Her presenterer vi en protokoll for å evaluere den antibakterielle effekten av en antibiotika-eluerende polymer for å simulere profylaktisk klinisk anvendelse ved å bruke en kommersielt tilgjengelig sanntids ATP-basert luminescerende mikrobiell levedyktighetsanalyse. Denne metoden muliggjør overvåking av den langsgående aktiviteten til medikamenteluerende materialer og kan tilpasses bredt for å teste antimikrobielle legemiddelleveringsplattformer.
Polyetylen med ultrahøy molekylvekt (UHMWPE) er mye brukt i totale leddartroplastikker som en bærende overflate. Periprostetiske leddinfeksjoner, hvorav de fleste oppstår kort tid etter leddprotese, utgjør nesten 25% av totale knerevisjonsoperasjoner, og fullstendig utryddelse av bakteriell infeksjon utgjør en stor utfordring. En lovende måte å takle dette problemet på er å sikre lokal vedvarende levering av antibiotikakonsentrasjoner som er tilstrekkelige til å hemme bakteriene for å støtte rutinemessig systemisk antibiotikaprofylakse. Det er økt forskning på utvikling av effektive lokale legemiddelleveringsenheter. Selv om etablerte antibakterielle testmetoder for legemidler kan brukes til å teste den antibakterielle effekten av narkotikaeluerende materialer, mangler de når det gjelder å gi sanntids og langsgående antibakterielle effektdata som kan korreleres med elueringsprofilene til antibiotika fra disse enhetene. Her rapporterer vi en direkte og allsidig metodikk for å bestemme den antibakterielle effekten av antibiotika-eluerende UHMWPE-implantater. Denne metoden kan brukes som en plattform for å unngå bakteriekultur på hvert tidspunkt i et langvarig eksperiment, og kan også tilpasses andre lokale legemiddelleveringsenheter.
Slitasjegikt er en betydelig degenerativ tilstand som rammer 500 millioner voksne over hele verden1. Gullstandarden i behandlingen av leddgikt i sluttstadiet er total leddutskifting, som forventes å bli utført hos over 2 millioner pasienter årlig i USA alene innen 20302, med global etterspørsel som også øker enormt 3,4. Prosedyren innebærer utskifting av leddbruskoverflatene i leddene med bærende syntetiske materialer laget av metall / keramikk og høyt tverrbundet polyetylen med ultrahøy molekylvekt (UHMWPE). Totale leddutskiftninger forbedrer livskvaliteten betydelig for pasienter som lider av leddgikt5, men en betydelig komplikasjon som truer ytelsen til implantatene og tilfredsstillelsen til pasientene er periprostetisk leddinfeksjon (PJI), som står for 15% -25% av revisjonsoperasjonene6. Årsaken til infeksjon antas i de fleste tilfeller å være mikrobiell forurensning av implantatstedet under operasjon7. Den forurensende populasjonen utvider seg deretter på implantat- og vevsoverflatene8. Vertsimmunsystemet utløses som respons, men veksthastigheten og biofilmdannelsen av de forurensende organismene kan gjøre dem i stand til å unngå immuncellene, noe som kan føre til en økt cytokin- og kjemokinstorm uten utryddelse av bakteriene 9,10,11. Den resulterende dype infeksjonen i beinet truer implantatets fiksering og ytelse, så vel som pasientens helse12.
Staphylococcus aureus og koagulase-negative stafylokokker er de dominerende årsaksorganismer av PJI13. Alvorlighetsgraden av stafylokokkinfeksjoner er høy på grunn av deres økte resistens mot antibiotika, biofilmdannelse og evne til å vedvare som små kolonivarianter14,15,16. Implantatassosierte infeksjoner oppstår på grunn av vedheft av mikroorganismer på overflaten av implantatet og etablering av en kompleks biofilmmatrise som gjør det mulig for bakteriene å unngå skadelige vertsimmunfaktorer og effektive konsentrasjoner av antibiotika14,15,16. Konvensjonelle behandlingsmetoder inkluderer intravenøse og orale antibiotikakombinasjoner i en lengre periode17. En stor ulempe ved denne tilnærmingen er den lave biotilgjengeligheten av stoffet på infeksjonsstedet og vanskeligheten med å oppnå tilstrekkelige konsentrasjoner av antibiotika for å utrydde bakteriene konsekvent over behandlingsperioden, noe som ofte resulterer i dårlige resultater18. For å løse disse manglene ble et fullt funksjonelt lokalisert medikamenteluerende UHMWPE-implantat designet for å sikre en vedvarende frigjøring av effektive konsentrasjoner av antibiotika i fellesrommet19. Lokal eluering fra det medikamenteluerende implantatet brukes som et komplementært verktøy for å forhindre vekst og kolonisering av eventuelle bakterier som er igjen etter implantatfjerning og debridement av vevet. In vitro antibakteriell testing av denne antibiotika-eluerende UHMWPE kan utføres ved å inkubere materialet direkte med bakteriene og kvantifisere bakteriene ved spredningsplatemetoden20,21. Alternativt kan alikoter av eluent media testes mot bakterier ved hjelp av metoder som agardiskdiffusjonsmetoden, buljongfortynningsmetoder og tidsdrepende testing22. Alle disse metodene er avhengige av vekstobservasjon ca. 16-18 timer etter innsamling av alikotene ved hjelp av kolonitelling og turbiditetsmålinger. Elusjonen av antibiotika fra slike enheter kan kvantifiseres i lengderetningen ved hjelp av disse in vitro-metodene; For å bestemme translasjonsverdien av disse konsentrasjonsprofilene, er det imidlertid nødvendig med en robust in vitro-metode i sanntid for å vurdere antibakteriell aktivitet.
Den mikrobielle levedyktighetsanalysen som ble brukt i denne studien, ble utviklet for kvantifisering av levedyktige bakterier ved å måle luminescensen tilsvarende adenosintrifosfat (ATP) frigjort fra en levende bakteriecelle ved bruk av luciferin-luciferasebasert deteksjonsteknologi. ATP, som energivalutaen til levende celler, tjener som en direkte indikator på fysiologisk levedyktige celler. Reagenset utfører cellelyse, som frigjør ATP-molekyler fra levedyktige celler som deretter detekteres i form av luminescens. Denne luminescensen har en direkte sammenheng med andelen levedyktige bakterieceller i prøven23. Dette er en sanntids, enkel, allsidig, rask, enkelt reagensbasert analyse som kan tilpasses til en rekke analysedesign og forhold med både gram-positive og gram-negative mikroorganismer. Her rapporterer vi en metode for å bestemme sanntids antibakteriell aktivitet av antibiotika-eluerende UHMWPE inkubert med laboratorie- og kliniske stammer av S. aureus ved hjelp av en modifisert tidsdrepende analyse basert på den mikrobielle levedyktighetsanalysen (f.eks. BacTiter Glo). Mens metodikken er beskrevet med et spesifikt implantatmateriale og en spesifikk ortopedisk applikasjon, kan metoden gi en plattform for testing av andre antibiotika-eluerende leveringsenheter med kliniske applikasjoner.
Den lokaliserte vedvarende levering av antibiotika er et nødvendig verktøy i behandlingen av periprostetiske leddinfeksjoner. Systemiske antibiotika er den primære strategien for å utrydde bakteriell infeksjon, og lokal eluering brukes som et komplementært verktøy for å forhindre vekst og kolonisering av eventuelle bakterier som er igjen etter implantatfjerning og debridement av vevet. Målet for effektivt areal under kurven (konsentrasjon over en periode) for antibiotika med lokal administrasjon er lite forstått. Elusjonen av antibiotika fra slike enheter kan kvantifiseres i lengderetningen in vitro; For å bestemme translasjonsverdien av disse konsentrasjonsprofilene er det imidlertid nødvendig med en robust in vitro-metode for å vurdere antibakteriell aktivitet. I dette papiret er en slik sanntidsmetode beskrevet for å bestemme den antibakterielle aktiviteten til narkotika-eluerende UHMWPE som skal brukes som en vedvarende leveringsenhet i leddutskiftninger.
Sanntidsovervåking av bakteriell levedyktighet er en avgjørende parameter av interesse, og konvensjonelle mikrobiologiske metoder mangler rammeverket for å imøtekomme dette spesifikke aspektet av studien. Den mikrobielle levedyktighetsanalysen som ble brukt i denne studien ble utviklet for kvantifisering av levedyktige bakterier ved å måle luminescensen tilsvarende adenosintrifosfat (ATP). For direkte å undersøke den tidsavhengige aktiviteten til antibiotika eluert fra implantatmaterialene, ble tre forskjellige stammer med forskjellige antibiotikafølsomhetsprofiler inkubert med dem. Begrunnelsen for å bruke laboratorie- og kliniske stammer med varierende resistens mot gentamicin og vankomycin var å forstå aktivitetsområdet for en gitt implantatformulering. Videre er den antibakterielle aktiviteten og effekten mot disse forskjellige populasjonene avhengig av tidspunktet for administrering. Metoden fokuserer på muligheten for profylakse mot disse stammene basert på at >70% av periprostetiske leddinfeksjoner skyldes forurensning av såret på operasjonstidspunktet24.
Som startinokulum for å utvikle denne metoden ble 1 x 105 CFU / ml brukt. Ulike forurensende konsentrasjoner har blitt brukt til dyremodeller, men det er ikke mye kjent om den klinisk relevante infeksjonsbelastningen for PJI. Dyreinfeksjonsmodeller for PJI er rutinemessig etablert ved bruk av 1 x 105 CFU, og et lignende utvalg er mye brukt i standardiserte metoder (CLSI) for å bestemme antibakteriell aktivitet25,26,27. Ved å bruke 1 x 105 CFU / ml som en innledende forurensende konsentrasjon tillot oss å evaluere både vekst- og utryddelsesparametrene samtidig.
Konvensjonelt bestemmes MIC-verdier for en konstant antibiotikakonsentrasjon for et bestemt antall bakterier, og de klarer ikke å demonstrere frekvensen av antibakteriell virkning. På grunn av dette aspektet gir MIC-verdier ikke en kvantitativ differensiering for å beskrive den antimikrobielle aktivitetsprofilen28. Dataene fra den nåværende metoden understreker fordelen ved å evaluere den belastningsavhengige drapskinetikken til antibiotika i stedet for å bruke MIC til å ta doseringsbeslutninger. Ved hjelp av denne metoden var det mulig å differensiere både i hvilken grad og hastigheten implantatmaterialene påvirket de forskjellige stammene. Gentamicin eluert fra strimlene av implantatmaterialet var effektivt i å utrydde L1163 på 1 dag og utrydde ATCC 12600 på 2-3 dager, men det var ineffektivt i å utrydde L1101 (figur 4). I tillegg til den forventede mangelen på aktivitet av gentamicineluering mot L1101 (MIC >32 μg/ml) på grunn av dets iboende gentamicinresistens (figur 4C), ble det observert persistens av subpopulasjoner ved eksponering for vankomycin, hvor L1101 viser middels resistens. I kontrast ble L1163 definitivt utryddet i nærvær av vankomycin-eluerende UHMWPE til tross for at den viste lignende middels resistens mot vankomycin som L1101 (en MIC på 8 μg / ml er observert for begge stammer).
Observasjonene om at gentamicins aktivitetsrate mot 12600 og L1163, som er gentamicinfølsomme med lignende MIC-verdier (en MIC på 1μg/ml er observert for begge stammer), var forskjellig, samt at aktivitetsgraden av vankomycin mot middels resistent L1101 og L1163 var forskjellig (figur 4A,B), støttet hypotesen om at denne sanntidsmetoden i nærvær av elueringsmaterialet kunne skille langsgående forskjeller i aktiviteten.
I tillegg til den translasjonelle verdien av resultatene i å tolke hvor effektiv en gitt eluert konsentrasjon kan være mot disse bakteriene, er det flere eksperimentelle metodologiske fordeler. (1) Bakteriekonsentrasjonen bestemmes øyeblikkelig på et gitt tidspunkt, i motsetning til konvensjonelle metoder der bakteriene inkuberes i buljong eller på agar i 18-24 timer for å bestemme levedyktigheten. Denne vekstperioden kan gi ekstra tid for bakteriene å komme seg fra antibiotikastress, og introdusere en ekstra mulig feilkilde / variabilitet. (2) Mediet skiftes kontinuerlig ut samtidig som bakteriene, som ligner mer in vivo-forhold beholder enn statiske forhold. (3) Denne analysen inkluderer iboende legemiddelfrigivelseskinetikken fra implantatet, noe som muliggjør bedre ytelsesprediksjon. 4) Metoden er utviklet ved bruk av vanlig tilgjengelige forbruksvarer uten behov for spesifikke eller dyre maskiner.
Robuste in vitro-testmetoder for å evaluere applikasjoner for legemiddellevering er nødvendig før du går videre til in vivo dyreforsøk og kliniske studier. Denne analysen kan modifiseres og tilpasses for å imøtekomme ulike tilnærminger og legemiddelleveringsplattformer som partikler, geler, filmer og andre medikamenteluerende materialer for å bestemme effektiviteten av bakteriell utryddelse i et simulert in vitro-oppsett. Modifikasjoner kan utføres for prøveoppsettet ved å bytte til et egnet in vitro mediummiljø, som har vist seg å påvirke aktiviteten til flere antibiotika29,30.
Metoden muliggjør også levedyktig fastsettelse av adherente bakterier, noe som er lovende, da konvensjonelle metoder for å bestemme minimum biofilmutryddelseskonsentrasjon er tidkrevende og gir inkonsekvente resultater. Metoden skal imidlertid testes grundig på biofilm for å utvikle en pålitelig og robust metodikk for å bestemme følsomheten. Den ATP-baserte luminescerende metoden kan være følsom nok til å oppdage levedyktige former for bakterier i biofilmer, inkludert persisters, som kanskje eller ikke kan oppdages på en agarplate som synlige kolonier. Samlet sett har denne allsidige plattformen potensial til å inkorporere relevante parametere for å registrere sanntidsobservasjoner av antibakteriell og anti-biofilmaktivitet av legemidler av interesse.
Effekten av denne metoden styres av følgende aspekter:
Forhåndsbestemte elueringsegenskaper og prøvestørrelse
Elusjonsprofilen til det antibiotikaeluerende materialet kan identifiseres i et separat eksperiment før denne antibakterielle aktivitetsmålingen, slik at mengden materiale som kreves for å aktivt gjennomføre forsøket innen en fastsatt tid, kan bestemmes.
Bestemmelse av beholder og volum
Det er viktig å utarbeide et oppsett der medievolumet av forsøket kan romme hele overflaten av det samme materialet og for å sikre tilstrekkelig volum for uhindret frigjøring av legemidlet fra den stoffbelastede overflaten. Oppsettet som ble brukt var basert på tidligere eksperimenter, og sikret “perfekte vask” -forhold for disse hydrofile legemidlene slik at deres diffusjon ikke hindres av løselighetsbegrensninger.
Egenskaper ved vekstmedier
Seleksjon av vekstmedier bør undersøkes for å sikre stabilitet og optimal ytelse for det valgte stoffet/stoffene29. Kationjustert Mueller Hinton-buljong (CAMHB), som er mye brukt i buljongfortynningsmetoden, ble brukt til å bestemme MIC av kjente antibiotika. Mediet muliggjør optimal legemiddelaktivitet uten interferens av toksisk sekundær metabolittakkumulering31. Analysereagenset er testet og rapportert stabilt i ulike typer medier, inkludert de med serumkomponenter23,28. Selv om de relative luminescensenhetsverdiene kan variere på tvers av forskjellige medier, har komponentene i mediet vist seg å ikke forstyrre analysen32,33. Det eksperimentelle volumet ble videre optimalisert til 1,5 ml, som er nær synovialvæskevolumet som er tilstede i et voksent kneleddsrom34.
Temperaturstabilitet for analysen
Håndtering og tilsetning av det luminescerende reagenset til analysen skal utføres på en konsistent måte på tvers av eksperimenter. Temperaturendringer endrer følsomheten til analysen, så det er viktig å inkubere reagenset ved romtemperatur i 2 timer før det tilsettes bakteriene23.
Reagens inkubasjonstid
Luminescensen fra reagenset henfaller med tiden. Det selvlysende signalet har en halveringstid på over 30 min, noe som i stor grad er avhengig av mediet og typen bakterie som brukes i forsøket23. I tillegg vil eventuelle forskjeller i inkubasjonstid (dvs. tiden mellom tilsetning av reagenset til bakteriene og lesing av luminescensen) resultere i inkonsekvente avlesninger for samme konsentrasjon av bakterier. En forskjell på 5 % ble observert i det selvlysende signalet når det ble tatt innen 1 minutt etter inkubasjonstiden på 5 minutter i henhold til produsentens instruksjoner (tilleggsfigur 2). Ved å ta hensyn til disse dataene ble luminescensavlesningene registrert innen 1 minutt gjennom hele studien for å sikre at signaltapet ikke var mer enn 5%. Videre er det viktig å begrense antall prøver per plate for å redusere feilen som oppstår på grunn av luminescenshenfall fra første brønn til siste brønn.
Vedlikehold av bakteriepopulasjonen gjennom hele studien
Metoden forsøkte å modellere legemiddelclearance og synovialvolumomsetning ved kontinuerlig å separere de brukte mediene fra bakteriepopulasjonen på hvert tidspunkt ved hjelp av høyhastighets sentrifugering ved 10.000 x g i 10 min35. Dette kritiske trinnet sikrer sedimentering av alle levedyktige og ikke-levedyktige bakterieceller. Videre til dette blir de sedimenterte bakteriene jevnt rekonstituert i fersk MHB og overført til sprøyteoppsettet, noe som letter fullstendig overføring av den berørte mikrobielle populasjonen tilbake til det eksperimentelle oppsettet. Reproduserbarheten og påliteligheten til denne metoden er sterkt avhengig av å simulere vedvarende eksponering av antibiotika til den mikrobielle populasjonen avledet fra det første inokulumet.
En viktig begrensning ved denne metoden er at det er en semi-statisk analyse som ikke nøyaktig simulerer halveringstider og kontinuerlig synovial omsetning. Kontinuerlig middels utskifting kompenserer imidlertid delvis for denne begrensningen. Sensitiviteten til den mikrobielle levedyktighetsanalysen var belastningsavhengig, fra 1 x 102-1 x 104 CFU / ml, noe som begrenser deteksjonsevnen. Videre må en standardkurve plottes for hver organisme ettersom stammetypen bidrar til følsomheten og ytelsen til det luminescerende reagenset. Både bakterievekstdynamikken og aktiviteten til den brukte legemiddelforbindelsen kan påvirkes av mediumkomponentene, som bør undersøkes nærmere.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis finansiert av National Institutes of Health Grant No. AR077023 (R01) og av Harris Orthopedic Laboratory. Forfatterne takker Dr. Kerry Laplante og hennes team ved University of Rhode Island for å gi de kliniske stammene L1101 og L1163.
96 well plates – polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |