク質の存在によって行うことができる。培養全体を通して、理想的なpH範囲と栄養素の利用可能性で細胞を最適な培養状態に保つために、頂端チャンバーと基底外側チャンバーの両方で定期的に培地を交換することをお勧めします。
このアッセイを使用する研究者は、脳および網膜ECの重要な固有の特徴である、BBB44および同様にBRBの細胞の特徴である頂端基底極性に注意を払う必要があります。トランスサイトーシスの方向は、目的のタンパク質標的受容体の相対分布と、EC膜の頂端/管腔ドメインと基底外側/アブミナルドメインにおける関連するトランスサイトーシス機構によって決定されます。脳および網膜ECは、頂端/管腔および基底外側/アブミナル膜の両方から多くの因子を放出することができる44。トランスフェリンのクラスリン依存性トランスサイトーシスは、興味深いことに、トランスフェリン受容体が主に頂端/管腔膜に位置するため、血液側から脳または網膜へのほとんど一方向に起こるようである45。一方、カベオラトランスサイトーシスは双方向に発生し、小胞貨物とその受容体の局在に応じて、頂端/管腔または基底外側/管腔膜のいずれかから、反対側に渡って発生する可能性があります46。膜貫通脂質受容体(オメガ3脂肪酸ドコサヘキサエン酸)であり、カベオラトランスサイトーシスの抑制因子であるMFSD2Aも、EC23,47の頂端/管腔ドメインに位置しています。MFSD2Aの発現は、このプロトコル24に例として例示されるように、BRB制御に対するその影響を媒介するためにWntシグナル伝達によって転写調節される。したがって、ここで説明する技術では、EC単層による取り込みに続いて上部/頂端室に配置されたトレーサー分子を検出し、底部/基底外側チャンバーに放出し、頂端/管腔/血液から基底外側/アブミナル/組織方向のトランスサイトーシスを模倣します。このプロトコルは、トレーサー分子をボトムチャンバーに配置し、研究者のニーズに合わせて頂端チャンバーへの取り込みと放出を監視することにより、反対方向のトランスサイトーシスを検出するように変更できます。さらに、必要に応じて、エンドサイトーゼされたトレーサー結合標的分子の細胞内蓄積/分解を決定するための追加のステップは、サイトゾル32に残っている経サイトーシス小胞のさらなる測定をもたらすであろう。
記載されたアッセイには多くの利点があり、BRB / BBB関連の研究において不可欠なツールとして機能しますが、いくつかの制限があります。これは、周皮細胞やグリア細胞などの他の細胞タイプのiBRBからの相互作用を欠いている単離されたシステムであるため、生理学的なin-vivo環境を正確に模倣することはできませんでした。TEER値は、電極25,38の温度または位置の変化により、測定間で変化し得る。ただし、測定前にセルを37°Cから室温まで平衡化し、電極を慎重に取り扱い、ブランクコントロールを含めることで、変動を最小限に抑えることができます。さらに、十分な洗浄を行っても、傍細胞経路からの漏れは微量ではありますが、完全に排除することはできません。異なるトランスサイトーシス経路間、例えば、クラスリン非依存性であるカベオラー輸送とマクロピノサイトーシスとの間のHRP輸送の重複もまた起こり得る。必要に応じて、カベオラおよびミクロピノサイトーシスの特異的モジュレーターおよび/または阻害剤を使用して、区別をさらに調査することができます。
要約すると、この論文では、BRB / BBB全体のカベオラまたはキャリアを介したトランスサイトーシスの定量化を可能にするin vitroトランスサイトーシスアッセイについて説明します。インビトロアッセイは、BRB / BBB制御に関連するさまざまな血管新生促進/抗血管新生分子31、シグナル伝達経路モジュレーター24、または薬物送達システム27,48のスクリーニングに非常に役立つ可能性があります。EC極性と方向性トランスサイトーシスの調査も、この使いやすいシステムの恩恵を受けることができます。iBRBおよび眼の研究のためのin vitroモデルの限られた利用可能性を考慮すると、ここで概説する手順は、周皮細胞、星状細胞、および3D有機型培養49と一緒に共培養システムとして、または微小生理学的神経血管系50などの高度な細胞ベースのモデルを使用して、細胞相互作用をさらに調査し、in vivoでの生理学的条件をよりよく模倣するために変更することもできます。
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Disclosures
著者は、開示する利益相反または金銭的利益を持っていません。
Acknowledgments
この作業は、JCへのNIH助成金(R01 EY028100、EY024963、およびEY031765)によってサポートされました。ZWは、テンプル騎士団アイ財団キャリアスターターグラントによってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
| Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
| Light microscope | Leica | DMi1 | |
| Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
| Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |
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