Summary
该协议说明了 体外 内皮细胞转吞测定作为评估内部血 - 视网膜屏障通透性的模型，通过测量人视网膜微血管内皮细胞在洞穴介导的跨细胞运输过程中跨细胞运输辣根过氧化物酶的能力。
Abstract
血液 - 视网膜屏障（BRB）的功能障碍有助于几种血管性眼病的病理生理学，通常导致视网膜水肿和随后的视力丧失。内部血视网膜屏障（iBRB）主要由生理条件下通透性较低的视网膜血管内皮组成。这种低通透性的特征受到严格调节，并通过相邻视网膜微血管内皮细胞之间的低细胞旁转运速率以及通过它们的跨细胞转运（转胞作用）来维持。视网膜跨细胞屏障通透性的评估可能为iBRB在健康和疾病中的完整性提供基本见解。在这项研究中，我们描述了一种内皮细胞（EC）转吞测定，作为使用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）评估iBRB通透性的 体外 模型。该测定分别评估了HRMEC在受体和洞穴介导的跨细胞运输过程中运输转铁蛋白和辣根过氧化物酶（HRP）的能力。将培养在多孔膜上的完全融合的HRMEC与荧光标记的转铁蛋白（网格蛋白依赖性转胞作用）或HRP（洞穴介导的转胞作用）一起孵育，以测量转移到底室的转铁蛋白或HRP的水平，指示EC单层的转吞水平。Wnt信号传导是一种已知的调节iBRB的途径，被调节以证明洞穴介导的基于HRP的转吞测定方法。此处描述的EC转吞测定可为研究血管病理学中EC通透性和iBRB完整性的分子调节因子以及筛选药物递送系统提供有用的工具。
Introduction
人类视网膜是人体中能量需求最高的组织之一。神经视网膜的正常运作需要有效的氧气和营养物质供应以及其他潜在有害分子的限制通量来保护视网膜环境，这是通过血液 - 视网膜屏障（BRB）介导的1。与中枢神经系统中的血脑屏障（BBB）类似，BRB在眼睛中充当选择性屏障，调节离子，水，氨基酸和糖进出视网膜的运动。BRB还通过防止暴露于循环因子（如免疫细胞，抗体和有害病原体）来维持视网膜稳态及其免疫特权2。BRB 功能障碍有助于多种血管性眼病的病理生理学，例如糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性 （AMD）、早产儿视网膜病变 （ROP）、视网膜静脉阻塞和葡萄膜炎，导致血管源性水肿和随后的视力丧失3，4，5。
BRB由两个独立的屏障组成，分别用于两个不同的眼血管网络：视网膜脉管系统和视网膜下方的开窗脉络膜毛细血管。内部BRB（iBRB）主要由视网膜微血管系统衬里的视网膜微血管内皮细胞（RMEC）组成，其滋养视网膜内部神经元层。另一方面，视网膜色素上皮形成外BRB的主要成分，位于神经感觉视网膜和脉络膜毛细血管之间2。对于iBRB，跨RMEC的分子转运通过细胞旁和跨细胞途径发生（图1）。iBRB的高度物质选择性取决于（i）连接蛋白复合物的存在，这些复合物限制了相邻内皮细胞（ECs）之间的细胞旁转运，以及（ii）内皮细胞内保持低跨细胞转运速率的洞穴介质，转运蛋白和受体的低表达水平1，6，7，8.调节细胞旁通量的连接复合物由紧密连接（claudins，occludins），粘附连接（VE cadherins）和间隙连接（连接蛋白）组成，允许水和小的水溶性化合物通过。虽然小的亲脂性分子被动地扩散到RMEC的内部，但较大的亲脂性和亲水性分子的运动受到ATP驱动的跨内皮途径的调节，包括囊泡运输和膜转运蛋白5，9。
水疱转胞作用可分为洞穴蛋白介导的洞穴转胞作用、网格蛋白依赖性（和受体介导的）转胞作用和网格蛋白依赖性巨胞细胞增多症（图 2）。这些囊泡转运过程涉及不同大小的囊泡，其中巨松体最大（范围为200-500nm），洞穴最小（平均为50-100nm），而网格蛋白包被的囊泡范围为70-150nm10。洞穴是带有蛋白质外壳的烧瓶形富含脂质的质膜内陷，主要由洞穴蛋白-1组成，其通过其洞穴蛋白支架结构域结合脂质膜胆固醇和其他结构和信号蛋白11。洞穴与外周附着的洞穴一起工作，以促进质膜12处的洞穴稳定。洞穴膜还可能携带其他分子的受体，如胰岛素、白蛋白和循环脂蛋白，包括高密度脂蛋白 （HDL） 和低密度脂蛋白 （LDL），以帮助它们在内皮细胞中移动13。在发育过程中，功能性BRB的形成取决于EC转吞作用的抑制8。因此，在生理条件下，成熟的视网膜内皮相对于其他内皮细胞具有相对较低的洞穴、洞穴蛋白-1 和白蛋白受体水平，这有助于其屏障特性4，9。
由于iBRB分解是许多病理性眼病的主要标志，因此开发评估体内和体外视网膜血管通透性的方法至关重要。这些方法有助于提供对BRB完整性受损机制的可能见解，并评估潜在治疗靶点的疗效。目前的体内成像或定量血管渗漏测定通常采用荧光（荧光素钠和葡聚糖）、比色法（埃文斯蓝染料和辣根过氧化物酶[HRP]底物）或放射性示踪剂14，以通过显微镜成像或分离的组织裂解物检测从脉管系统外渗到周围视网膜组织中。用于量化血管完整性的理想示踪剂应该是惰性的，并且足够大，以便在限制在健康和完整的毛细血管内时自由渗透受损血管。在活眼底荧光素血管造影（FFA）或分离视网膜平面支架中使用荧光素钠或异硫氰酸荧光素偶联葡聚糖（FITC-葡聚糖）的方法广泛用于定量体内或离体视网膜外渗。FITC-葡聚糖的优点是具有不同的分子量范围，范围为4-70 kDa，用于大小选择性研究15，16，17。FITC白蛋白（~68 kDa）是一种替代的大尺寸蛋白质示踪剂，与血管渗漏研究具有生物学相关性18。埃文斯蓝染料，心内注射19，眶后或通过尾静脉20，也依赖于其与内源性白蛋白的结合形成一个大分子，该分子可以通过大多数分光光度法检测或不太常见的荧光显微镜在平面安装20，21中进行定量。然而，这些定量或光成像方法通常不能区分细胞旁转运和经内皮转运。对于通过转吞囊泡的超微结构可视化对转吞作用进行特异性分析，通常使用诸如HRP之类的示踪分子来定位内皮细胞内的转吞囊泡，可以在电子显微镜下观察到22，23，24（图3A-C）。
开发和使用体外iBRB模型来评估内皮细胞通透性可以提供稳健和高通量的评估，以补充体内实验，并有助于研究血管渗漏的分子调节因子。评估紧密连接的细胞旁转运和完整性的常用测定包括跨内皮电阻（TEER），离子电导的量度（图4）2，25，以及使用小分子量荧光示踪剂的体外血管渗漏测定26。此外，基于转铁蛋白的转胞作用测定建模BBB已被用于探索网格蛋白依赖性转吞27。尽管如此，体外评估BRB和更具体地说，视网膜EC洞穴转吞作用的测定是有限的。
在这项研究中，我们描述了使用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）作为 体外 模型的EC转吞测定，以确定iBRB通透性和EC转吞作用。该测定依赖于HRMEC分别通过受体介导或洞穴依赖性转吞途径转运转铁蛋白或HRP的能力（图2）。将培养至在顶室（即滤芯）中完全汇合的HRMEC与荧光偶联转铁蛋白（Cy3-Tf）或HRP一起孵育，以测量对应于仅通过EC转吞作用转移到底室的转铁蛋白或HRP水平的荧光强度。通过测量TEER可以确认细胞单层的汇合度，表明紧密的连接完整性25。为了证明TEER和转胞测定技术，使用了已知的血管通透性和EC转吞作用的分子调节剂，包括血管内皮生长因子（VEGF）28 和Wnt信号传导（Wnt配体：Wnt3a和Norrin）29。
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Protocol
所有动物实验均由波士顿儿童医院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，用于生成光学显微镜和EM图像（图3）。 体内 研究的方案可以从Wang等人那里获得24。所有涉及人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）的实验均获得波士顿儿童医院机构生物安全委员会（IBC）的批准。
1. 试剂的制备
- 用于包衣组织培养皿的溶液：通过将 1 mL 明胶储备溶液 （40%-50%） 溶解在 500 mL 无菌组织培养级 1x PBS （pH = 7.4） 中来制备 0.1% 明胶溶液。通过0.22μm过滤器过滤溶液。将0.1%明胶溶液储存在2-8°C。 它可以在无菌条件下在所述温度下无限期地储存。
- 生长培养基：根据制造商的说明（材料表），通过将 EGM 补充剂溶解到内皮细胞生长基础培养基 （EBM） 中，制备 500 mL 内皮细胞生长完全培养基 （EGM）。将生长培养基分装到50mL管中，并将管储存在4°C。 生长培养基的保质期在4°C下为12个月。
- 胰蛋白酶溶液：对于0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，将储备小瓶中的试样等分到50mL管中，并储存在4°C（最多2周）或-20°C（长达24个月）。
2. 培养HRMEC
- 初始细胞培养
- 在层流罩下用5mL的0.1%明胶溶液涂覆细胞培养培养皿（直径100mmx 20mm高度），并在室温（RT）下将它们在罩中不受干扰30分钟以获得均匀的涂层。
注意：培养皿的明胶涂层可增强细胞附着。或者，也可以使用明胶包衣的T75培养瓶。 - 在接种细胞之前，使用真空泵吸出明胶溶液。所用吸气器的真空压力高达 724 mmHg。
注意：吸液必须在接种细胞之前立即进行，以防止涂层溶液变干。 - 通过使用37°C的水浴或向小瓶中加入温热的生长培养基来解冻冷冻的HRMECs（来自液氮储存）。解冻后，将细胞悬液转移到 9 mL 生长培养基中（假设解冻的 HRMEC 小瓶为 1 mL）。
注：HRMEC是商业获得的（材料表）。添加到细胞中的生长培养基在使用前应始终预热至37°C。 - 在室温下以200× g 旋转细胞5分钟，并小心吸出上清液以避免去除细胞沉淀。
- 将细胞沉淀重悬于10mL生长培养基中，并将所得悬浮液转移到明胶包被的培养皿上。将细胞保持在37°C和5%CO2的培养箱中。通常，HRMEC在72小时后融合70%-80%。
注意：生长培养基每隔一天更换一次。
- 在层流罩下用5mL的0.1%明胶溶液涂覆细胞培养培养皿（直径100mmx 20mm高度），并在室温（RT）下将它们在罩中不受干扰30分钟以获得均匀的涂层。
- HRMEC在渗透膜插入物上的传代培养
- 准备细胞培养过滤器插入物（6.5 mm插入物，具有0.4μm孔径聚碳酸酯膜，放置在24孔板中），通过在层流罩下用200μL0.1%明胶溶液涂覆每个插入物（顶端室）30分钟来接种HRMEC。确保溶液覆盖过滤器插件的整个底面。
注意：每个孔都有一个由多孔膜隔开的顶端和基底外侧室。 - 从培养箱中取出带有培养的HRMEC（步骤2.1.5）的培养皿并吸出生长培养基。在层流罩下用 10 mL 的 1x PBS 轻轻冲洗细胞 2 倍，以去除潜在的漂浮/死细胞。
- 用0.5-1mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液解离细胞，并将培养皿置于培养箱（37°C和5%CO2）中5分钟。
- 通过加入 4.5-9 mL 生长培养基淬灭胰蛋白酶活性，并使用 10 mL 移液器将细胞悬液转移到 15 mL 管中。
- 在室温下以200× g 旋转细胞5分钟，小心地除去上清液，并将沉淀重悬于3mL生长培养基中。
- 使用手动血细胞计数器或自动细胞计数器和种子计数细胞数，密度为4 x 10 每个过滤器插入物4个细胞（即1.25 x 105个细胞/ cm2）。每个插入片段的细胞悬液体积为 250 μL。
- 从含有渗透性插入物的孔中吸出涂层溶液，每个插入物（顶端室）转移 250 μL 细胞悬液。仅将培养基（即没有细胞）添加到其中一个插入物中，该插入物将用作TEER测量的“空白对照”。同时，在基底外侧室中每孔加入 750 μL 培养基。
- 将带有渗透性插入物的24孔板在培养箱（37°C和5%CO2）中保持7-12天，直到培养的细胞完全汇合并达到所需的TEER值~20 Ω·cm2 。
- 每隔一天更换一次生长培养基。在更换培养基期间，小心吸出培养基以最大程度地减少细胞单层的破坏，并分别向顶端和基底外侧室中每孔添加 250 μL 和 750 μL 新鲜培养基。
注意：孔的顶端和基底外侧室均更换生长培养基。
- 准备细胞培养过滤器插入物（6.5 mm插入物，具有0.4μm孔径聚碳酸酯膜，放置在24孔板中），通过在层流罩下用200μL0.1%明胶溶液涂覆每个插入物（顶端室）30分钟来接种HRMEC。确保溶液覆盖过滤器插件的整个底面。
3. TEER 测量（图 4）
- 在细胞接种后第14天（步骤2.2.9.），使用上皮伏欧姆表（EVOM）电阻（ER）系统（材料表）测量HRMEC的TEER，如下所示。
- 对 ER 系统进行预充电，并使用 STX04 测试电极检查仪表功能。如果需要，请校准。
- 将电极连接到仪表并通过首先将其浸泡在70%乙醇中15-20分钟，然后将其短暂浸入细胞培养EGM生长培养基中来平衡电极。
- 同时，将含有细胞的24孔板保持在室温的层流罩中15-20分钟以进行温度平衡。
注意：TEER 测量受温度影响，因此平衡步骤至关重要。 - 对于TEER测量，将新鲜生长培养基添加到孔的顶端（250μL）和基底外侧（750μL）室中。
- 通过小心地浸入电极进行TEER测量，使较短的尖端在插入物中，较长的尖端接触孔的底部。首先测量空白控件上的电阻。对于每个插入物，一式三份测量TEER。
注意：为了在测量之间冲洗电极，使用培养基。确保电极与插件底部成 90° 角，以获得稳定的读数。 - 使用公式计算单层上的电阻（单位为 Ω·cm 2），TEER = 净电阻 （Ω） x 滤芯表面积 （cm2）;在这里，净电阻是每个孔（带细胞的生长培养基）和空白孔（仅生长培养基）的电阻之间的差异。
- 仅在TEER值达到~20 Ω·cm2后对细胞进行进一步处理。如果未达到所需的TEER水平，请将板保存在培养箱中，并在第二天测量TEER。
注意：HRMEC汇合性也可以通过具有典型鹅卵石形态的细胞形状形态学检查（在显微镜下）和/或通过单独免疫组织化学染色的细胞连接蛋白的存在来验证。
4. 转吞试验
- 使用Cy3标记的转铁蛋白进行Clathrin介导 的体外 转吞试验（图5）
- 在达到TEER值约20 Ω·cm 2的汇合时，血清在37°C和5%CO2下在EBM（血清还原培养基）中使用0.5%FBS在两个腔室（顶端室：250μL和基底外侧室：750μL）中剥夺细胞24小时，然后再用配体处理。在整个测定过程中使用血清减少的EBM。
- 将细胞（使用步骤4.1.1中的血清还原培养基）在顶端室中与荧光（花青3）标记的转铁蛋白配体（Cy3-Tf）（终浓度为40μg/ mL）在37°C下孵育60分钟。
注意：含有Cy3-Tf的板应避光，以避免Cy3-Tf的光漂白，方法是将铝箔包裹在铝箔中，并在关灯的细胞培养罩中进行实验。 - 1小时后，将板放在冰上，并在室温下用血清还原培养基顶端和基底外侧洗涤单层4x（每次洗涤3-5分钟），以除去游离的未结合Cy3-Tf。
注意：洗涤对于去除游离示踪分子并准确读取转吞作用至关重要，而不会从细胞旁途径泄漏。 - 将新鲜血清还原培养基（如步骤4.1.1.1）加入到含有细胞的彻底洗涤的过滤器插入物中，并将插入物转移到含有预热血清还原培养基的24孔板的新鲜孔中。
- 将细胞在培养箱（37°C和5%CO2）中再孵育90分钟，然后从基底外侧室收集培养基。
- 使用荧光检测器记录来自基底外侧室的溶液的荧光强度。以相对荧光单位（RFU）测量的荧光强度水平表示通过网格蛋白依赖性转吞作用跨HRMEC单层的Cy3-Tf复合物的量。
- 使用HRP进行洞穴介导 的体外 转吞试验（图6）
- 在TEER值达到约20 Ω·cm 2的完全汇合时，在处理前使用含0.5%FBS的EBM培养基（血清还原培养基）在37°C和5%CO2下剥夺细胞24小时（如步骤4.1.1）。在整个测定过程中使用血清还原EBM培养基。
- 用所需的处理和载体对照处理顶端室中的细胞。
注意：在这里，我们使用Wnt调节剂作为示例来证明HRMEC中Wnt信号通路对洞穴介导的转吞作用的调节：人重组Norrin和Wnt抑制剂XAV939。在典型的实验中，将细胞在培养箱（37°C和5%CO2）中处理24小时，浓度如下：诺林（125ng / mL），诺林（125ng / mL）+ XAV939（10μM）和载体对照溶液。此外，还使用了Wnt3a条件培养基（由L Wnt-3A细胞产生）。 - 将细胞在顶端室中用HRP（5mg / mL）在37°C孵育15分钟。
- 之后，将24孔板放在冰上，并用P缓冲液（10mM HEPES pH = 7.4，1mM丙酮酸钠，10mM葡萄糖，3mM CaCl2，145mM NaCl）密集洗涤顶端和基底外侧室6x，以去除游离细胞外HRP。
注意：洗涤对于去除游离示踪分子并准确读取转吞作用至关重要，而不会从细胞旁途径泄漏。 - 向顶室中加入新鲜的血清还原培养基（如步骤4.1.1.），并将插入物转移到含有预热培养基的新鲜孔中。
- 将单层在培养箱中在37°C和5%CO2 下再孵育90分钟，然后从基底外侧室收集培养基。
- 按照制造商的说明向收集的培养基中加入 100 μL HRP 荧光过氧化物酶底物（材料表），并在室温下孵育 10 分钟，然后用 100 μL 停止溶液停止反应。
- 使用荧光酶标仪检测培养基中HRP底物反应产物的水平。测量 420 nm 发射波长（325 nm 激发）和相对荧光单位 （RFU） 下的荧光强度。这些值表示通过洞穴介导的转吞作用跨HRMEC层的HRP转胞水平。
注意：此处使用的荧光产品（材料表）不进行光漂白。不需要光保护以防止光漂白。
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Representative Results
视网膜血管内皮的EM图像显示体内内皮细胞中的转细胞囊泡转运和海绵囊泡。
EC转吞可以在体内视网膜横截面内可视化，深棕色沉淀物在光学显微镜下反射含HRP的血管（图3A），并使用透射电子显微镜（TEM）作为指示含HRP的跨胞细胞囊泡的电子致密沉淀物（图3B，C），从而证明EC在iBRB上的转吞作用。大囊泡可能反映巨胞增多症（白色箭头;图3B），小囊泡可能代表洞穴囊泡（白色箭头;图 3C）。此外，视网膜血管中洞穴的定位可以看作是洞穴标志物CAV-1抗体与血管中异凝集素（EC标志物）在荧光显微镜下的共染色（图3D）。在透射电镜下通过免疫金标记的CAV-1抗体（黑点;图3E）在视网膜血管内皮细胞内。体内研究的方案可以从Wang等人那里获得24。
VEGF治疗通过经内皮电阻（TEER）测量，增加HRMEC的血管通透性
在进行EC转吞测定之前，应将HRMEC培养至完全汇合，显示出特征性的鹅卵石形态，可以在光学显微镜下观察到。全细胞融合度可以通过跨内皮电阻（TEER）测量（图4A）来验证，对于汇合的HRMEC 30，读数达到~20 Ω·cm2，表明通过紧密或间隙连接穿过单层的细胞旁转运水平较低。以血管内皮生长因子（VEGF）为例，证明TEER测量。用VEGF处理HRMEC显着降低了TEER水平，反映了HRMEC渗透率的增加（图4B）。在对照细胞中也观察到TEER值降低，可能是由于培养的持续时间和在不同时间间隔进行的多次测量可能对细胞31有害。
Cy3-转铁蛋白的转运可用于评估 HRMEC 中网格蛋白介导的 EC 转胞作用
对于网格蛋白介导的EC转吞作用，将培养在多孔膜上的汇合HRMEC与荧光（Cy3）标记的转铁蛋白一起孵育，以检测其在EC中的转运（图5A）。该测定利用了转铁蛋白的运输是受体介导的转吞过程的事实。在与核染色剂DAPI（蓝色）共染色的HRMEC单层中观察到Cy3-转铁蛋白内吞作用（红色）（图5B），确认其被细胞吸收。（Cy3）标记的转铁蛋白的荧光强度可以从图像中量化以评估内吞过程和/或从孔的基底外侧室收集的培养基中测量以量化网格蛋白介导的转吞作用的水平27。
Wnt信号通路在基于HRP的测定中调节洞穴介导的跨HRMEC的EC转吞作用
以前，已经发现Wnt信号调节MFSD2A依赖性洞穴介导的跨视网膜血管EC的转吞作用以维持iBRB24。在基于HRP的 体外 转吞测定中评估Wnt调节剂的效果（图6A）。用Wnt通路激活剂处理完全融合的HRMEC：Wnt3a条件培养基（Wnt3a-CM）或人重组Norrin，有或没有Wnt/β-连环蛋白信号抑制剂XAV939，并检测HRMEC的转胞HRP水平。用Wnt3a-CM或Norrin治疗显示转胞HRP水平显着降低，表明洞穴转吞减少。此外，与Wnt信号抑制剂XAV939的联合治疗显示HRMECs中转胞HRP水平上调，从而消除了Wnt激活剂对HRMEC通透性的影响（图6B，C）24。
图1：通过视网膜血管内皮的不同运输途径。示意图显示了通过视网膜微血管内皮细胞 （RMEC） 的不同分子通量路线。通过内部血视网膜屏障内的视网膜血管内皮细胞的运输通过两条主要途径进行：细胞旁和跨细胞途径，包括转吞作用。该图经Yemanyi等人5许可改编。请点击此处查看此图的大图。
图2：跨内皮细胞的转核细胞囊泡转运途径概述及其各自的 体外 评估。 在内皮细胞 （EC） 中，大分子的跨细胞易位通过三种主要类型的囊泡发生：洞穴囊泡 （50-100 nm）、网格蛋白包被的囊泡 （70-150 nm） 或网格蛋白非依赖性巨松体 （200-500 nm）。洞穴是质膜中烧瓶形，球形，富含脂质的微域，由洞穴蛋白和洞穴组成。通过这些囊泡的转吞水平可以通过EC培养中基于荧光的体 外 测定来确定，使用辣根过氧化物酶（HRP）结合荧光底物，荧光标记的转铁蛋白（Cy3-Tf）或四甲基罗丹明标记的牛血清白蛋白（TMR-BSA）分别用于洞穴介导的转吞作用，网格蛋白介导的转吞作用和巨胞作用，以评估内部血视网膜屏障（iBRB）通透性。虽然每种途径都有不同的特征和转运机制，但可能发生重叠的功能和物质转运，特别是在洞穴转运和巨胞作用之间，两者都是网格蛋白非依赖性的。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：视网膜中 EC 转吞作用的可视化。 （A）光学显微镜图像显示来自3个月大的野生型（WT）小鼠视网膜切片的HRP填充血管腔，用3，3'-二氨基联苯胺（DAB）（黑色）染色。在WT小鼠中眶后注射HRP，然后进行眼部隔离和组织包埋。用电子致密DAB底物对薄切片进行染色，以比色检测HRP作为深棕色沉淀物，并在光学显微镜下成像以揭示视网膜血管腔内的HRP。（乙，丙）然后用透射电子显微镜（TEM）超薄切片进一步处理样品，以可视化含HRP的转胞囊泡，描绘iBRB中的EC转吞作用。TEM图像显示3个月大的WT小鼠的视网膜切片，其血管腔充满HRP和RMEC内含有HRP的囊泡。（B）偶尔的大囊泡可能反映EC内的巨体（箭头），管腔侧存在红细胞（星号）。（C）小囊泡可能是洞穴囊泡（箭头）。（D）CAV-1抗体（绿色）和异凝集素B 4（IB4，红色，EC标志物）的免疫组织化学共染色表明CAV-1在3个月大的WT小鼠视网膜（DAPI，蓝色）的视网膜血管中定位。（E）视网膜EC内免疫金标记CAV-1（黑点，箭头）的TEM图像;插图显示了 CAV-1 阳性洞穴囊泡的放大图像。缩写：HRP = 辣根过氧化物酶;GCL = 神经节细胞层;IPL = 内部丛状层;INL = 内核层;OPL = 外层丛状层;ONL = 外核层;RPE = 视网膜色素上皮;E = 内皮细胞;和 L = 血管腔。放大倍率：（A、D）20倍。比例尺：（A） 50 μm、（B） 2 μm、（D） 100 μm 和 （C，E） 200 nm。图（E）经王等人许可改编24。请点击此处查看此图的大图。
图 4：VEGF 处理后 HRMEC 中完全融合的 HRMEC 和血管通透性增加的验证 。 （A） 示意图显示了电极在孔的顶端和基底外侧室中的位置，用于经内皮电阻 （TEER） 测量，以评估细胞单层的血管通透性和完整性。（B）显示完全融合的HRMEC的TEER记录，有和没有血管内皮生长因子（VEGF）的先前治疗。18小时（18小时）后用VEGF处理导致完全融合的HRMEC中TEER降低31。 第 ≤0.001 页。图（B）经富田等人许可改编31。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用转铁蛋白 （Tf） 在 HRMEC 中进行网格蛋白介导的 EC 转胞作用测定的示意图。 （A）HRMEC在明胶包被的插入物上生长至完全汇合，并在测定前在37°C下饥饿过夜。将细胞与荧光Cy3偶联转铁蛋白（Cy3-Tf）在37°C下顶端孵育60分钟。 孵育后，用新鲜培养基密集洗涤细胞以去除未结合的细胞外Cy3-Tf。然后将含有新鲜培养基的插入物转移到基底外侧室中含有温热培养基的新板中，并将细胞在37°C下再孵育90分钟以释放内吞的Cy3-Tf。可以收集来自基底外侧室的培养基，并且可以使用荧光板读数器测量对应于网格蛋白依赖性（Cy3-Tf）EC转吞作用的荧光强度。（B）在用DAPI（蓝色）染色的HRMEC中观察到Cy3-转铁蛋白（红色），确认内吞作用。请点击此处查看此图的大图。
图 6：Wnt 信号在体外基于 HRP 的测定中调节洞穴介导的 HRMEC 转吞作用。 （A）示意图，展示了基于HRP的测定以评估洞穴介导的转吞作用。在明胶包被的插入物上培养的完全融合的HRMECs在处理前在37°C的0.5%胎牛血清（FBS）+ EBM培养基中血清饥饿过夜。将顶端室中的EC单层在37°C下用所需的处理处理24小时。 之后，将细胞与辣根过氧化物酶（HRP）在37°C孵育15分钟并密集洗涤以除去游离的细胞外HRP。然后将含有新鲜培养基的插入物转移到基底外侧室中含有温培养基的新板中，并将细胞在37°C下再孵育90分钟。 收集基底外侧室培养基，与荧光过氧化物酶底物反应定量HRP水平。使用荧光酶标仪测量对应于洞穴介导的EC转吞作用的荧光。（乙，丙）在该示例中，用Wnt通路调节剂处理细胞：Wnt3a条件培养基（Wnt3a-CM）或其对照条件培养基（Ctrl-CM），人重组Norrin或其对照溶液（Ctrl），以及有或没有Wnt/β-catenin信号抑制剂（XAV939）或其载体对照（载体）。在基于HRP的测定中评估了它们对HRMEC洞穴转吞作用的影响。治疗后，测量转移到基底外侧室的HRP水平，表明洞穴介导的EC转吞水平在HRMEC中。Wnt激活剂降低了基于HRP的转吞作用水平，XAV939逆转了转胞作用。* ≤0.05， ** ≤0.01.图（B）和（C）经Wang等人许可改编24。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
BRB在视网膜健康和疾病中起着至关重要的作用。评估血管通透性的体外技术已被证明是屏障（BRB/BBB）发育和功能研究中的关键工具。这里描述的程序可用于研究EC转吞作用的分子机制或评估影响BRB通透性的相关分子调节剂。体外EC转吞测定与体内测定或用于评估血管通透性的技术相比具有多种优势。它们以高通量快速执行，可用于分析具有遗传和药理调节的特定信号通路的许多不同变量或分离分子的影响。纯EC培养系统消除了体内经常观察到的动物变异，并且还限制了其他细胞类型对靶分子的可能修饰或内吞作用的影响32。HRMEC细胞的处理很容易，需要大多数实验室提供的基本细胞培养设备，并且与体内动物实验相比，细胞培养通常更具成本效益。尽管体外转吞测定不能完全复制体内生理条件33，但它们可以成为补充体内研究和提高我们对BRB控制知识的宝贵工具。
需要考虑几个重要的技术参数，包括过滤器插件的孔径、基质类型和细胞接种密度。渗透过滤器插件的较大孔径可能导致插入物底部细胞的不良迁移和生长，从而混淆结果测量及其解释。虽然这种倾向可能因不同的细胞类型而异，但孔径 ≤1 μm 适用于大多数细胞类型，包括 EC34。选择合适的基质是第二个关键步骤，因为当在多孔基质上生长并在两侧沐浴在培养基中时，一些细胞表现出更高的极性和更大的分化35，36。经过处理的微孔聚碳酸酯过滤器是EC的更好替代品，因为它们更薄，并且试剂可以更好地进入单层的基底外侧区域，并且对于免疫测定的背景荧光最小35。最后，为了实现完全融合的单层，必须根据特定的细胞类型优化细胞接种密度。虽然太低的接种密度可能会影响分化状态，但另一方面，过高的接种密度可能有利于快速附着形成多个细胞层而不是单层细胞层的细胞，最终改变细胞形态并导致转吞测量不准确37。
EC单层的形成和完整性对于该测定至关重要，可以通过测量TEER值来验证，以确保达到所需的TEER。应始终包括空白对照，即没有细胞的过滤器插入物，以测量要从细胞插入物中减去的渗透膜上的基础电阻水平。温度、细胞传代数、培养基组成、培养持续时间和连接长度变化等各种因素都可能导致TEER值25，38，39的微小变化。TEER值也受到某些处理（例如VEGF）的极大影响。VEGF最初被发现是血管通透性的有效诱导剂40，通过调节细胞旁转运来影响血管通透性，即通过紧密连接蛋白ZO-1，occludin的磷酸化和紧密连接蛋白claudin-5的破坏41，42以及跨细胞运输43.单层形成的额外验证可以通过形态学检查和染色特征连接蛋白的存在来完成。在整个培养过程中，建议定期更换顶端和基底外侧室中的培养基，以使细胞保持最佳培养条件，具有理想的pH范围和营养可用性。
使用该测定方法的研究人员应注意大脑和视网膜EC的关键固有特征：顶基底极性，这是BBB44 和BRB的细胞标志。转吞作用的方向由感兴趣的蛋白质靶受体的相对分布以及EC膜的顶端/管腔与基底外侧/钝光结构域中的相关转吞机制决定。脑和视网膜EC能够从顶端/管腔和基底外侧/铝膜释放许多因子44。有趣的是，转铁蛋白的Clathrin依赖性转吞作用似乎主要从血液侧单向发生到大脑或视网膜，因为转铁蛋白受体主要位于顶端/管腔膜上45。另一方面，洞穴转吞作用是双向发生的，可以起源于顶端/管腔或基底外侧/钝膜，并穿过另一侧，具体取决于囊泡货物及其受体的定位46。MFSD2A是一种跨膜脂质受体（用于ω-3脂肪酸二十二碳六烯酸）和洞穴转吞作用的抑制因子，也位于ECs 23，47的顶端/腔域。MFSD2A的表达由Wnt信号传导转录调节以介导其对BRB控制的影响，如本协议24中的一个例子所示。因此，这里描述的技术涉及检测在EC单层摄取后放置在上部/顶端腔上的示踪剂分子并释放到底部/基底外侧室中，模拟顶端/腔/血向基底外侧/铝/组织方向的转吞作用。通过将示踪分子放置在底室中并监测摄取和释放到顶室中，可以修改该协议以检测相反方向的转吞作用，以满足研究人员的需要。此外，如果需要，确定内吞化示踪剂结合靶分子的细胞内积累/降解的额外步骤将进一步测量细胞质中残留的转胞囊泡32。
所描述的测定具有许多优点，可作为BRB / BBB相关研究中的基本工具，但存在一些局限性。它是一个孤立的系统，没有来自iBRB其他细胞类型（如周细胞和神经胶质细胞）的相互作用，因此不能完全模拟生理 体内 环境。由于温度或电极位置的变化，TEER 值可以在测量之间变化25，38。然而，在测量前将电池从37°C平衡到室温，小心处理电极，包括空白对照有助于最大限度地减少波动。此外，即使充分洗涤，也不能完全排除细胞旁途径的泄漏，尽管是微量的。不同转吞途径之间的HRP转运重叠，例如，洞穴转运和巨胞增多症之间，两者都是网格蛋白非依赖性的。根据需要，可以使用洞穴和微胞细胞增多症的特异性调节剂和/或抑制剂进一步研究鉴别。
总之，本文描述了一种 体外 转吞测定，允许定量BRB / BBB中洞穴或载体介导的转吞作用。 体外 测定对筛选与BRB / BBB控制相关的各种促/抗血管生成分子31，信号通路调节剂24或药物递送系统27，48 有很大帮助。EC极性和定向转胞作用的研究也可以从这种易于使用的系统中受益。考虑到用于iBRB和眼部研究的 体外 模型的可用性有限，此处概述的程序也可以与周细胞，星形胶质细胞和3-D器官型培养物49一起修改为共培养系统，或使用先进的基于细胞的模型，如微生理神经血管系统50，以进一步研究细胞相互作用并更好地模拟 体内生理条件。
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Disclosures
作者没有利益冲突或经济利益需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH对JC的资助（R01 EY028100，EY024963和EY031765）。ZW得到了圣殿骑士之眼基金会职业入门补助金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
| Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
| Light microscope | Leica | DMi1 | |
| Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
| Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |
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