Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Bewertung der antibakteriellen Wirksamkeit eines antibiotikafreisetzenden Polymers vor, um eine prophylaktische klinische Anwendung unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen ATP-basierten lumineszierenden mikrobiellen Viabilitätstests in Echtzeit zu simulieren. Diese Methode ermöglicht die Überwachung der longitudinalen Aktivität von wirkstofffreisetzenden Materialien und kann weitgehend für die Erprobung antimikrobieller Wirkstoffverabreichungsplattformen angepasst werden.
Abstract
Ultrahochmolekulares Polyethylen (UHMWPE) wird häufig in der Totalendoprothetik von Gelenken als tragende Oberfläche verwendet. Periprothetische Gelenkinfektionen, von denen die meisten kurz nach dem Gelenkersatz auftreten, machen fast 25 % der gesamten Knierevisionsoperationen aus, und die vollständige Ausrottung bakterieller Infektionen stellt eine große Herausforderung dar. Ein vielversprechender Weg, dieses Problem anzugehen, besteht darin, die lokale anhaltende Abgabe von Antibiotikakonzentrationen sicherzustellen, die ausreichen, um die Bakterien zu hemmen und die routinemäßige systemische Antibiotikaprophylaxe zu unterstützen. Es wird zunehmend an der Entwicklung effizienter lokaler Geräte zur Verabreichung von Medikamenten geforscht. Obwohl etablierte antibakterielle Testmethoden für Arzneimittel verwendet werden können, um die antibakterielle Wirksamkeit von wirkstofffreisetzenden Materialien zu testen, fehlt es ihnen an Echtzeit- und Längsschnittdaten zur antibakteriellen Wirksamkeit, die mit den Elutionsprofilen von Antibiotika aus diesen Geräten korreliert werden können. Hier berichten wir über eine direkte und vielseitige Methodik zur Bestimmung der antibakteriellen Wirksamkeit von antibiotikafreisetzenden UHMWPE-Implantaten. Diese Methodik kann als Plattform verwendet werden, um Bakterienkulturen zu jedem Zeitpunkt eines langwierigen Experiments zu vermeiden, und kann auch an andere lokale Geräte zur Verabreichung von Medikamenten angepasst werden.
Introduction
Arthrose ist eine bedeutende degenerative Erkrankung, von der weltweit 500 Millionen Erwachsene betroffen sind1. Der Goldstandard bei der Behandlung von Arthritis im Endstadium ist der totale Gelenkersatz, der bis 2030 allein in den Vereinigten Staaten jährlich bei über 2 Millionen Patienten durchgeführt werden soll2, wobei auch die weltweite Nachfrage enorm steigt 3,4. Bei diesem Verfahren werden die Gelenkknorpelflächen der Gelenke durch tragende Kunststoffe aus Metall/Keramik und hochvernetztem ultrahochmolekularem Polyethylen (UHMWPE) ersetzt. Der totale Gelenkersatz verbessert die Lebensqualität von Patienten mit Arthritis erheblich5, aber eine erhebliche Komplikation, die die Leistungsfähigkeit der Implantate und die Zufriedenheit der Patienten gefährdet, ist die periprothetische Gelenkinfektion (PJI), die 15%-25% der Revisionsoperationen ausmacht6. Als Infektionsursache wird in den meisten Fällen die mikrobielle Kontamination des Implantatlagers während der Operation angenommen7. Die kontaminierende Population dehnt sich dann auf den Implantat- und Gewebeoberflächenaus 8. Das Immunsystem des Wirts wird als Reaktion darauf ausgelöst, aber die Wachstumsrate und die Biofilmbildung der kontaminierenden Organismen können es ihnen ermöglichen, den Immunzellen auszuweichen, was zu einem erhöhten Zytokinsturm und Chemokin führen kann, ohne dass die Bakterien ausgerottet werden 9,10,11. Die daraus resultierende tiefe Infektion des Knochens gefährdet die Fixierung und Leistungsfähigkeit des Implantats sowie die Gesundheit des Patienten12.
Staphylococcus aureus und Koagulase-negative Staphylokokken sind die vorherrschenden Erreger von PJI13. Der Schweregrad der Staphylokokkeninfektionen ist aufgrund ihrer erhöhten Resistenz gegen Antibiotika, der Biofilmbildung und der Fähigkeit, als kleine Kolonievarianten zu persistieren, hoch14,15,16. Implantatassoziierte Infektionen entstehen durch die Adhäsion von Mikroorganismen auf der Oberfläche des Implantats und die Bildung einer komplexen Biofilmmatrix, die es den Bakterien ermöglicht, schädlichen Immunfaktoren des Wirts und wirksamen Antibiotikakonzentrationen auszuweichen14,15,16. Konventionelle Behandlungsmethoden umfassen intravenöse und orale Antibiotikakombinationen über einen längeren Zeitraum17. Ein großer Nachteil dieses Ansatzes ist die geringe Bioverfügbarkeit des Arzneimittels an der Infektionsstelle und die Schwierigkeit, ausreichende Antibiotikakonzentrationen zu erreichen, um die Bakterien über den Behandlungszeitraum konsistent zu eliminieren, was häufig zu schlechten Ergebnissen führt18. Um diese Unzulänglichkeiten zu beheben, wurde ein voll funktionsfähiges, lokalisiertes, medikamentenfreisetzendes UHMWPE-Implantat entwickelt, das eine anhaltende Freisetzung wirksamer Antibiotikakonzentrationen in den Gelenkraum gewährleistet19. Die lokale Elution des medikamentenfreisetzenden Implantats wird als komplementäres Instrument verwendet, um das Wachstum und die Besiedlung von Bakterien zu verhindern, die nach der Entfernung des Implantats und dem Debridement des Gewebes verbleiben. In-vitro-antibakterielle Tests dieses antibiotikafreisetzenden UHMWPE können durchgeführt werden, indem das Material direkt mit den Bakterien inkubiert und die Bakterien durch die Spread-Plate-Methode quantifiziertwerden 20,21. Alternativ können Aliquote von Eluentenmedien gegen Bakterien getestet werden, wobei Methoden wie die Agarscheiben-Diffusionsmethode, Bouillon-Verdünnungsmethoden und Time-Kill-Testsverwendet werden 22. Alle diese Methoden beruhen auf einer Wachstumsbeobachtung ca. 16-18 h nach der Entnahme der Aliquots mittels Koloniezählung und Trübungsmessungen. Die Elution von Antibiotika aus solchen Geräten kann mit diesen In-vitro-Methoden longitudinal quantifiziert werden; Um jedoch den translationalen Wert dieser Konzentrationsprofile zu bestimmen, ist eine robuste Echtzeit-In-vitro-Methode zur Beurteilung der antibakteriellen Aktivität erforderlich.
Der in dieser Studie verwendete mikrobielle Viabilitätstest wurde für die Quantifizierung lebensfähiger Bakterien entwickelt, indem die Lumineszenz gemessen wird, die Adenosintriphosphat (ATP) entspricht, das aus einer lebenden Bakterienzelle freigesetzt wird, wobei eine Luciferin-Luciferase-basierte Nachweistechnologie verwendet wird. ATP, als Energiewährung lebender Zellen, dient als direkter Indikator für physiologisch lebensfähige Zellen. Das Reagenz führt eine Zelllyse durch, bei der ATP-Moleküle aus lebensfähigen Zellen freigesetzt werden, die dann in Form von Lumineszenz nachgewiesen werden. Diese Lumineszenz steht in direktem Zusammenhang mit dem Anteil lebensfähiger Bakterienzellen innerhalb der Probe23. Dabei handelt es sich um einen einfachen, vielseitigen, schnellen, auf Einzelreagenzien basierenden Echtzeit-Assay, der an eine Vielzahl von Assay-Designs und -Bedingungen mit grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen angepasst werden kann. Hier berichten wir über eine Methode zur Bestimmung der antibakteriellen Aktivität von antibiotikafreisetzendem UHMWPE, das mit Labor- und klinischen Stämmen von S. aureus inkubiert wurde, unter Verwendung eines modifizierten Time-Kill-Assays, der auf dem mikrobiellen Viabilitätstest basiert (z. B. BacTiter Glo). Während die Methodik mit einem spezifischen Implantatmaterial und einer spezifischen orthopädischen Anwendung beschrieben wird, kann die Methode eine Plattform für die Erprobung anderer antibiotikafreisetzender Verabreichungsgeräte mit klinischen Anwendungen bieten.
Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Zubereitung der Müller-Hinton-Brühe (MHB): 22 g kationangepasstes MHB in 1 l deionisiertem Wasser auflösen. Autoklavieren Sie das Medium 20 Minuten lang bei 121 °C und einem Druck von 15 lb und achten Sie darauf, dass die Flasche locker verschlossen ist. Lagern Sie die vorbereitete sterile Brühe bis zur Verwendung bei 4 °C.
- Zubereitung von Tryptic-Soja-Agar (TSA): 20 g TSA-Pulver in 500 ml deionisiertem Wasser auflösen. Autoklavieren Sie die Agarmischung bei 121 °C und 15 lb für 20 Minuten. Überführen Sie die sterilen Medien in ein 55 °C warmes Wasserbad, um die Temperatur des geschmolzenen Agars zu senken. Gießen Sie den abgekühlten zubereiteten Agar in sterile Petrischalen (~15 ml) und lassen Sie ihn erstarren. Lagern Sie die erstarrten Agarplatten umgedreht, um Kondensation zu vermeiden.
- Zubereitung der Tryptischen Sojabrühe (TSB): 15 g TSB-Pulver in 500 ml deionisiertem Wasser auflösen. Autoklavieren Sie die Brühenmischung bei 121 °C und 15 lb für 20 Minuten. Lagern Sie die vorbereitete sterile Brühe bis zur Verwendung bei 4 °C.
- Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): Der Autoklav kaufte 1x PBS bei 121 °C und 15 lb für 20 Minuten vor der sterilen Verwendung.
- Vorbereitung der Reagenzien für den mikrobiellen Viabilitätstest: Den Inhalt des Assays auf Raumtemperatur angleichen. Mischen Sie 10 ml Puffer mit dem lyophilisierten lumineszierenden Reagenzpulver und lagern Sie das vorbereitete Reagenz bei −20 °C als 1-ml-Aliquote. Tauen Sie das lichtempfindliche Reagenz vor jedem Zeitpunkt auf und bringen Sie es auf Raumtemperatur.
- Gentamicinsulfat-Stammlösung: 80 mg Gentamicinsulfat (GS) in 10 ml 1x PBS auflösen. Wirbeln Sie die Arzneimittellösung gründlich vor, um eine 8 mg/ml GS-Stammlösung zu erhalten.
- Vancomycinhydrochlorid-Stammlösung: Lösen Sie 10 mg Vancomycinhydrochlorid-Pulver gründlich in 10 ml deionisiertem Wasser auf, um eine 1 mg/ml-Stammlösung zu erhalten.
- Borsäure-Pufferlösung: 24,7 g (0,4 M) Borsäure in 900 ml deionisiertem Wasser lösen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit einer 50%igen (w/v) Natronlauge auf 10,4 ein. Fügen Sie zu diesem Schritt deionisiertes Wasser hinzu, um 1 l zu erhalten.
- O-Pthaldialdehyd-Reagenz (OPA): 0,2 g OPA in 1 ml Methanol lösen. 19 ml 0,4 M Borsäurepuffer (pH 10,4) in die OPA-Lösung geben. Fügen Sie dem OPA-Borsäure-Gemisch 0,4 ml 2-Mercaptoethanol hinzu. Decken Sie die Durchstechflasche mit Aluminiumfolie ab und lagern Sie sie bei 4 °C, um sie bis zu 2-3 Tage nach der Zubereitung zu verwenden.
ACHTUNG: Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut, Augen und Kleidung. Der Umgang mit dem OPA und 2 Mercaptoethanol-Reagenzien sollte nur unter einem Abzug mit geeigneter Abluft und unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung erfolgen. Vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen, Staub oder Aerosolen.
2. Herstellung von reinem und medikamentenbeladenem UHMWPE
- Je 2 g Gentamicinsulfat- und Vancomycinhydrochloridpulver mit einem Sieb (75 μm Porengröße) sieben und bei 45 °C im Vakuumofen (<0,1 atm) für 18-24 h dehydrieren.
- Mischen Sie das dehydrierte Medikament mit UHMWPE-Pulver bei 7 Gew.-% (1,12 g Antibiotikum + 14,88 g UHMWPE) in einem Behälter mit einem mechanischen Mischer für 5 Minuten.
- Eine Aluminium-Bronze-Sonderform (85 mm x 50 mm) mit Edelstahl-Einlegeplatten 1 h im Umluftofen auf 180 °C vorheizen. Die Walzen der Presse auf 170 °C vorheizen.
- Das gemischte Pulver in die Form geben und 10 Minuten lang bei 10 MPa, 170 °C komprimieren, gefolgt von einem 45-minütigen Wasserkühlzyklus bei 10 MPa.
- Entfernen Sie den geformten UHMWPE-Block (~3,5 mm) mit einer Hydraulikpresse aus der Presse.
- Fräsen Sie die Ober- und Unterseite des Blocks mit einer computergesteuerten numerischen Steuerung (CNC), um Oberflächenunregelmäßigkeiten und Verunreinigungen zu entfernen.
- Schneiden Sie den Block mit der CNC in 3 mm x 5 mm x 20 mm große Streifen.
- Herstellung von jungfräulichem UHMWPE (ohne Zusatz von Antibiotika) unter Verwendung der gleichen Methodik, die als Kontrolle für die Studie beschrieben wurde.
Ergänzende Abbildung 1: Teile des Werkzeugs, die zum Formen der UHMWPE-Proben verwendet werden. (A) Einlegeplatte aus rostfreiem Stahl; (B) Formhohlraum; (C) Kolben; (D) Backplate Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
3. Bestimmung der Elutionskinetik von wirkstofffreisetzenden UHMWPE
- Legen Sie einen 3 mm x 5 mm x 20 mm großen Streifen in eine 3-ml-Spritze mit Luer-Lock und einer 25-G-Nadel.
- Waschen Sie den Streifen, indem Sie die Spritze mit deionisiertem Wasser füllen und die Spritze mehrmals umdrehen.
- Füllen Sie die Spritze mit deionisiertem Wasser bis zur 2-ml-Graduierung.
- Legen Sie die Spritze bei 100 U/min bei Raumtemperatur auf einen Shaker.
- Zu jedem Zeitpunkt (6 h, 1 Tag, 2 Tage, 3 Tage, 1 Woche) den Eluenten in einer 2-ml-Durchstechflasche sammeln.
- Waschen Sie den Streifen zu jedem Zeitpunkt, indem Sie die Spritze mit deionisiertem Wasser füllen und die Spritze umdrehen. Verwerfen Sie die Lösung und füllen Sie die Spritze mit deionisiertem Wasser bis zur Graduierung von 2 ml, um das Experiment bis zum nächsten Zeitpunkt fortzusetzen.
4. Bestimmung der Vancomycin-Konzentration
- Nachweis der Vancomycinkonzentration spektrophotometrisch in deionisiertem Wasser bei einer maximalen Absorptionswellenlänge von 280 nm.
- Bereiten Sie Standards für bekannte Konzentrationsbereiche vor, indem Sie 100 μl 1 mg/ml-Stammlösung in die UV-96-Well-Platte geben und seriell mit 100 μl deionisiertem Wasser verdünnen, um sechs Stufen bekannter Konzentrationen (1 mg/ml bis 0,03125 mg/ml) zu erhalten.
- Übertragen Sie 100 μl der Eluenten auf UV-klare 96-Well-Platten und bestimmen Sie die Konzentration bei 280 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
- Generieren Sie eine Kalibrierungskurve, indem Sie die bekannten Wirkstoffkonzentrationen gegen die entsprechenden Absorptionswerte auftragen. Berechnen Sie die unbekannte Wirkstoffkonzentration im Eluenten mithilfe der linearen Gleichung, die durch die Kalibrierkurve generiert wird.
- Bestimmen Sie die Wirkstoffmasse, indem Sie die Konzentration mit dem Eluentenvolumen (~1,7 ml) multiplizieren.
- Berechnen Sie die kumulative Wirkstofffreisetzung (mg) zu einem Zeitpunkt, indem Sie die Wirkstofffreisetzung aus allen vorhergehenden Zeitpunkten summieren.
- Normalisieren Sie die Wirkstofffreisetzung auf die Oberfläche des Streifens (3,5cm2), um die kumulative Wirkstofffreisetzung pro Quadratzentimeter (cm2) des Implantats zu bestimmen.
5. Bestimmung der Gentamicinkonzentration nach der OPA-Markierungsmethode 27
- Bereiten Sie GS-Standardlösungen vor, um den OPA-Assay durchzuführen.
- 1 ml der 80 μg/ml GS-Lösung in ein Zentrifugenröhrchen überführen.
- Geben Sie 500 μl PBS in fünf weitere Zentrifugenröhrchen.
- Führen Sie eine serielle Verdünnung mit diesen Röhrchen durch, um GS-Konzentrationen von 80 μg/ml, 40 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml und 2,5 μg/ml zu erhalten. Diese dienen als Kalibrierlösungen für den Assay.
- Geben Sie in einer durchsichtigen 96-Well-Platte 80 μl PBS in die Vertiefung A-1 und 80 μl der Kalibrierlösungen in aufsteigender Konzentration in die Vertiefungen A-2 bis A-7. Dies dient als interne Kalibrierung für den Assay.
- Geben Sie 80 μl jeder Probe in dreifacher Ausführung in die leeren Vertiefungen, um sie in derselben 96-Well-Platte zu analysieren. Begrenzen Sie die Anzahl der Proben pro Well-Platte auf <50, so dass der Zeitpunkt der Zugabe der OPA-Lösung zu den Proben für alle Proben ungefähr gleich ist und um eine Verdunstung zu vermeiden.
- Fügen Sie allen Standards und Probenlösungen OPA-Reagenz hinzu.
- Füllen Sie in einem Abzug ein 25-ml-Reagenzreservoir mit Methanol.
- 8 ml Methanol und 1 ml der hergestellten OPA-Lösung werden in ein zweites Reagenzreservoir gegeben (Abschnitt 1.8). Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie sie auf und ab pipettieren.
- Geben Sie mit einer Mehrkanal-100-μl-Mikropipette 48 μl Methanol aus dem ersten Reservoir in alle probenhaltigen Vertiefungen in der 96-Well-Platte.
- Im Anschluss an diesen Schritt werden 72 μl verdünnte OPA-Lösung aus dem zweiten Reservoir zu allen probenhaltigen Vertiefungen in der 96-Well-Platte gegeben. Inkubieren Sie die Wellplatte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Messen Sie die Fluoreszenzintensität (Anregung von 340 nm, Emission von 455 nm) mit einem Mikroplatten-Reader unmittelbar nach der 10-minütigen Inkubation.
- Zeichnen Sie die Kalibrierkurve unter Verwendung der Intensitätsmesswerte für die Lösungen mit bekannten GS-Konzentrationen auf. Fügen Sie eine lineare Linie hinzu, um die beste Anpassung zu bestimmen und die entsprechende Gleichung zu generieren.
- Berechnen Sie die Wirkstoffkonzentration im Eluenten aus den generierten Kalibrierkurven, indem Sie die bekannten Wirkstoffkonzentrationen gegen die entsprechenden Absorptionswerte auftragen.
- Berechnen Sie die Wirkstoffmasse, indem Sie die Konzentration mit dem Eluentenvolumen (~1,7 ml) multiplizieren.
- Bestimmen Sie die kumulative Wirkstofffreisetzung (mg) zu einem Zeitpunkt, indem Sie die Wirkstofffreisetzung aus allen vorhergehenden Zeitpunkten summieren.
- Normalisieren Sie die Wirkstofffreisetzung auf die Oberfläche des Streifens (3,5cm2), um die kumulative Wirkstofffreisetzung pro Quadratzentimeter (cm2) des Implantats zu bestimmen.
6. Bakterienvorbereitung
HINWEIS: Die folgenden S. aureus-Stämme wurden in dieser Studie verwendet: Typstamm 12600, klinische Stämme L1101 und L1163 (erhalten von Dr. Kerry LaPlante an der University of Rhode Island). Die Suszeptibilitätsprofile dieser Stämme sind in Tabelle 1 dargestellt.
| Bakterienstämme | Gentamicin MHK | Vancomycin MIC | |
| ATCC 12600 | ≤1 μg/ml (empfindlich) | ≤0,5 μg/ml (empfindlich) | |
| L1101 (Klinischer Stamm) | ≥16 μg/ml (beständig) | 8 μg/ml (Zwischenstufe) | |
| L1163 (Klinischer Stamm) | ≤1 μg/ml (empfindlich) | 8 μg/ml (Zwischenstufe) | |
Tabelle 1: Antibiotika-Empfindlichkeitsprofile von Kontroll- und klinischen S. aureus-Stämmen.
VORSICHT: Alle Schritte, die den Umgang mit Bakterienkulturen und Suspensionen betreffen, wurden in einem BSL-2-Laborraum in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II, Typ A2, durchgeführt.
- Tauen Sie die Bakterienbestände ab −80 °C auf TSA-Platten auf, um das Wachstum von S. aureus zu erleichtern. Die Platten werden über Nacht bei 35 °C statisch inkubiert.
- Zwei bis drei Kolonien aus den über Nacht gewachsenen Agarplattenkulturen werden in 1 ml steriles TSB überführt und über Nacht bei 35 °C statisch inkubiert.
- Übertragen Sie 100 μl Bakterien auf eine klare 96-Well-Platte, um die Trübung spektrophotometrisch zu messen, indem die Absorption bei 600 nm bestimmt wird.
- Verdünnen Sie die Bakterien 10.000-fach mit sterilem MHB, bevor Sie die lebensfähige Bakterienzahl mit dem Lumineszenz-Assay bestimmen.
7. Durchführung des Echtzeit-Tests zur mikrobiellen Viabilität
- Führen Sie den lumineszenzbasierten Assay mit weißen, undurchsichtigen 96-Well-Platten durch.
- Mischen Sie 100 μl verdünnte Bakteriensuspensionen mit 100 μl Assay-Reagenz, das in Abschnitt 1.5 hergestellt wurde.
- Legen Sie einen mit Alufolie bedeckten Deckel über die vorbereitete 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang mit 100 U/min Schütteln.
- Messen Sie die Lumineszenz sofort mit einem Mikroplatten-Reader mit den folgenden Einstellungen in der Gen5 3.11-Software.
- Klicken Sie auf Neu , um ein Protokoll im Task-Manager-Fenster einzurichten.
- Wählen Sie Costar 96 weiß undurchsichtig im Dropdown-Menü für Plattentyp.
- Klicken Sie im Menü "Schritte > Aktionen auswählen" auf "Lesen".
- Klicken Sie auf Lumineszenz im Fenster Lesemethode. Lassen Sie die Optionen Endpunkt/kinetische Faser und Lumineszenzfaser unter Lesetyp bzw. Optiktyp ausgewählt. Klicken Sie auf OK.
- Behalten Sie die
Einstellungen im Fenster Leseschritt bei (Verstärkung = 135; Integrationszeit = 1 Sek.; Lesehöhe = 4,5 mm). Klicken Sie auf OK. - Das Plattenlayoutfenster wird als bereit für den Durchlauf angezeigt. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Deckel verwenden im Fenster der Ladeplatte und klicken Sie auf OK.
- Legen Sie die 96-Well-Platte in das Gerät, um die Lumineszenzwerte abzulesen.
8. Erzeugen einer Standardkurve für Lumineszenz im Vergleich zur lebensfähigen Anzahl für jeden Bakterienstamm
HINWEIS: Kultivieren und zählen Sie alle S. aureus-Stämme gemäß der in Abschnitt 6 beschriebenen Methodik.
- Bereiten Sie seriell verdünnte Bakteriensuspensionen vor, die als Standards dienen.
- Zählen Sie die über Nacht gewachsene Bakteriensuspension durch spektrophotometrische Messung der Trübung.
- Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 6.000 × g , um die Bakterien zu pelletieren, und resuspendieren Sie das Pellet in sterilem MHB, um die Konzentration auf 1 x 109 KBE/ml einzustellen.
- Verdünnen Sie 100 μl reine Suspension mit 900 μl MHB und führen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung durch, um 1 x 101 KBE/ml zu erreichen.
- Führen Sie den Lumineszenz-Assay an den vorbereiteten Bakteriensuspensionen durch, wie in Abschnitt 7 beschrieben.
- Verwenden Sie steriles MHB als leere Kontrolle für das Experiment und subtrahieren Sie den leeren Lumineszenzwert von den Lumineszenzwerten der Testprobe.
- Plotten Sie den Logarithmus (KBE) gegen den Logarithmus (Lumineszenz), um eine Standardkurve zu erzeugen. Notieren Sie die Gleichung und denR2-Wert .
- Bestimmen Sie die KBE/ml, die den Lumineszenzwerten entspricht, unter Verwendung der stammspezifischen Gleichung während der gesamten Studie.
9. Zeitabhängiger Aufbau einer antibakteriellen Aktivitätsstudie
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Kultivieren Sie die Bakterien über Nacht in 1 ml TSB-Brühe.
- Die über Nacht gezüchtete Bakteriensuspension wird in sterilem MHB auf 105 KBE/ml verdünnt (Abschnitt 6) und die lebensfähige Keimzahl mit den Lumineszenzgeräten vor Beginn des Experiments überprüft (Abschnitt 7).
- Legen Sie die reinen UHMWPE- und medikamentenbeladenen UHMWPE-Streifen (3 mm x 5 mm x 10 mm, halbe Größe der für die Elutionsstudien in Abschnitt 2 vorbereiteten Streifen) in eine 3-ml-Spritze.
- Ziehen Sie MHB mit 10 5 KBE/ml durch die angebrachte Nadel bis zur 1,5-ml-Marke, was 1,35 ml MHB entspricht, in die Spritze (Abbildung 1: Schritt 1).
- Legen Sie die Spritze auf einen Schüttelinkubator (100 U/min) bei 37 °C bis zu den angegebenen Zeitpunkten von 6 h, Tag 1, Tag 2, Tag 3, Tag 4, Tag 5, Tag 6 und Tag 7 (Abbildung 1: Schritt 2).
- Nehmen Sie zu jedem angegebenen Zeitpunkt den Spritzenaufbau heraus und führen Sie einen Echtzeit-Test zur mikrobiellen Viabilität gemäß Abschnitt 7 an 100 μl Bakteriensuspension durch (Abbildung 1: Schritt 3-4).
- Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien für die Zeitpunkte 6 h, Tag 1, Tag 2, Tag 3 und Tag 7. Bestimmen Sie die KBE/ml aus den Lumineszenzeinheiten anhand der entsprechenden Standardkurve.
- Überprüfen Sie das Fehlen lebensfähiger Bakterien in den Proben, die Lumineszenzwerte unterhalb der Nachweisgrenze aufwiesen, indem Sie die Spread-Plate-Methode auf TSA-Platten durchführen und über Nacht bei 35 °C inkubieren. Prüfen Sie am nächsten Tag, ob Kolonien vorhanden sind.
- Zentrifugieren Sie die verbleibende Bakteriensuspension 10 Minuten lang bei 10.000 × g und saugen Sie das verbrauchte Medium vorsichtig ab. Bei Röhrchen, in denen die Pellets aufgrund der antibakteriellen Wirkung der Arzneimittel nicht visuell beobachtet werden, lassen Sie 100 μl im Röhrchen, um sicherzustellen, dass das unsichtbare Pellet nicht gestört wird (Abbildung 1: Schritt 5).
- Resuspendieren Sie die pelletierten Bakterien in frischem MHB und ziehen Sie die Bakteriensuspension durch die angebrachte Nadel in denselben Spritzenaufbau zurück (Abbildung 1: Schritt 6).
10. Quantifizierung von anhaftenden Bakterien auf der UHMWPE-Oberfläche
- Entnahme von reinen UHMWPE- und medikamentenbeladenen UHMWPE-Oberflächen aus dem Spritzenaufbau nach Abschluss der Studie an Tag 7.
- Übertragen Sie die Oberflächen in 1,5-ml-Röhrchen und spülen Sie sie mit 1 ml sterilem PBS (dreimal) aus.
- Beschallen Sie die Oberfläche 40 Minuten lang in 1 ml sterilem PBS. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der adhärenten Bakterien, indem Sie einen Lumineszenz-Assay an 100 μl der beschallten Probe durchführen, wie in Abschnitt 7 beschrieben.
Representative Results
Gemäß dem Protokoll wurde UHMWPE mit Gentamicin und Vancomycin bei 7 Gew.-% geformt und zu deionisiertem Wasser eluiert. Die Wirkstoffkonzentration im Eluenten aus dem Material wurde nach 6 h, 1 Tag, 2 Tagen, 3 Tagen und 1 Woche bestimmt. Die Wirkstofffreisetzung aus Vancomycin und Gentamicin-beladenem UHMWPE zeigte eine Burst-Freisetzung nach 6 h, gefolgt von einer konstanten Freisetzungsrate mit einer Freisetzungskonzentration, die größer als die minimale Hemmkonzentration (MHK) war, bis zu 7 Tagen (Abbildung 2, Tabelle 2).
Vor der antibakteriellen Studie wurde eine Standardkurve erstellt, um die Lumineszenzeinheiten mit der KBE/ml der Bakterien für jeden S. aureus-Stamm (ATCC 12600, L1101 und L1163) zu korrelieren. Die entsprechenden logarithmischen (Lumineszenz-)Werte wurden gegen den logarithmischen Wert (KBE/ml) aufgetragen, um eine Standardkurve zu erzeugen (Abbildung 3). Die berechneten R2 -Werte betrugen 0,997, 0,996 bzw. 0,994 für ATCC 12600, L1101 bzw. L1163, was auf eine starke Anpassung an den Konzentrationsbereich hinweist. Die abgeleitete Gleichung wurde anschließend verwendet, um die bakterielle Viabilität über alle Experimente hinweg zu berechnen. ATCC 12600 und L1101 zeigten eine Nachweisgrenze innerhalb eines Bereichs von 1 x 102-1 x 103 KBE/ml. Andererseits wurde gezeigt, dass die Nachweisgrenze für den L1163-Stamm bei 1 x 104 KBE/ml liegt.
Der zeitabhängige antibakterielle Aktivitätstest wurde unter Verwendung von 1 x 105 KBE/ml als Ausgangsinokulum für 12600, L1163 und L1101 durchgeführt, die über einen Zeitraum von 1 Woche mit 7 % w/w medikamentenfreisetzenden Materialien exponiert wurden. Zu jedem Zeitpunkt (6 h, 1 Tag, 2 Tage, 3 Tage, 1 Woche) wurde das Medium aufgefrischt und die Bakterienpopulation wieder suspendiert. Die Exposition der Bakterien gegenüber der anschließenden Freisetzung von Wirkstoffen aus dem Material wurde bis zum nächsten Zeitpunkt fortgesetzt. UHMWPE mit 7 Gew.-% Vancomycin und UHMWPE mit 7 Gew.-% Gentamycin zeigten eine Reduktion von >3 log für anfälliges ATCC 12600 ab 6 h, und eine vollständige Eradikation (kein Koloniewachstum) wurde nach 3 Tagen beobachtet (Abbildung 4A). Für den Gentamicin-empfindlichen und Vancomycin-Intermediärstamm L1163 verursachten beide wirkstofffreisetzenden Materialien eine >3log-Reduktion nach 6 h, und an Tag 1 des Experiments wurde eine vollständige Eradikation (kein Koloniewachstum) beobachtet (Abbildung 4B). Für den Gentamicin-resistenten und Vancomycin-Intermediärstamm L1101 hatte die Gentamicin-Elution aus UHMWPE keinen Einfluss auf die bakterielle Viabilität von L1101 (Abbildung 4C). Die Bakterien vermehrten sich und die Population stabilisierte sich innerhalb von 6 Stunden in Gegenwart von jungfräulichem UHMWPE ohne antibiotische Elution. In Gegenwart von Gentamicin-freisetzendem UHMWPE erreichte die Population an Tag 2 ein ähnliches Wachstumsniveau. Im Gegensatz dazu reduzierte die Vancomycin-Elution aus UHMWPE die bakterielle Lebensfähigkeit (>3log) nach 6 h signifikant, und ein vollständiger Lebensfähigkeitsverlust (kein Koloniewachstum) wurde an Tag 4 nachgewiesen.
Die Oberflächen sowohl von Gentamicin-freisetzenden als auch von Vancomycin-freisetzenden UHMWPE zeigten keine lebensfähigen anhaftenden Bakterien, wenn sie nach Tag 7 oder vollständiger Eradikation, je nachdem, was zuerst eintrat, anfälligen und mittelresistenten Stämmen ausgesetzt waren. Einige lebensfähige Bakterien (1 x 10,5 KBE/ml) waren auf Gentamicin-freisetzendem UHMWPE vorhanden, das mit Gentamicin-resistentem L1101 exponiert war. In ähnlicher Weise wurden etwa 1 x 10 5 KBE/ml lebensfähiger adhärenter Bakterien aus dem reinen Kontroll-PE gewonnen (Abbildung 5).
Abbildung 2: Zeitabhängige durchschnittliche Antibiotikafreisetzung aus 7 Gew.-% antibiotikabeladenem UHMWPE-Streifen. Die durchschnittliche Antibiotikafreisetzung zwischen den Zeitpunkten aus einem 7%igen Gentamicin- und Vancomycin-beladenen UHMWPE-Streifen (3 mm, 3 x 5 mm, 3 x 10 mm,3 ~ 2cm2 Oberfläche). Das MHK gegen den Kontrollstamm ATCC 12600 ist als gestrichelte Linie für Gentamicin und als durchgezogene Linie für Vancomycin dargestellt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts aus sechs Replikationen dar (n = 6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Echtzeit-Lumineszenz-Assay-Standardkurve für alle S. aureus-Stämme. Log (Lumineszenz) wurde gegen log (KBE/ml) aufgetragen, um Standardkurven für die Kontrolle, (A) ATCC 12600, und die klinischen Stämme, (B) L1101 und (C) L1163, zu erzeugen. Die Gleichungen, die die Ausgleichslinie und die entsprechendenR2-Werte beschreiben, sind in den Diagrammen angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Bestimmung der bakteriellen Viabilität mit einem Lumineszenz-Assay für 7 % w/w Gentamicin-eluierendes und 7 % w/w Vancomycin-freisetzendes UHMWPE. Die zeitabhängige antibakterielle Aktivität von Gentamicin und Vancomycin, die aus UHMWPE eluiert wurden, gegen Kontrollstämme, (A) ATCC 12600, und klinische Stämme, (B) L1163 und (C) L1101, wird gezeigt. Virgin 1020 PE diente als Kontrolle für das Experiment. Die gelbe Linie in den Diagrammen zeigt die Nachweisgrenze für den jeweiligen S. aureus-Stamm an. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Die Viabilität der adhärenten Bakterien wurde mit dem Lumineszenz-Assay Glo-Assay für 7 % w/w Gentamicin-freisetzendes und 7 % w/w Vancomycin-freisetzendes UHMWPE gegen alle S. aureus-Stämme bestimmt. Das Balkendiagramm zeigt an, dass adhärente Bakterien (KBE) am Ende des Studienzeitraums für alle getesteten Stämme pro Zentimeter zum Quadrat (cm2) von 7 % mit Gentamicin und 7 % Vancomycin-beladenem UHMWPE gewonnen wurden. Die Balken zeigen die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Zeitpunkte | Vancomycin | Gentamicin |
| Spitzenkonzentration (μg/ml) | Spitzenkonzentration (μg/ml) | |
| 0 - 6 h | 336 ± 72 | 263 ± 24 |
| 6 h -1 Tag | 57 ± 18 | 16 ± 2 |
| 1 Tag - 2 Tage | 60 ± 18 | 7 ± 1 |
| 2 Tage - 3 Tage | 23 ± 6 | 5 ± 0,4 |
| 3 Tage - 7 Tage | 49 ± 20 | 15 ± 1 |
Tabelle 2: Maximale Wirkstoffkonzentration (μg/ml) zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6) angezeigt.
Ergänzende Abbildung 2: Abklingen des Lumineszenzsignals über einen Zeitraum von 10 Minuten nach Zugabe von Assay-Reagenz zur Probe. Eine Signaldifferenz von ±5% wird als gestrichelte Linie dargestellt Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Die lokalisierte, anhaltende Verabreichung von Antibiotika ist ein notwendiges Instrument bei der Behandlung periprothetischer Gelenkinfektionen. Systemische Antibiotika sind die primäre Strategie zur Ausrottung bakterieller Infektionen, und die lokale Elution wird als ergänzendes Instrument verwendet, um das Wachstum und die Besiedlung von Bakterien zu verhindern, die nach der Entfernung des Implantats und dem Debridement des Gewebes verbleiben. Das Ziel für die effektive Fläche unter der Kurve (Konzentration über einen bestimmten Zeitraum) für Antibiotika mit lokaler Verabreichung ist nicht gut verstanden. Die Elution von Antibiotika aus solchen Geräten kann in vitro longitudinal quantifiziert werden; Um jedoch den translationalen Wert dieser Konzentrationsprofile zu bestimmen, ist eine robuste In-vitro-Methode zur Beurteilung der antibakteriellen Aktivität erforderlich. In dieser Arbeit wird eine solche Echtzeitmethode beschrieben, um die antibakterielle Aktivität von medikamentenfreisetzendem UHMWPE zu bestimmen, das als Vorrichtung für die verzögerte Verabreichung bei Gelenkersatz verwendet werden soll.
Die Echtzeitüberwachung der bakteriellen Lebensfähigkeit ist ein entscheidender Parameter von Interesse, und konventionellen mikrobiologischen Methoden fehlt der Rahmen, um diesen spezifischen Aspekt der Studie zu berücksichtigen. Der in dieser Studie verwendete mikrobielle Viabilitätstest wurde für die Quantifizierung lebensfähiger Bakterien durch Messung der Lumineszenz entsprechend Adenosintriphosphat (ATP) entwickelt. Um die zeitabhängige Aktivität der aus den Implantatmaterialien eluierten Antibiotika direkt zu untersuchen, wurden drei verschiedene Stämme mit unterschiedlichen Antibiotikaempfindlichkeitsprofilen mit ihnen inkubiert. Die Begründung für die Verwendung von Labor- und klinischen Stämmen mit unterschiedlichen Resistenzen gegen Gentamicin und Vancomycin bestand darin, den Wirkungsbereich einer bestimmten Implantatformulierung zu verstehen. Darüber hinaus hängen die antibakterielle Aktivität und Wirksamkeit gegen diese unterschiedlichen Populationen vom Zeitpunkt der Verabreichung ab. Die Methode konzentriert sich auf die Durchführbarkeit einer Prophylaxe gegen diese Stämme, da >70% der periprothetischen Gelenkinfektionen durch die Kontamination der Wunde zum Zeitpunkt der Operation verursacht werden24.
Als Ausgangsinokulum für die Entwicklung dieser Methode wurde 1 x 105 KBE/ml verwendet. Für Tiermodelle wurden unterschiedliche kontaminierende Konzentrationen verwendet, obwohl nicht viel über die klinisch relevante Infektionslast für PJI bekannt ist. Tierinfektionsmodelle für PJI wurden routinemäßig mit 1 x 105 KBE etabliert, und ein ähnlicher Bereich wird häufig in standardisierten Methoden (CLSI) verwendet, um die antibakterielle Aktivität zu bestimmen25,26,27. Die Verwendung von 1 x 105 KBE/ml als anfängliche kontaminierende Konzentration ermöglichte es uns, sowohl die Wachstums- als auch die Eradikationsparameter gleichzeitig zu bewerten.
Herkömmlicherweise werden MHK-Werte für eine konstante Antibiotikakonzentration für eine bestimmte Anzahl von Bakterien bestimmt und zeigen nicht die Rate der antibakteriellen Wirkung. Aufgrund dieses Aspekts bieten MHK-Werte keine quantitative Differenzierung zur Beschreibung des antimikrobiellen Aktivitätsprofils28. Die Daten der aktuellen Methode unterstreichen den Vorteil, die stammabhängige Abtötungskinetik von Antibiotika zu bewerten, anstatt das MHK zu verwenden, um Dosierungsentscheidungen zu treffen. Mit dieser Methode war es möglich, sowohl das Ausmaß als auch die Geschwindigkeit zu unterscheiden, mit der die Implantatmaterialien auf die verschiedenen Dehnungen einwirkten. Gentamicin, das aus den Implantatmaterialstreifen eluiert wurde, war wirksam bei der Eradikation von L1163 in 1 Tag und bei der Eradikation von ATCC 12600 in 2-3 Tagen, aber es war unwirksam bei der Eradikation von L1101 (Abbildung 4). Neben der zu erwartenden fehlenden Aktivität der Gentamicin-Elution gegen L1101 (MHK >32 μg/ml) aufgrund der inhärenten Gentamicin-Resistenz (Abbildung 4C) wurde die Persistenz von Subpopulationen beobachtet, wenn sie Vancomycin ausgesetzt waren, für das L1101 eine mittlere Resistenz aufweist. Im Gegensatz dazu wurde L1163 in Gegenwart von Vancomycin-freisetzendem UHMWPE definitiv eliminiert, obwohl es eine ähnliche mittlere Resistenz gegen Vancomycin wie L1101 aufwies (für beide Stämme wurde ein MHK von 8 μg/ml beobachtet).
Die Beobachtungen, dass die Aktivitätsrate von Gentamicin gegenüber 12600 und L1163, die bei ähnlichen MHK-Werten gentamicinempfindlich sind (für beide Stämme wurde eine MHK von 1 μg/ml beobachtet), unterschiedlich war, sowie dass das Ausmaß der Aktivität von Vancomycin gegen die intermediärresistenten L1101 und L1163 unterschiedlich war (Abbildung 4A,B) unterstützte die Hypothese, dass diese Echtzeitmethode in Gegenwart des eluierenden Materials longitudinale Unterschiede in der Aktivität differenzieren könnte.
Neben dem translationalen Wert der Ergebnisse bei der Interpretation, wie wirksam eine bestimmte eluierte Konzentration gegen diese Bakterien sein kann, gibt es mehrere experimentelle methodische Vorteile. (1) Die Bakterienkonzentration wird sofort zu einem bestimmten Zeitpunkt bestimmt, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, bei denen die Bakterien in Brühe oder auf Agar für 18-24 h inkubiert werden, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Diese Wachstumsphase kann den Bakterien zusätzliche Zeit geben, sich von Antibiotikastress zu erholen, was eine zusätzliche mögliche Fehlerquelle/Variabilität darstellt. (2) Das Medium wird kontinuierlich ausgetauscht, während die Bakterien erhalten bleiben, was eher In-vivo-Bedingungen als statischen Bedingungen ähnelt. (3) Dieser Assay beinhaltet von Natur aus die Wirkstofffreisetzungskinetik des Implantats, was eine bessere Leistungsvorhersage ermöglicht. (4) Das Verfahren wurde unter Verwendung allgemein verfügbarer Verbrauchsmaterialien entwickelt, ohne dass spezielle oder teure Maschinen erforderlich sind.
Robuste In-vitro-Testmethoden zur Bewertung von Arzneimittelverabreichungsanwendungen sind erforderlich, bevor In-vivo-Tierstudien und klinische Studien durchgeführt werden. Dieser Assay kann modifiziert und angepasst werden, um verschiedene Ansätze und Wirkstoffverabreichungsplattformen wie Partikel, Gele, Filme und andere wirkstofffreisetzende Materialien zu berücksichtigen, um die Effizienz der bakteriellen Eradikation in einem simulierten In-vitro-Aufbau zu bestimmen. Modifikationen für den Probenaufbau können durchgeführt werden, indem in eine geeignete In-vitro-Mediumumgebung gewechselt wird, die nachweislich die Aktivität mehrerer Antibiotika beeinflusst29,30.
Die Methode ermöglicht auch die Bestimmung von praktikablen adhärenten Bakterien, was vielversprechend ist, da herkömmliche Methoden zur Bestimmung der minimalen Biofilm-Eradikationskonzentration zeitaufwändig sind und inkonsistente Ergebnisse liefern. Die Methode soll jedoch rigoros an Biofilmen getestet werden, um eine zuverlässige und robuste Methodik zur Bestimmung ihrer Sensitivität zu entwickeln. Die ATP-basierte Lumineszenzmethode könnte empfindlich genug sein, um lebensfähige Formen von Bakterien in Biofilmen einschließlich Persistern nachzuweisen, die auf einer Agarplatte als sichtbare Kolonien nachgewiesen werden können oder auch nicht. Zusammengenommen hat diese vielseitige Plattform das Potenzial, relevante Parameter zu integrieren, um Echtzeit-Beobachtungen über die antibakterielle und Anti-Biofilm-Aktivität von Medikamenten von Interesse aufzuzeichnen.
Die Wirksamkeit dieser Methode hängt von folgenden Aspekten ab:
Vorgegebene Elutionseigenschaften und Probengröße
Das Elutionsprofil des antibiotikafreisetzenden Materials kann in einem separaten Experiment vor dieser antibakteriellen Aktivitätsmessung identifiziert werden, so dass die Menge an Material, die für die aktive Durchführung des Experiments innerhalb einer vorgegebenen Zeit erforderlich ist, bestimmt werden kann.
Behälter- und Volumenbestimmung
Es ist wichtig, einen Aufbau zu entwickeln, bei dem das Medienvolumen des Experiments die gesamte Oberfläche desselben Materials aufnehmen kann und ein ausreichendes Volumen für die ungehinderte Freisetzung des Wirkstoffs von der wirkstoffbeladenen Oberfläche gewährleistet ist. Der verwendete Aufbau basierte auf früheren Experimenten, um "perfekte Senkenbedingungen" für diese hydrophilen Wirkstoffe zu gewährleisten, so dass ihre Diffusion nicht durch Löslichkeitsbeschränkungen behindert wird.
Eigenschaften von Nährmedien
Die Auswahl der Nährmedien sollte untersucht werden, um die Stabilität und die optimale Leistung des/der ausgewählten Arzneimittel(s) zu gewährleisten29. Kationenangepasste Mueller-Hinton-Bouillon (CAMHB), die in der Brühenverdünnungsmethode weit verbreitet ist, wurde verwendet, um die MHK bekannter Antibiotika zu bestimmen. Das Medium ermöglicht eine optimale Wirkstoffaktivität ohne die Interferenz der toxischen Sekundärmetabolitenakkumulation31. Das Assay-Reagenz wurde getestet und als stabil in verschiedenen Arten von Medien beschrieben, einschließlich solcher mit Serumkomponenten23,28. Obwohl die relativen Werte der Lumineszenzeinheit zwischen verschiedenen Medien variieren können, wurde gezeigt, dass die Komponenten des Mediums den Assaynicht beeinträchtigen 32,33. Das experimentelle Volumen wurde weiter auf 1,5 ml optimiert, was nahe am Volumen der Synovialflüssigkeit in einem erwachsenen Kniegelenksraumliegt 34.
Temperaturstabilität für den Assay
Die Handhabung und Zugabe des lumineszierenden Reagenzes zum Assay soll über alle Experimente hinweg einheitlich erfolgen. Temperaturänderungen verändern die Empfindlichkeit des Assays, daher ist es wichtig, das Reagenz 2 h lang bei Raumtemperatur zu inkubieren, bevor es zu den Bakterien gegeben wird23.
Inkubationszeit der Reagenzien
Die Lumineszenz des Reagenzes nimmt mit der Zeit ab. Das Lumineszenzsignal hat eine Halbwertszeit von über 30 min, die weitgehend vom Medium und der Art des im Experiment verwendeten Bakteriums abhängt23. Darüber hinaus führen Unterschiede in der Inkubationszeit (d. h. die Zeit zwischen der Zugabe des Reagenzes zu den Bakterien und dem Ablesen der Lumineszenz) zu inkonsistenten Messwerten für die gleiche Bakterienkonzentration. Es wurde ein Unterschied von 5 % im Lumineszenzsignal beobachtet, wenn es innerhalb von 1 Minute nach der Inkubationszeit von 5 Minuten gemäß den Anweisungen des Herstellers eingenommen wurde (ergänzende Abbildung 2). Unter Berücksichtigung dieser Daten wurden die Lumineszenzmesswerte während der gesamten Studie innerhalb von 1 Minute aufgezeichnet, um sicherzustellen, dass der Signalverlust nicht mehr als 5 % betrug. Darüber hinaus ist es wichtig, die Anzahl der Proben pro Platte zu begrenzen, um den Fehler zu reduzieren, der durch den Lumineszenzabfall von der ersten Vertiefung zur letzten Vertiefung entsteht.
Aufrechterhaltung der Bakterienpopulation während der gesamten Studie
Die Methode versuchte, die Wirkstoffclearance und den synovialen Volumenumsatz zu modellieren, indem das verbrauchte Medium zu jedem Zeitpunkt kontinuierlich von der Bakterienpopulation getrennt wurde, indem eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation bei 10.000 x g für 10 min35 verwendet wurde. Dieser kritische Schritt stellt die Sedimentation aller lebensfähigen und nicht lebensfähigen Bakterienzellen sicher. Darüber hinaus werden die sedimentierten Bakterien gleichmäßig in frischem MHB rekonstituiert und in den Spritzenaufbau übertragen, was die vollständige Übertragung der betroffenen mikrobiellen Population zurück in den Versuchsaufbau erleichtert. Die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit dieser Methode hängt stark von der Simulation der anhaltenden Exposition von Antibiotika gegenüber der mikrobiellen Population ab, die aus dem ursprünglichen Inokulum stammt.
Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass es sich um einen semistatischen Assay handelt, der die Halbwertszeiten des Arzneimittels und den kontinuierlichen Synovialumsatz nicht genau simuliert. Der kontinuierliche Austausch des Mediums kompensiert diese Einschränkung jedoch teilweise. Die Sensitivität des mikrobiellen Viabilitätstests war stammabhängig und reichte von 1 x 102-1 x 104 KBE/ml, was die Nachweisfähigkeit einschränkt. Darüber hinaus muss für jeden Organismus eine Standardkurve gezeichnet werden, da der Stammtyp zur Empfindlichkeit und Leistung des lumineszierenden Reagenzes beiträgt. Sowohl die Wachstumsdynamik der Bakterien als auch die Aktivität des verwendeten Wirkstoffs können durch die Mediumkomponenten beeinflusst werden, was weiter untersucht werden sollte.
Disclosures
Der Seniorautor (E.O.) erhält Lizenzgebühren aus der Lizenzierung von geistigem Eigentum an die folgenden Unternehmen: Corin, Iconacy, Renovis, Arthrex, ConforMIS, Meril Healthcare, Exactech. Es besteht kein Interessenkonflikt mit einer der hier vorgestellten Studien.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch den National Institutes of Health Grant Nr. AR077023 (R01) und durch das Harris Orthopaedic Laboratory finanziert. Die Autoren danken Dr. Kerry Laplante und ihrem Team an der University of Rhode Island für die Bereitstellung der klinischen Stämme L1101 und L1163.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates - polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
| ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
| BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
| BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
| BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
| Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
| Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
| Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
| Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
| Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
| Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
| Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
| Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
| Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
| press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
| ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
| Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
| UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
| Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
| WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |
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