Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kardiotoksicitetsscreening med høj kapacitet ved hjælp af modne humane inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytmonolag

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64364
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

Summary

Human induceret pluripotent stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) tilbyder et alternativ til at bruge dyr til præklinisk kardiotoksicitetsscreening. En begrænsning for den udbredte anvendelse af hiPSC-CM'er i præklinisk toksicitetsscreening er cellernes umodne, føtallignende fænotype. Her præsenteres protokoller for robust og hurtig modning af hiPSC-CM'er.

Abstract

Human inducerede stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) anvendes til at erstatte og reducere afhængigheden af dyr og dyreceller til præklinisk kardiotoksicitetstestning. I todimensionelle monolagsformater rekapitulerer hiPSC-CM'er strukturen og funktionen af de voksne menneskelige hjertemuskelceller, når de dyrkes på en optimal ekstracellulær matrix (ECM). En human perinatal stamcelleafledt ECM (modningsinducerende ekstracellulær matrix-MECM) modner hiPSC-CM-strukturen, funktionen og metabolisk tilstand på 7 dage efter plettering.

Modne hiPSC-CM-monolag reagerer også som forventet på klinisk relevante lægemidler med en kendt risiko for at forårsage arytmier og kardiotoksicitet. Modningen af hiPSC-CM-monolag var en hindring for den udbredte anvendelse af disse værdifulde celler til lovgivningsmæssig videnskab og sikkerhedsscreening indtil nu. Denne artikel præsenterer validerede metoder til plettering, modning og funktionel fænotypning med høj kapacitet af hiPSC-CM elektrofysiologisk og kontraktil funktion. Disse metoder gælder for kommercielt tilgængelige oprensede kardiomyocytter samt stamcelleafledte kardiomyocytter, der genereres internt ved hjælp af meget effektive, kammerspecifikke differentieringsprotokoller.

Elektrofysiologisk funktion med høj kapacitet måles ved hjælp af enten spændingsfølsomme farvestoffer (VSD'er; emission: 488 nm), calciumfølsomme fluoroforer (CSF'er) eller genetisk kodede calciumsensorer (GCaMP6). En optisk kortlægningsenhed med høj kapacitet bruges til optiske optagelser af hver funktionel parameter, og brugerdefineret dedikeret software bruges til elektrofysiologisk dataanalyse. MECM-protokoller anvendes til medicinscreening ved hjælp af en positiv inotrop (isoprenalin) og human Ether-a-go-go-related gene (hERG) kanalspecifikke blokkere. Disse ressourcer vil gøre det muligt for andre efterforskere med succes at udnytte modne hiPSC-CM'er til screening med høj gennemstrømning, præklinisk kardiotoksicitet, hjertemedicineffektivitetstest og kardiovaskulær forskning.

Introduction

Human induceret pluripotent stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) er blevet valideret på internationalt plan og er tilgængelige til in vitro kardiotoksicitetsscreening1. Meget rene hiPSC-CM'er kan genereres i næsten ubegrænset antal, kryopræserveres og optøes. Efter genplettering genoplives de også og begynder at trække sig sammen med en rytme, der minder om det menneskelige hjerte 2,3. Bemærkelsesværdigt parrer individuelle hiPSC-CM'er sig til hinanden og danner funktionel syncytia, der slår som et enkelt væv. I dag er hiPSC'er rutinemæssigt afledt af patientens blodprøver, så enhver person kan repræsenteres ved hjælp af in vitro hiPSC-CM kardiotoksicitetsscreeningsassays 4,5. Dette skaber mulighed for at udføre "kliniske forsøg i en skål" med betydelig repræsentation fra forskellige populationer6.

En kritisk fordel i forhold til eksisterende dyre- og dyrecellekardiotoksicitetsscreeningsmetoder er, at hiPSC-CM'er udnytter det fulde humane genom og tilbyder et in vitro-system med genetiske ligheder med det menneskelige hjerte. Dette er især attraktivt for farmakogenomik og personlig medicin - brugen af hiPSC-CM'er til medicin og anden terapiudvikling forventes at give mere nøjagtige, præcise og sikre medicinrecepter. Faktisk har todimensionelle (2D) hiPSC-CM monolagsanalyser vist sig at være prædiktive for medicinsk kardiotoksicitet ved hjælp af et panel af klinisk anvendte lægemidler med en kendt risiko for at forårsage arytmier 1,7,8,9. På trods af det enorme potentiale i hiPSC-CM'er og løftet om at strømline og gøre lægemiddeludvikling billigere, har der været en modvilje mod at bruge disse nye assays10,11,12.

Indtil nu er en væsentlig begrænsning af udbredt vedtagelse og accept af hiPSC-CM-screeningsassays deres umodne, fosterlignende udseende såvel som deres funktion. Det kritiske spørgsmål om hiPSC-CM-modning er blevet gennemgået og debatteret i den videnskabelige litteratur ad nauseum13,14,15,16. Ligeledes er der anvendt mange tilgange til at fremme hiPSC-CM-modning, herunder ekstracellulær matrix (ECM) manipulationer i 2D-monolag og udvikling af 3D-manipulerede hjertevæv (EHT'er)17,18. I øjeblikket er der en udbredt tro på, at brugen af 3D EHT'er vil give overlegen modning i forhold til 2D-monolagsbaserede tilgange. Imidlertid giver 2D-monolag en højere effektivitet af celleudnyttelse og øget succes med plettering sammenlignet med 3D EHT'er; 3D EHT'er bruger et større antal celler og kræver ofte inkludering af andre celletyper, der kan forvirre resultaterne. Derfor er fokus i denne artikel på at bruge en simpel metode til at modne hiPSC-CM'er dyrket som 2D-monolag af elektrisk og mekanisk koblede celler.

Avanceret hiPSC-CM-modning kan opnås i 2D-monolag ved hjælp af en ECM. 2D-monolagene af hiPSC-CM'er kan modnes ved hjælp af en blød, fleksibel polydimethylsiloxan-coverslip, belagt med kældermembranmatrix udskilt af en Engelbreth-Holm-Swarm-musesarkomcelle (muse-ECM). I 2016 viste rapporter, at hiPSC-CM'er dyrket på denne bløde ECM-tilstand modnes funktionelt og viser aktionspotentielle ledningshastigheder nær voksne hjerteværdier (~ 50 cm / s)18. Desuden viste disse modne hiPSC-CM'er mange andre elektrofysiologiske egenskaber, der minder om det voksne hjerte, herunder hyperpolariseret hvilemembranpotentiale og ekspression af Kir2.1. For nylig identificerede rapporter en human perinatal stamcelleafledt ECM-belægning, der fremmer strukturel modning af 2D hiPSC-CM'er19. Her præsenteres brugervenlige metoder til strukturelt modne 2D hiPSC-CM-monolag til brug i elektrofysiologiske skærme med høj kapacitet. Desuden leverer vi validering af et optisk kortlægningsinstrument til automatiseret erhvervelse og analyse af 2D hiPSC-CM monolags elektrofysiologisk funktion ved hjælp af spændingsfølsomme farvestoffer (VSD'er) og calciumfølsomme sonder og proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hiPSC-brug i denne protokol blev godkendt af University of Michigan HPSCRO Committee (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Se materialetabellen for en liste over materialer og udstyr. Se tabel 1 for medier og deres sammensætning.

1. Optøning og plettering kommercielt tilgængelige kryopræserverede hiPSC-CM'er til modning på en modningsinducerende ekstracellulær matrix (MECM)

  1. Alle reagenserne opvarmes til stuetemperatur, og MECM-pladerne rehydreres med Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) eller fosfatbufferet saltvand (PBS) indeholdende calcium og magnesium i 1 time før kardiomyocytbelægning (200 μL buffer pr. hul i en plade med 96 huller).
  2. MECM-pladerne vaskes 2x med HBSS eller PBS indeholdende calcium og magnesium i 1 time før kardiomyocytbelægning (200 μL buffer pr. hul i en plade med 96 huller), og hullerne holdes hydreret.
  3. Forbered et 37 °C vandbad.
  4. Fjern kardiomyocytrørene fra væskenitrogentanken, overfør rørene til tøris, og åbn rørhætterne let for at frigøre tryk.
    BEMÆRK: Det er ekstremt vigtigt at frigive tryk i rørene! Hvis der opbygges for meget tryk inde i rørene, kan de eksplodere.
  5. Forsegl rørhætterne igen, og læg dem i vandbadet for at tø op i 4 minutter.
    BEMÆRK: Lad dem tø helt op for at undgå celleskader på grund af delvis optøning.
  6. Når cellerne er optøet, sprøjtes rørene med 70% ethanol inden åbning. Overfør cellerne til 15 ml koniske rør med en 1 ml pipette. Dryp langsomt 8 ml pletteringsmedium, omrør røret hver gang 1 ml tilsættes, for at give cellerne mulighed for at tilpasse sig ændringer i osmolaritet.
    1. Kryovialen vaskes med 1 ml belægningsmedium med en 1 ml glaspipette. Dryp derefter langsomt vasken ned i det 15 ml koniske rør.
  7. Centrifuger glassene ved ~300 × g i 5 min. Supernatanten suges til syn, og pelletpen opslæmmes igen i 1 ml pletteringsmedium. Fjern en delprøve og udfør levende celletælling med et hæmocytometer. Der tilsættes yderligere pletteringsmedium for at opnå 7,5 × 105 celler/ml.
    BEMÆRK: Der kræves ca. 10 ml cellesuspension for at forberede 96 huller.
  8. Der dispenseres 100 μL cellesuspension pr. hul i en MECM-belagt plade med 96 brønde ved hjælp af en multikanalpipette.
    BEMÆRK: Sørg for at undgå celleudfældning og opnå ensartet celletæthed i alle brønde under plettering.
  9. Cellerne inkuberes ved 37 °C, 5 % CO 2 i2 dage, før substratet skiftes til vedligeholdelsesmedium (200 μL/hul). Skift vedligeholdelsesmediet på dag 5 efter optøning. Udfør EP-analyser på dag 7 eller senere, som beskrevet tidligere8,9. Skift mediet hver anden dag, når du vælger at udvide cellekulturen.

2. hiPSC hjerterettet differentiering og hiPSC-CM oprensning

  1. Varm 1x kommercielt tilgængelig ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløsning, HBSS uden calcium og magnesium (HBSS--) og 6-brøndsplader belagt med opløselig kældermembranmatrix udskilt af en Engelbreth-Holm-Swarm musesarkomcelle (muse-ECM) til stuetemperatur.
  2. De differentierede kolonier markeres ved fasekontrastmikroskopi og aspirat / ablat. Hvert hul vaskes med 1 ml HBSS--. Udfør to vaske i brønde indeholdende >10 differentieringspletter.
  3. Opsug HBSS - og tilsæt 1 ml EDTA-opløsning til hver brønd. Pladerne inkuberes i op til 5 minutter ved 37 °C. Kontroller pladerne efter 3 minutter og se efter gennemskinnelige hvide, synlige kolonier.
  4. Opsug EDTA-opløsningen, og tilsæt 1 ml til et enkelt hul. Cellerne løsnes med 2 ml hiPSC-substrat ved at pipettere suspensionen op og ned gentagne gange ved hjælp af en 10 ml glaspipette til at løsne alle stamceller fra brønden og overføre cellesuspensionen til et opsamlingsrør. Gentag aspirationen og løsriv med efterfølgende brønde.
    BEMÆRK: Fjern kolonier, der er svære at løfte, med spidsen af glaspipetten.
  5. Tæl stamcellerne og juster volumen til plade 8,0 × 105 celler / brønd. Dyrk cellerne på hiPSC-medium (2 ml / brønd), indtil stamcellerne når 90% sammenløb (denne gang kaldes fra nu af D0).
  6. Der fremstilles 2 ml basaldifferentieringsmedium suppleret med 4 μM CHIR99021.
  7. På D0 vaskes hvert hul i en 6-brønds plade stamceller med 1 ml HBSS pr. hul. HBSS erstattes med basaldifferentieringsmedium suppleret med 4 μM CHIR99021.
  8. På D1 skal du ikke gøre noget.
  9. På D2 fremstilles basaldifferentieringsmedium suppleret med 4 μM IWP4.
  10. Udskift mediet med 2 ml IWP4-suppleret basaldifferentieringsmedium pr. hul.
  11. På D3 skal du ikke gøre noget for en ventrikelspecifik differentiering. For en atriespecifik differentiering aspireres mediet, og der tilsættes 2 ml basalmedium suppleret med 4 μM IWP4- og 1 μM retinsyreopløsning (RA) pr. hul.
  12. På D4 aspireres mediet og tilsættes 2 ml basalmedium pr. hul til ventrikulær differentiering. For en atriel differentiering aspireres mediet og tilsættes 2 ml basalmedium suppleret med 1 μM RA-opløsning pr. Hul.
  13. På D5 skal du ikke gøre noget.
  14. På D6 aspireres mediet og tilsættes 2 ml basalmedium pr. hul (til både atriel og ventrikulær differentiering).
  15. På D7 skal du ikke gøre noget.
  16. På D8 aspireres mediet og tilsættes 2 ml kardiomyocytvedligeholdelsesmedium. Skift mediet hver anden dag indtil celleseparation, eller følg en kronisk lægemiddeleksponeringsplan.

3. hiPSC-CM-oprensning via MACS (magnetisk aktiveret cellesortering)

  1. Opsug cellekulturmediet og vask hvert hul med 1 ml HBSS--. Dissocier cellerne ved at tilsætte 1 ml 0,25% trypsin / EDTA og inkubere ved 37 ° C, 5% CO2 i 10 minutter. Resuspender og singulariser cellerne i hvert hul med 2 ml pletteringsmedium for at inaktivere trypsin / EDTA.
  2. Saml cellerne fra de seks brønde i et 50 ml konisk rør med en 70 μm si. Vask derefter silen med 3 ml pletteringsmedium. Tæl cellerne.
  3. Centrifuger suspensionen ved ~300 × g i 5 min. Supernatanten suges op, og cellerne vaskes med 20 ml iskold MACS-separationsbuffer. Derefter centrifugeres igen ved ~300 × g i 5 min.
  4. Resuspender pellet i 80 μL kold MACS-separationsbuffer pr. 5 × 106 celler. Tilsæt 20 μL kold ikke-kardiomyocyt udtømningscocktail (human) pr. 5 × 106 celler. Bland forsigtigt cellesuspensionen og inkuber på is i 10 minutter.
  5. Prøven vaskes ved at tilsætte 4 ml kold MACS-separationsbuffer pr. 5 × 106 celler. Prøven centrifugeres ved ~300 × g i 5 min. og supernatanten suges op.
  6. Resuspender pellet i 80 μL kold MACS-separationsbuffer pr. 5 × 106 celler. Tilsæt 20 μL kolde anti-biotin mikroperler pr. 5 × 106 celler. Bland forsigtigt cellesuspensionen og inkuber i 10 minutter på is.
  7. Mens prøverne inkuberer, placeres de positive udtømningskolonner (udstyret med 30 μm forseparationsfiltre) på MACS-separatoren, og de mærkede 15 ml opsamlingsrør placeres under kolonnerne. En kolonne er nødvendig for hver 5 × 106 celler.
  8. Prim hver kolonne med 3 ml kold MACS-separationsbuffer. Bland den antistofbehandlede cellesuspension med 2 ml MACS-separationsbuffer pr. 5 × 106 celler, og føj til kolonnen.
    BEMÆRK: Centrifuger ikke! Centrifugering på dette trin har skadelige virkninger på kardiomyocytudbyttet.
  9. Der tilsættes 2 ml MACS-separationsbuffer til hver kolonne, og gennemstrømningen opsamles, indtil der opsamles 12 ml gennemstrømningskardiomyocytsuspension.
    BEMÆRK: Lad aldrig søjlerne tørre helt.
  10. Kardiomyocytterne centrifugeres ved ~300 × g i 5 minutter, supernatanten kasseres, og kardiomyocytterne suspenderes i 1 ml pletteringsmedium.
  11. Tæl cellerne for at bestemme koncentrationen, juster volumenet til den ønskede såtæthed, og plade cellerne. De rensede kardiomyocytter anbringes på MECM 96-brøndpladerne som beskrevet ovenfor i trin 1.9-1.11 (7,5 × 105 celler/hul).

4. Optisk kortlægning ved hjælp af spændingsfølsomme farvestoffer (VSD'er) og calciumfølsomme fluoroforer (CSF'er)

  1. Den passende mængde VSD i HBSS fremstilles med calcium og magnesium ved tilsætning af 1 μl VSD-farvestof pr. ml HBSS og 10 μl belastningsadjuvans pr. ml HBSS.
    BEMÆRK: Typisk kræver en 96-brønds plade 10 ml VSD-opløsning.
  2. Alternativt fremstilles HBSS med calcium og magnesium suppleret med 5 μM CSF. Kardiomyocytvedligeholdelsesmediet suges til syn, og udskift det med 100 μL VSD eller CSF pr. hul på en plade med 96 huller. Inkuber cellerne i 30 minutter i cellekulturinkubatoren.
  3. Fjern farvestofferne og erstat med analysemedium eller HBSS. Ligevægt ved 37 °C til erhvervelse af optisk kortlægning af baselinedata med en optisk kortlægningsenhed med høj kapacitet.
  4. Behandl cellerne med lægemidler til akut eksponeringstest, eller kortlæg de celler, der blev kronisk udsat for lægemidler af interesse.
  5. Til kardiotoksicitetstest i plader med 96 brønde skal du bruge fire doser af en forbindelse med mindst seks brønde pr. Dosis. Der anvendes doser fra under til over den effektive terapeutiske plasmakoncentration, herunder en dosis af den klinisk effektive terapeutiske plasmakoncentration.
  6. Fortynd lægemidlerne i dimethylsulfoxid, opbevar dem som stamopløsninger ved -20 °C, og fortynd dem derefter i HBSS til de ønskede koncentrationer.
  7. Foretag baseline elektrofysiologiske målinger før lægemiddelanvendelse, som beskrevet i punkt 5. Når lægemidlerne er blevet anvendt, skal du foretage elektrofysiologiske optagelser mindst 30 minutter senere til kroniske undersøgelser. Se følgende afsnit for procedurer for optisk kortlægning af dataindsamling og analyse.

5. Optisk kortlægning ved hjælp af genetisk kodet calciumindikator (GECI)

  1. Plader kommercielt tilgængelige eller MACS-rensede hiPSC-CM'er, som beskrevet ovenfor, ved hjælp af MECM-belagte 96-brøndsplader til fremstilling af modne hiPSC-CM'er. For at danne sammenflydende monolag, plade 7,5 × 104 CM pr. Brønd af hver 96-brøndplade. Brug pletteringsmedium.
  2. Efter 48 timer i pletteringsmedium skiftes til kardiomyocytvedligeholdelsesmedium.
  3. På dag 4 efter optøning og genplettering tilsættes rekombinant adenovirus til ekspression af GCaMP6m (AdGCaMP6m) til celler ved en mangfoldighed af infektion (MOI) = 5. Tilsæt virussen ved hjælp af CM-analysemedium.
    BEMÆRK: Her blev eksperimenter med GCaMP6m udført i iCell 2-kardiomyocytter fra en kommerciel leverandør.
  4. På dag 5 fjernes adGCaMP6m-mediet og udskiftes med frisk RPMI+B27 (kardiomyocytvedligeholdelsesmedium).
  5. På dag 7 observeres CM'erne ved hjælp af mikroskopi eller det optiske kortlægningskamera for at visualisere spontane sammentrækninger og tilsvarende calciumtransienter.
  6. På dag 7 eller senere, til screening af medicin, overføres 96-brøndsplader med modne hiPSC-CM-monolag, der udtrykker GCaMP6m, direkte til det optiske kortlægningskamera fra inkubatoren til dataindsamling ved baseline.
  7. Efter indsamling af elektrofysiologiske data returneres pladerne af CM'erne til vævskulturinkubatoren til målinger på et efterfølgende tidspunkt.
  8. Efter baseline optagelser, anvende medicin, ved hjælp af mindst fire doser af hver medicin og mindst seks brønde per dosis. Ligevægt medicinen på cellerne i mindst 30 minutter før dataindsamling. Opvarm brøndtemperaturen til ~37 °C før og under indsamlingen af data.
  9. Efter baseline-optagelser af en hel plade tilsættes isoproterenol (500 nM) til hver brønd for at muliggøre robuste lægemiddelresponsdata. Kvantificer virkningerne af isoproterenol på monolags slaghastighed, sammentrækningsamplitude (calciumtransient amplitude) og calciumtransient varighed (se figur 6), som beskrevet i afsnit 5.

6. Erhvervelse af optiske kortlægningsdata og analyse

  1. Sørg for, at kameraet, transbelysningen og pladevarmeren er tændt for den optiske kortlægningsenhed.
  2. Åbn anskaffelsessoftwaren, og bestem fillagringsplaceringen.
  3. Åbn den forreste skuffe, og placer pladen på pladevarmeren.
  4. Få en mørk ramme ved at klikke på knappen Mørk ramme .
  5. Vælg Varighed (10-30 sek.) og Billedoptagelseshastighed (f.eks. 100 fps; 250 fps for højere tidsmæssig opløsning), og klik på Start anskaffelse.
  6. Åbn analysesoftwaren, og vælg enten Søg efter en enkelt fil eller Inddel flere under fanen Importér/filtrer for at rekonstruere en plade.
  7. Vælg Parametertilstand (APD eller CaTD), angiv Afstand pr. pixel, og brug guiden Brønd til at bestemme brøndenes placering i billedet. Klik på Gem proces for at gå til næste fane.
  8. Åbn fanen ROI'er (interesseområder), og vælg at tegne ROI'erne manuelt, automatisk eller slet ikke bruge ROI'er, som derefter overvejer hele brønden til analyse. Når investeringsafkastene er valgt, skal du klikke på knappen Behandl/Gem for at gå til næste trin. Markér afkrydsningsfelterne Skjul felter og Vis kun filtrerede felter for at visualisere investeringsafkastet.
  9. Åbn fanen Analyse , og vælg øverst til højre på skærmen hver brønd eller ROI for at bekræfte nøjagtigheden af automatisk beatregistrering. Tilføj eller fjern beats fra sporingerne ved at trykke på Add Beat/Save Beats eller ved at vælge et Individual Beat og trykke på Delete på tastaturet.
  10. Du kan også bruge funktionen Gennemsnitlige varmekort til at oprette varmekort over valgte parametre til pladen.
  11. Klik på knappen Time-Space Plot på fanen Analyse for at visualisere data for hver brønd eller ROI. Når du har kontrolleret, at beatregistreringen er nøjagtig, skal du fortsætte til fanen Eksporter og vælge Filformat. Tryk på Eksporter , og opret en mappe, som dataene skal eksporteres til. Fortsæt med at åbne datafiler og kør den valgte statistiske analyserutine.
    BEMÆRK: .xlxs-filer foretrækkes, da alle parametre eksporteres i en enkelt fil; Andre formater (.csv eller .tsv) genererer én fil pr. parameter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

hiPSC-CM-modning karakteriseret ved fasekontrast og immunofluorescerende konfokal billeddannelse
Tidslinjen for ECM-medieret modning af kommercielt tilgængelige hiPSC-CM'er ved hjælp af MECM-belagte 96-brøndsplader er vist i figur 1A. Disse data indsamles ved hjælp af kommercielt tilgængelige kardiomyocytter, der ankommer til laboratoriet som kryopræserverede hætteglas med celler. Hvert hætteglas indeholder >5 × 106 levedygtige kardiomyocytter. Cellerne er ~ 98% rene og grundigt testet for kvalitetskontrol (analysecertifikat leveres med hvert hætteglas). Det store antal CM'er muliggør optøning og plettering af CM'erne på forskellige ECM-kombinationer ved hjælp af den samme batch af celler. I figur 1 er hiPSC-CM'er belagt på enten ECM- eller MECM-belagte plader med mus. De hiPSC-CM'er, der er belagt på MECM-CM'en, modnes og adskiller sig strukturelt fra det samme parti hiPSC-CM'er, der er forgyldt på muse-ECM'en. Modne celler bliver nemlig stangformede, mens umodne celler bevarer en cirkulær form. Dette kan ses i fasekontrastbilleddannelse og ved farvning af hjertemyofilamenterne (figur 1B; troponin I [TnI], rød). Figur 2 indeholder en mere omfattende validering af den strukturelle modning af hiPSC-CM'er. Et stort synsfelt (20x mål) af CM'er farvet med α-actinin-antistof viser den typiske form af cellerne dyrket på hver ECM-tilstand. α-actinin er et kritisk strukturelt protein arrangeret med regelmæssig afstand i hjertemyofilamenterne. I overensstemmelse med TnI-farvningen i figur 1 indikerer α-actininfarvningen yderligere modningen af hiPSC-CM'er dyrket på MECM. Udover at fremme en stavformet moden fænotype inducerer MECM også større sarkomerorganisation (60x billeder). Mitokondrieindhold og -aktivitet er også forskellige mellem celler, der dyrkes på muse-ECM og MECM (figur 2B). Foster-umodne hiPSC-CM mitokondrie indhold er begrænset til perinukleære rum, med lidt mitokondrier findes i cytosolen. I modsætning hertil fordeles modent hiPSC-CMs mitokondrieindhold i hele cellen. Mitokondrievurdering bruger en etableret protokol19.

hiPSC cardiac-rettet differentiering og hjertekammerspecifikation
Her findes en protokol for intern produktion og modning af rensede, kammerspecifikke hiPSC-CM'er (figur 3A). Dette er baseret på en tidligere offentliggjort rapport20. Præsenteret er detaljerede procedurer for hiPSC-CM-oprensning ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt, magnetaktiveret cellesorteringssæt (MACS). Vi validerede for nylig brugen af MACS-oprensning og viste fordelene ved at bruge MACS sammenlignet med metabolisk baseret hiPSC-CM-oprensning; typisk forventes hiPSC-CM renhed over 95%21. Det er vigtigt at påpege, at hvis det oprindelige CM-indhold er <50%, kan MACS-oprensning kun nå ~ 85%. I disse tilfælde kan tilsætning af ikke-CM være nødvendig efter udtømning af ikke-CM'er. Hvis det oprindelige CM-indhold fra differentiering er >50%, kan udtømning af ikke-CM'er fra cellepopulationen ved hjælp af MACS-kittet opnå renhed >95%; i dette tilfælde er yderligere berigelse eller positiv udvælgelse af CM'er ikke nødvendig. De kammerspecifikke hiPSC-CM'er kan også modnes ved hjælp af MECM-belagte 96-brøndsplader, som beskrevet ovenfor og vist i figur 1 og figur 2. Det må forventes, at de atriespecifikke celler (hiPSC-ACM) har en signifikant hurtigere spontan slaghastighed og kortere aktionspotentiel varighed 80 (APD80) end de ventrikulære specifikke celler (hiPSC-VCM). Disse er typiske elektrofysiologiske data for aktionspotentialer registreret ved hjælp af frekvensomformere og det optiske kortlægningssystem (figur 3B-D).

Hjerteelektrofysiologisk optisk kortlægning med høj kapacitet
Videnskabelig stringens øges dramatisk for ethvert assay, hvis det kan udføres på en høj gennemstrømningsmåde. Kardiotoksicitetsscreeningsdata er vist i figur 4, figur 5, figur 6 og figur 7, der viser elektrofysiologisk screening med høj kapacitet ved hjælp af modne hiPSC-CM-monolag i en 96-brøndplade. Helpladevarmekort for parametre som APD80 (figur 4A) afslører reproducerbarheden af en given parameter i en plade fra brønd til brønd. Yderligere giver varmekort over hele pladen en hurtig undersøgelse af eventuelle afvigelser i datasættet. For eksempel er det i brønd E4 på pladen præsenteret i figur 4A klart, at denne brønd har en meget større APD80-værdi, angivet ved brøndens udseende gul, mens de andre brønde er indigoblå. Typiske aktionspotentialer for modne 2D hiPSC-CM-monolag (figur 4B) minder om aktionspotentialemorfologien for voksne kardiomyocytter isoleret og testet i kultur. Desuden vises en typisk spontan rytme med handlingspotentiale i figur 4C. Dataene i figur 4C er et klokkeslæt-rum-plot af række A, kolonne 1-12. Den hvide linje på tværs af pladekortet i figur 4A viser dette. Hvert lyst fluorescerende blink over tid i hver brønd repræsenterer en enkelt spontan aktivering. Figur 5 og figur 6 viser nytten af at bruge GCaMP6m genetisk kodet calciumindikator (GECI) til at måle intracellulære calciumtransienter; Figur 6 viser også det forventede respons på isoproterenol - den klassiske hjertepositive inotrop. Som reaktion på isoproterenol forårsager aktivering af β1-adrenerge receptorer positiv kronotropi (figur 6A), positiv inotropi (figur 6B) og positiv lusitropi (figur 6C). Disse reaktioner på isoproterenol indikerer den signifikante modning af hiPSC-CM β1-adrenerge receptorer og intracellulære signalkaskader.

I figur 7 vises hiPSC-CM-respons på humane Ether-a-go-go-related gen (hERG) kanalblokkere ved hjælp af GCaMP6m calciumfluorescens til at overvåge rytme og tjene som surrogatmarkør for kontraktilitet. E-4031 er en hERG-specifik kanalblokker, der bremser den spontane slaghastighed og øger calciumtransient varighed (CaTD80) og triangulering (CaT-triangulering). Figur 7A viser påvisning af tidlige efter-depolariseringer forårsaget af E-4031 hERG-kanalblokaden. Andre hERG-kanalblokkere, herunder domperidon, vandetanib og sotalol, blev også testet, og resultaterne er vist i figur 7E-G. Disse forbindelser og doser blev udvalgt på baggrund af det nylige hiPSC-CM-valideringsstudie 1,7,9.

Figure 1
Figur 1: Tidslinje for hurtig modning af kommercielt tilgængelige eller kryopræserverede hiPSC-CM'er fra andre kilder . (A) Optøede kardiomyocytter suspenderet i pletteringsmedium påføres MECM på dag 0. På dag 2 udskiftes mediet med vedligeholdelsesmediet, og det brugte medium skiftes på dag 5. Celler dyrkes i yderligere 2 dage, og på dag 7 kan den modne syncyti af hiPSC-CM'er indlæses med optagelsesopløsning til downstream-applikationer eller dyrkes i længere perioder. B) Kontrastfasen af syncyti af kardiomyocytter belagt med muse-ECM eller MECM viser, at kardiomyocytter belagt med muse-ECM har større cirkularitet sammenlignet med kardiomyocytter belagt med MECM'et. endvidere indikerer immunfarvning for TnI, at kardiomyocytter belagt på muse-ECM bevarer en radial symmetrimorfologi og uorganiserede sarkomerer i modsætning til dolichomorfe og velstrukturerede hiPSC-CM'er belagt på MECM. Skalastænger = 100 μm (B, øvre); 50 μm (B, nederst). Forkortelser: hiPSC-CM'er = humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter; ECM = ekstracellulær matrix; MECM = modningsinducerende ECM 96wp = 96-brønd plade; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; TnI = troponin I. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning af sarkomerorganisering af hiPSC-CM'er belagt på en muse-ECM eller en MECM. (A) ECM-dyrkede hiPSC-CM'er med mus, der er immunfarvede mod α-actinin, indikerer radial morfologi med en lavere tæthed af sarkomerer dispergeret gennem kardiomyocytten i modsætning til hiPSC-CM'er fra samme batch belagt på matrixen og præsenterer stavformet morfologi (20x). (60x) Observation af hiPSC-CM'er med konfokal mikroskopi viser, at hiPSC-CM'er, der dyrkes på en muse-ECM, har radial symmetrimorfologi med en tættere perimetral fordeling af sarkomerer og en lav densitet af radiale sarkomerer i modsætning til hiPSC-CM'er fra samme batch, der blev dyrket på MECM. De præsenterer en homogen fordeling af sarkomerer organiseret langs cellernes længere akse. Skalastænger = 100 μm (øvre); 50 μm (lavere). (B) Farvning af hiPSC-CM'er, der dyrkes på muse-ECM eller MECM med et mitokondriefarvestof, der pletter mitokondrier med højt transmembranpotentiale, viser en lavere farveintensitet i kardiomyocytter dyrket på muse-ECM sammenlignet med MECM. Desuden har hiPSC-CM'er, der dyrkes på MECM, mitokondrier homogent fordelt i kardiomyocytterne i modsætning til hiPSC-CM'er dyrket på muse-ECM, der præsenterer en perinuklear ophobning af mitokondrier. Skalastænger = 200 μm. Forkortelser: hiPSC-CM'er = humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter; ECM = ekstracellulær matrix; MECM = modningsinducerende ECM DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Produktion af kammerspecifikke kardiomyocytter. (A) Protokoller til produktion af kammerspecifikke kardiomyocytter deler identisk Wnt-signalvejsmanipulation med thr stimulering af Wnt-signalering ved hæmning af GSK3 fra dag 0 til 2 og hæmning af denne vej mellem dag 2 og 4. Kammerspecifikation opnås ved aktivering af retinsyrevejen og Wnt-signalmanipulation mellem dag 3 og 6. (B) Som et resultat af kammerspecifikation præsenterer atriale kardiomyocytter en hurtigere hastighed af spontan depolarisering sammenlignet med ventrikulære kardiomyocytter. C) ventrikulære hiPSC-CM'er har langsommere slaghastigheder sammenlignet med atriale hiPSC-CM'er. derfor er aktionspotentialvarigheden ved 80% af repolariseringen kortere i hiPSC-ACM'er sammenlignet med hiPSC-VCM'er. Forkortelser: hiPSC-CM'er = humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter; hiPSC-ACM = atriale humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter hiPSC-VCM = ventrikulære humane inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Optisk kortlægning erhvervet med en optisk kortlægningsenhed og analyseret med Pulse. (A) Eksempel på et varmekort til holistisk observation af parametre vurderet i en 96-brøndplade efter filmfiltrering og bestemmelse af interesseområder i 96-brøndplader, kortlagt med den optiske kortlægningsenhed. I dette eksempel et APD80% varmekort, der angiver en afvigende brønd (E4) og brønde, der ikke producerede data (brønd H3, 4 og 5). (B) Desuden gør den brugervenlige grænseflade det let at plotte morfologien for det gennemsnitlige aktionspotentiale fra de udvalgte brønde. (C) Yderligere datavisualiseringsværktøjer er tilgængelige; i dette eksempel viser et tids-rum-plot, der genereres fra den vandrette linje, der krydser hullerne på række A (panel A), aktivering over et vandret afsnit af hvert hul (hvid linje over række A) over en periode på 10 s. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Tidslinje for kortlægning af intracellulære calciumtransiente ændringer med en genetisk kodet calciumindikator. På dag 4 efter plettering af kommercielt tilgængelige kardiomyocytter i en MECM-belagt 96-brøndplade, som angivet i figur 1A, skal cellerne transduceres med 5 MOI virus i CM-assaymedium natten over. Mediet udskiftes med CDI-vedligeholdelsesmediet indtil dag 6 og skiftes til CDI-vedligeholdelsesmedium uden phenolrødt mellem dag 7 og 11 for at muliggøre hurtig eller kontinuerlig overvågning af intracellulære calciumtransiente ændringer med Nautilus. (B) hiPSC-CMstransduceret med AdGCaMP6f vurderet med optisk kortlægning på dag 7, 9 og 10 efter optøning indikerer tilstedeværelsen af stabile, intracellulære calciummedierede fluorescensændringer, der muliggør daglig optisk kortlægning af den samme plade over længere tid uden behov for genanvendelse af calciumfølsomme farvestoffer. Forkortelser: GECI = genetisk kodet calciumindikator; CM = kardiomyocyt; MOI = mangfoldighed af infektion; 96wp = 96-brønd plade; BSA = bovin serumalbumin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Hurtig og nem udnyttelse af heatmaps til visuel sammenligning af data erhvervet fra moden funktionel syncytia af hiPSC-CM'er med Nautilus og analyseret med Pulse. (A) hiPSC-CM'er behandlet med isoproterenol viser en stigning i slaghastigheden, som observeret ved inspektion af heatmaps og bekræftet med parret t-test. (B) Tilsvarende viser kortlægning af celler før og efter isoproterenolbehandling den inotrope virkning af β-adrenerg stimulering ved visuel sammenligning af varmekort og med parret t-test. (C) Endelig viser brugen af varmekort til visuel sammenligning af data lusitropi, en anden kanonisk effekt af β-adrenerg stimulering, bekræftet med parret t-test (p < 0,0001). Fravær af en cirkel indikerer fejl i dataindsamling/analyse for den specifikke brønd. Forkortelser: hiPSC-CM'er = humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter; ISO = isoproterenol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Validering af GECI-kardiotoksicitetsscreeningsassay ved hjælp af hERG-kanalblokkere. A) Repræsentative spontane calciumfluxspor fra baselinebrønde i HBSS og ved tilstedeværelse af 500 nM E-4031. (B-D) Kvantificering af baseline og +E-4031 effekter på henholdsvis beatrate, calcium transient duration 80 (CaTD80) og calcium transient triangulation (CaT triangulation). *,** angiver signifikant forskel; uparret t-test; p < 0,01; n = 8 i hver gruppe. E) GECI-påvisning af en anden hERG-blokker, domperidon. F) GECI-påvisning af hERG-blok induceret af vandetanib. G) GECI-påvisning af hERG-blok ved høj dosis sotalol. Forkortelser: GECI = genetisk kodet calciumindikator; hERG = humant Ether-a-go-go-relateret gen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Medier og deres kompositioner Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er flere forskellige tilgange til in vitro kardiotoksicitet screening ved hjælp af hiPSC-CMs. Et nyligt "Best Practices" -papir om brugen af hiPSC-CM'er præsenterede de forskellige in vitro-assays , deres primære aflæsninger og vigtigst af alt hvert assays granularitet til kvantificering af human hjerteelektrofysiologisk funktion20. Ud over at bruge membranpiercingelektroder tilvejebringes det mest direkte mål for menneskelig hjerteelektrofysiologisk funktion af VSD'er. VSD-assayudlæsninger muliggør direkte visualisering og kvantificering af kritiske elektrofysiologiske parametre, herunder aktionspotentialvarighed, aktionspotentiel udbredelseshastighed, aktionspotentiel upstroke, actionpotentiel triangulering, beathastighed, beatregelmæssighed og aktionspotentialvarighedsheterogeniteter. På samme måde tilbyder calciumfølsomme sonder information om hiPSC-CM monolagsrytme, hastighed og begivenhedsvarighed. hiPSC-CM calciumtransiente målinger foretaget ved hjælp af fluorescerende sonder giver også information om kontraktiliteten og kontraktilstyrken af hver sammentrækning. Dette papir indeholder metoder til anvendelse af modne hiPSC-CM'er (96-brøndsplader) i VSD- og calciumtransiente måleassays med høj kapacitet. Ud over metoder til optisk kortlægning præsenteres software til EP-dataanalyse med høj kapacitet.

De metoder, der er skitseret her, er et betydeligt fremskridt inden for kardiotoksicitetsscreening og regulatorisk videnskab. Her har vi præsenteret metoder til hurtig modning og elektrofysiologisk registrering af 2D hiPSC-CM monolag i high-throughput screeningsplader (96-brøndplader). Hurtig modning ved hjælp af en MECM (7 dage) vist her er et stort fremskridt i forhold til tidligere tilgange, der kræver, at modning sker over 30-100 dage22,23. Sammenlignet med andre ECM'er, som kræver manuel anvendelse til hvert eksperiment, er MECM-plader præcoatet med ECM og ankommer til laboratoriet klar til brug. Dette aspekt af MECM gør det lettere at bruge, mindre variabelt og mere effektivt end at bruge andre ECM-belægninger. Det er vigtigt, at denne tilgang kan bruges til både kryopræserverede, kommercielt tilgængelige hiPSC-CM'er og "hjemmelavede" hiPSC-CM'er, som kan være kammerspecifikke. På grund af den distinkte, stavformede struktur af modne hiPSC-CM'er (figur 1 og figur 2) er det vigtigt at påpege, at der kræves et større antal celler til sammenflydende monolagsdannelse her sammenlignet med protokoller, der bruger andre ECM'er. Især når vi bruger muse-ECM (celler har en kontinuerligt spredende pandekagefænotype), tallerkener vi 50.000 hiPSC-CM'er pr. Brønd, men når vi bruger MECM, tallerkener vi 75.000 hiPSC-CM'er pr. Brønd. Antallet af CM'er pr. brønd kan også reduceres, hvis cellerne skal bruges til enkeltcelleanalyse, såsom patchklemme eller enhver anden billeddannelsesteknik, der kræver enkeltceller.

Kommercielt tilgængelige hiPSC-CM'er giver fordele for reguleringsvidenskab på grund af den omfattende karakterisering af disse celler af Food and Drug Administration (FDA) -ledede internationale bestræbelser. Imidlertid er de kommercielt tilgængelige celler en blanding af nodale, atriale og ventrikulære hiPSC-CM'er, som giver meget relevant toksicitetsinformation, men mangler de kammerspecifikke egenskaber, der efterligner det menneskelige hjerte. Kammerspecifikke hiPSC-CM'er genskaber de velkendte elektrofysiologiske forskelle mellem atriale og ventrikulære kardiomyocytter og giver et in vitro-assay til udvikling af kammerspecifikke antiarytmiske terapier (figur 3B-D). For eksempel kan atrieflimren-specifikke lægemidler nu testes og udvikles ved hjælp af hiPSC-ACM monolag belagt i 96-brønd plader for robust og streng dataindsamling. Ligeledes, når screening for at afgøre, om en forbindelse forårsager Torsades de Pointes (TdP), en højrisiko ventrikulær arytmi - er det optimalt ikke at have atriale og nodale celler, der "forurener" ventrikulære hjertemonolag. Selvom den FDA-ledede hiPSC-CM-valideringsindsats til dato har fokuseret på at bruge kommercielt tilgængelige CM'er, er det sandsynligt, at fremtidige lovgivningsmæssige videnskabelige anbefalinger vil henvende sig til brugen af kammerspecifikke celler for at gøre toksicitetsscreeningen endnu mere forudsigelig for den menneskelige hjertetilstand. De metoder, der er skitseret her, er baseret på tidligere rapporter og giver en robust tilgang til generering af kammerspecifikke kardiomyocytter afledt af pluripotente stamceller21.

En stor forskel mellem disse protokoller og dem, der typisk anvendes i marken, er den anvendte rensningsmetode. De fleste laboratorier, der genererer hiPSC-CM'er i deres egne laboratorier, er afhængige af metabolisk medieret udvælgelse af kardiomyocytter22. Her er vi afhængige af at bruge MACS til at rense hiPSC-CM'er ved hjælp af en klinisk godkendt cellebehandlingsmetode, der producerer CM'er med sundere fænotyper23. Den metaboliske udfordringstilgang er effektiv, men bruger en medieformulering, der simulerer myokardieiskæmi24. Ved anvendelse af MACS-oprensning af hiPSC-CM'er er det vigtigt at udnytte ikke-CM-udtømningscocktailen, som er målrettet mod ikke-CM'er til magnetisk udtømning fra cellepopulationen. Brug af ikke-CM-udtømningsmetoden minimerer forskydningsspændingen, som CM'erne oplever i magnetsøjlen, og foretrækkes frem for direkte magnetisk mærkning af CM-populationen. Brug af MACS-oprensning af kammerspecifikke celler vil gøre det muligt for andre laboratorier at generere sunde CM'er til forskning og toksicitetstest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

TJH er konsulent og videnskabelig rådgiver for StemBioSys, Inc. TB er ansat hos StemBioSys, Inc. AMR og JC er tidligere konsulenter for StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR og JC er aktionærer i StemBioSys, Inc.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet støttet af NIH-tilskud HL148068-04 og R44ES027703-02 (TJH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin EDTA Gibco 25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) Millipore Sigma A3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) Millipore Sigma H4034
AdGCaMP6m Vector biolabs 1909
Albumin human Sigma A9731-1G
alpha actinin antibody ThermoFisher MA1-22863
B27 Gibco 17504-044
Blebbistatin Sigma B0560
CalBryte 520AM AAT Bioquest 20650
CELLvo MatrixPlus 96wp StemBiosys N/A https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021 LC Laboratories c-6556
Clear Assay medium (fluorobrite) ThermoFisher A1896701 For adenovirus transduction
DAPI ThermoFisher 62248
DMEM:F12 Gibco 11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135-500ML
FluoVolt ThermoFisher F10488
HBSS Gibco 14025-092
iCell CM maintenance media FUJIFILM/Cellular Dynamics M1003
iCell2 CMs FUJIFILM 1434
Incucyte Zoom  Sartorius
iPS DF19-9-11T.H WiCell
Isoproterenol MilliporeSigma CAS-51-30-9
IWP4 Tocris 5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma A8960-5g
L-glutamine Gibco A2916801
LS columns Miltenyii Biotec 130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) Miltenyii Biotec 130-091-221
Matrigel Corning 354234
MitoTracker Red ThermoFisher M7512
Nautilus HTS Optical Mapping  CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal Microscope Nikon
nonessential amino acids Gibco 11140-050
pre-separation filter Miltenyii Biotec 130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human Miltenyii Biotec 130-110-188
Pulse CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet) Miltenyii Biotec 130-091-051
Retinoic acid Sigma R2625
RPMI 1640  Gibco 11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) Gibco 22400-089
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyii Biotec 130-107-086
TnI antibody (pan TnI) Millipore Sigma MAB1691 
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) Gibco 15040-066
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
β-mercaptoethanol Gibco 21985023

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 193
Kardiotoksicitetsscreening med høj kapacitet ved hjælp af modne humane inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytmonolag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monteiro da Rocha, A., Allan, A.,… More

Monteiro da Rocha, A., Allan, A., Block, T., Creech, J., Herron, T. J. High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers. J. Vis. Exp. (193), e64364, doi:10.3791/64364 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter