Summary

En ny metode for å bestemme den langsgående antibakterielle aktiviteten til stoffeluerende materialer

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å evaluere den antibakterielle effekten av en antibiotika-eluerende polymer for å simulere profylaktisk klinisk anvendelse ved å bruke en kommersielt tilgjengelig sanntids ATP-basert luminescerende mikrobiell levedyktighetsanalyse. Denne metoden muliggjør overvåking av den langsgående aktiviteten til medikamenteluerende materialer og kan tilpasses bredt for å teste antimikrobielle legemiddelleveringsplattformer.

Abstract

Polyetylen med ultrahøy molekylvekt (UHMWPE) er mye brukt i totale leddartroplastikker som en bærende overflate. Periprostetiske leddinfeksjoner, hvorav de fleste oppstår kort tid etter leddprotese, utgjør nesten 25% av totale knerevisjonsoperasjoner, og fullstendig utryddelse av bakteriell infeksjon utgjør en stor utfordring. En lovende måte å takle dette problemet på er å sikre lokal vedvarende levering av antibiotikakonsentrasjoner som er tilstrekkelige til å hemme bakteriene for å støtte rutinemessig systemisk antibiotikaprofylakse. Det er økt forskning på utvikling av effektive lokale legemiddelleveringsenheter. Selv om etablerte antibakterielle testmetoder for legemidler kan brukes til å teste den antibakterielle effekten av narkotikaeluerende materialer, mangler de når det gjelder å gi sanntids og langsgående antibakterielle effektdata som kan korreleres med elueringsprofilene til antibiotika fra disse enhetene. Her rapporterer vi en direkte og allsidig metodikk for å bestemme den antibakterielle effekten av antibiotika-eluerende UHMWPE-implantater. Denne metoden kan brukes som en plattform for å unngå bakteriekultur på hvert tidspunkt i et langvarig eksperiment, og kan også tilpasses andre lokale legemiddelleveringsenheter.

Introduction

Slitasjegikt er en betydelig degenerativ tilstand som rammer 500 millioner voksne over hele verden1. Gullstandarden i behandlingen av leddgikt i sluttstadiet er total leddutskifting, som forventes å bli utført hos over 2 millioner pasienter årlig i USA alene innen 20302, med global etterspørsel som også øker enormt 3,4. Prosedyren innebærer utskifting av leddbruskoverflatene i leddene med bærende syntetiske materialer laget av metall / keramikk og høyt tverrbundet polyetylen med ultrahøy molekylvekt (UHMWPE). Totale leddutskiftninger forbedrer livskvaliteten betydelig for pasienter som lider av leddgikt5, men en betydelig komplikasjon som truer ytelsen til implantatene og tilfredsstillelsen til pasientene er periprostetisk leddinfeksjon (PJI), som står for 15% -25% av revisjonsoperasjonene6. Årsaken til infeksjon antas i de fleste tilfeller å være mikrobiell forurensning av implantatstedet under operasjon7. Den forurensende populasjonen utvider seg deretter på implantat- og vevsoverflatene8. Vertsimmunsystemet utløses som respons, men veksthastigheten og biofilmdannelsen av de forurensende organismene kan gjøre dem i stand til å unngå immuncellene, noe som kan føre til en økt cytokin- og kjemokinstorm uten utryddelse av bakteriene 9,10,11. Den resulterende dype infeksjonen i beinet truer implantatets fiksering og ytelse, så vel som pasientens helse12.

Staphylococcus aureus og koagulase-negative stafylokokker er de dominerende årsaksorganismer av PJI13. Alvorlighetsgraden av stafylokokkinfeksjoner er høy på grunn av deres økte resistens mot antibiotika, biofilmdannelse og evne til å vedvare som små kolonivarianter14,15,16. Implantatassosierte infeksjoner oppstår på grunn av vedheft av mikroorganismer på overflaten av implantatet og etablering av en kompleks biofilmmatrise som gjør det mulig for bakteriene å unngå skadelige vertsimmunfaktorer og effektive konsentrasjoner av antibiotika14,15,16. Konvensjonelle behandlingsmetoder inkluderer intravenøse og orale antibiotikakombinasjoner i en lengre periode17. En stor ulempe ved denne tilnærmingen er den lave biotilgjengeligheten av stoffet på infeksjonsstedet og vanskeligheten med å oppnå tilstrekkelige konsentrasjoner av antibiotika for å utrydde bakteriene konsekvent over behandlingsperioden, noe som ofte resulterer i dårlige resultater18. For å løse disse manglene ble et fullt funksjonelt lokalisert medikamenteluerende UHMWPE-implantat designet for å sikre en vedvarende frigjøring av effektive konsentrasjoner av antibiotika i fellesrommet19. Lokal eluering fra det medikamenteluerende implantatet brukes som et komplementært verktøy for å forhindre vekst og kolonisering av eventuelle bakterier som er igjen etter implantatfjerning og debridement av vevet. In vitro antibakteriell testing av denne antibiotika-eluerende UHMWPE kan utføres ved å inkubere materialet direkte med bakteriene og kvantifisere bakteriene ved spredningsplatemetoden20,21. Alternativt kan alikoter av eluent media testes mot bakterier ved hjelp av metoder som agardiskdiffusjonsmetoden, buljongfortynningsmetoder og tidsdrepende testing22. Alle disse metodene er avhengige av vekstobservasjon ca. 16-18 timer etter innsamling av alikotene ved hjelp av kolonitelling og turbiditetsmålinger. Elusjonen av antibiotika fra slike enheter kan kvantifiseres i lengderetningen ved hjelp av disse in vitro-metodene; For å bestemme translasjonsverdien av disse konsentrasjonsprofilene, er det imidlertid nødvendig med en robust in vitro-metode i sanntid for å vurdere antibakteriell aktivitet.

Den mikrobielle levedyktighetsanalysen som ble brukt i denne studien, ble utviklet for kvantifisering av levedyktige bakterier ved å måle luminescensen tilsvarende adenosintrifosfat (ATP) frigjort fra en levende bakteriecelle ved bruk av luciferin-luciferasebasert deteksjonsteknologi. ATP, som energivalutaen til levende celler, tjener som en direkte indikator på fysiologisk levedyktige celler. Reagenset utfører cellelyse, som frigjør ATP-molekyler fra levedyktige celler som deretter detekteres i form av luminescens. Denne luminescensen har en direkte sammenheng med andelen levedyktige bakterieceller i prøven23. Dette er en sanntids, enkel, allsidig, rask, enkelt reagensbasert analyse som kan tilpasses til en rekke analysedesign og forhold med både gram-positive og gram-negative mikroorganismer. Her rapporterer vi en metode for å bestemme sanntids antibakteriell aktivitet av antibiotika-eluerende UHMWPE inkubert med laboratorie- og kliniske stammer av S. aureus ved hjelp av en modifisert tidsdrepende analyse basert på den mikrobielle levedyktighetsanalysen (f.eks. BacTiter Glo). Mens metodikken er beskrevet med et spesifikt implantatmateriale og en spesifikk ortopedisk applikasjon, kan metoden gi en plattform for testing av andre antibiotika-eluerende leveringsenheter med kliniske applikasjoner.

Protocol

1. Fremstilling av reagenser Mueller-Hinton buljong (MHB) forberedelse: Løs opp 22 g kationjustert MHB i 1 liter avionisert vann. Autoklav mediet ved 121 °C og trykk på 15 lb i 20 minutter, og pass på at flasken er løst korket. Oppbevar den tilberedte sterile buljongen ved 4 °C til bruk. Preparat for tryptisk soyaagar (TSA): Løs opp 20 g TSA-pulver i 500 ml avionisert vann. Autoklav agarblandingen ved 121 °C og 15 lb i 20 minutter. Overfør det sterile mediet til et vannbad på 55 °C for å få ned temperaturen på den smeltede agar. Hell den avkjølte tilberedte agaren på sterile petriskåler (~15 ml), og la den stivne. Oppbevar de størknede agarplatene omvendt for å unngå kondens. Tilberedning av tryptisk soyabuljong (TSB): Løs opp 15 g TSB-pulver i 500 ml avionisert vann. Autoklav buljongblandingen ved 121 °C og 15 lb i 20 minutter. Oppbevar den tilberedte sterile buljongen ved 4 °C til bruk. Fosfatbufret saltvann (PBS): Autoklav kjøpte kommersielt 1x PBS ved 121 °C og 15 lb i 20 minutter før steril bruk. Mikrobiell levedyktighetsanalyse reagenspreparering: Balansere innholdet i analysen til romtemperatur. Bland 10 ml buffer med det frysetørkede selvlysende reagenspulveret, og oppbevar det tilberedte reagenset ved -20 °C som 1 ml alikoter. Før hvert tidspunkt, tine det lysfølsomme reagenset og bring det til romtemperatur. Gentamicin sulfatstamløsning: Løs opp 80 mg gentamicinsulfat (GS) i 10 ml 1x PBS. Vortex legemiddeloppløsningen grundig for å oppnå en 8 mg/ml GS stamløsning. Vankomycinhydrokloridløsning: Løs opp 10 mg vankomycinhydrokloridpulver grundig i 10 ml avionisert vann for å oppnå en 1 mg/ml stamløsning. Borsyrebufferløsning: Løs opp 24,7 g (0,4 M) borsyre i 900 ml avionisert vann. Juster oppløsningens pH til 10,4 med en 50 % (w/v) natriumhydroksidoppløsning. Videre til dette trinnet, tilsett avionisert vann for å gjøre det til 1 L. O-pthaldialdehydreagens (OPA): Løs opp 0,2 g OPA i 1 ml metanol. Tilsett 19 ml 0,4 M borsyrebuffer (pH 10,4) til OPA-oppløsningen. Tilsett 0,4 ml 2-merkaptoetanol til OPA-borsyreblandingen. Dekk til hetteglasset med reagenset i aluminiumsfolie, og oppbevar ved 4 °C for bruk opptil 2-3 dager etter tilberedning.FORSIKTIG: Unngå kontakt med hud, øyne og klær. Håndtering av OPA og 2 merkaptoetanolreagenser skal kun utføres under avtrekkshette med egnet avtrekksventilasjon mens du bruker riktig personlig verneutstyr. Unngå å puste inn damp, støv eller aerosoler. 2. Fremstilling av jomfru og stoffbelastet UHMWPE Sikt 2 g hver gentamicinsulfat og vankomycinhydrokloridpulver med en sil (75 μm porestørrelse), og dehydrer ved 45 °C i vakuumovn (<0,1 atm) i 18-24 timer. Bland det dehydrerte stoffet med UHMWPE-pulver ved 7% w / w (1,12 g antibiotika + 14,88 g UHMWPE) i en beholder ved hjelp av en mekanisk mikser i 5 minutter. Forvarm en tilpasset form i aluminiumsbronse (85 mm x 50 mm) med innsatsplater i rustfritt stål til 180 °C i varmluftsovn i 1 time. Forvarm platene på pressen til 170 °C. Tilsett det blandede pulveret i formen, og komprimer ved 10 MPa, 170 ° C i 10 minutter, etterfulgt av en 45 min vannkjølingssyklus ved 10 MPa. Fjern den støpte UHMWPE-blokken (~3,5 mm) fra pressen med en hydraulisk presse. Fres de øverste og nedre overflatene av blokken ved hjelp av en datastyrt numerisk kontroll (CNC) for å fjerne overflate uregelmessigheter og forurensninger. Klipp blokken i 3 mm x 5 mm x 20 mm striper ved hjelp av CNC. Forbered jomfru UHMWPE (uten tilsetning av antibiotika) ved hjelp av samme metodikk som beskrevet som en kontroll for studien. Tilleggsfigur 1: Deler av formen som brukes til støping av UHMWPE-prøvene. (A) Innsatsplate i rustfritt stål; (B) mugghulrom; (C) stempel; (D) bakplate Klikk her for å laste ned denne filen. 3. Bestemmelse av elueringskinetikken til legemiddeleluerende UHMWPE Plasser en 3 mm x 5 mm x 20 mm remse i en 3 ml sprøyte med Luerlås og 25 G kanyle. Vask brettet ved å fylle sprøyten med avionisert vann og snu sprøyten flere ganger. Fyll sprøyten med avionisert vann opp til graduasjonen på 2 ml. Plasser sprøyteoppsettet på en rister ved 100 o / min ved romtemperatur. Ved hvert tidspunkt (6 timer, 1 dag, 2 dager, 3 dager, 1 uke) samles eluenten i et 2 ml hetteglass. Vask strimmelen på hvert tidspunkt ved å fylle sprøyten med avionisert vann og snu sprøyten. Kast oppløsningen og fyll sprøyten med avionisert vann opp til graduasjonen på 2 ml for å fortsette eksperimentet til neste tidspunkt. 4. Bestemmelse av vankomycinkonsentrasjonen Detektere vankomycinkonsentrasjon spektrofotometrisk i avionisert vann ved en maksimal absorpsjonsbølgelengde på 280 nm. Klargjøre kjente konsentrasjonsområdestandarder ved å tilsette 100 μL 1 mg/ml stamløsning til UV 96-brønnplaten og seriefortynne med 100 μL avionisert vann for å oppnå seks nivåer av kjente konsentrasjoner (1 mg/ml til 0,03125 mg/ml). Overfør 100 μL av eluentene til UV-klare 96-brønnsplater, og bestem konsentrasjonen ved 280 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Generer en kalibreringskurve ved å plotte de kjente legemiddelkonsentrasjonene mot de tilsvarende absorbansverdiene. Beregn den ukjente legemiddelkonsentrasjonen i eluenten ved hjelp av den lineære ligningen generert av kalibreringskurven. Bestem legemiddelmassen ved å multiplisere konsentrasjonen med eluentvolumet (~1,7 ml). Beregn kumulativ frigivelse (mg) på et tidspunkt ved å summere legemiddelfrigivelsen fra alle de foregående tidspunktene. Normaliser legemiddelfrigivelsen til overflaten av stripen (3,5 cm 2) for å bestemme den kumulative legemiddelfrigivelsen per centimeter kvadrat (cm2) av implantatet. 5. Bestemmelse av gentamicinkonsentrasjonen ved OPA-merkingsmetoden 27 Forbered GS-standardløsninger for å utføre OPA-analysen.Overfør 1 ml av 80 μg/ml GS-oppløsningen til et sentrifugerør. Tilsett 500 μL PBS til fem sentrifugerør til. Utfør en seriell fortynning med disse rørene for å oppnå GS-konsentrasjoner på 80 μg/ml, 40 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml og 2,5 μg/ml. Disse fungerer som kalibreringsløsninger for analysen. I en klar 96-brønns plate tilsettes 80 μL PBS til brønn A-1 og 80 μL av kalibreringsløsningene til brønn A-2 til A-7 i stigende konsentrasjon. Dette fungerer som en intern kalibrering for analysen. Tilsett 80 μL av hver prøve til de tomme brønnene i triplikat som skal analyseres i samme 96-brønnsplate. Begrens antall prøver per brønnplate til <50 slik at tidspunktet for tilsetning av OPA-oppløsningen til prøvene er tilnærmet lik for alle prøver og for å unngå fordampning. Legg til OPA-reagens i alle standarder og eksempelløsninger.Fyll et 25 ml reagensreservoar med metanol i en avtrekkshette. Tilsett 8 ml metanol og 1 ml av den tilberedte OPA-oppløsningen til et annet reagensreservoar (pkt. 1.8). Bland oppløsningen grundig ved å pipettere opp og ned. Med en flerkanals mikropipette på 100 μL tilsettes 48 μl metanol fra det første reservoaret til alle prøveholdige brønner i platen med 96 brønner. Videre tilsettes 72 μL fortynnet OPA-oppløsning fra det andre reservoaret til alle prøveholdige brønner i 96-brønnplaten. Inkuber brønnplaten i 10 minutter ved romtemperatur. Mål fluorescensintensiteten (eksitasjon på 340 nm, utslipp på 455 nm) ved hjelp av en mikroplateleser umiddelbart etter 10 minutters inkubasjon. Plott kalibreringskurven ved hjelp av intensitetsavlesningene for løsningene med kjente konsentrasjoner av GS. Legg til en lineær linje for å bestemme den beste passformen og generere den tilsvarende ligningen. Beregn legemiddelkonsentrasjonen i eluenten fra kalibreringskurvene generert ved å plotte de kjente legemiddelkonsentrasjonene mot de tilsvarende absorbansverdiene. Beregn legemiddelmassen ved å multiplisere konsentrasjonen med eluentvolumet (~1,7 ml). Bestem den kumulative legemiddelfrigivelsen (mg) på et tidspunkt ved å summere legemiddelfrigivelsen fra alle de foregående tidspunktene. Normaliser legemiddelfrigivelsen til overflaten av stripen (3,5 cm 2) for å bestemme den kumulative legemiddelfrigivelsen per centimeter kvadrat (cm2) av implantatet. 6. Bakterier forberedelse MERK: Følgende S. aureus-stammer ble brukt i denne studien: typestamme 12600, kliniske stammer L1101 og L1163 (hentet fra Dr. Kerry LaPlante ved University of Rhode Island). Følsomhetsprofilene for disse stammene er presentert i tabell 1. Bakterielle stammer Gentamicin MIC Vancomycin MIC ATCC 12600 ≤1 μg/ml (sensitiv) ≤0,5 μg/ml (sensitiv) L1101 (klinisk stamme) ≥16 μg/ml (motstandsdyktig) 8 μg/ml (middels) L1163 (klinisk stamme) ≤1 μg/ml (sensitiv) 8 μg/ml (middels) Tabell 1: Kontrollprofiler for antibiotikafølsomhet og kliniske S. aureus-stammer. FORSIKTIG: Alle trinnene som involverer håndtering av bakteriekulturer og suspensjoner ble utført i et BSL-2 laboratorierom i et klasse II, Type A2 Biosafety Cabinet. Tine bakterielagrene fra -80 ° C på TSA-plater for å lette veksten av S. aureus. Inkuber platene statisk over natten ved 35 °C. Overfør to til tre kolonier fra de nattdyrkede agarplatekulturene til 1 ml steril TSB, og rug statisk over natten ved 35 °C. Overfør 100 μL bakterier til en klar 96-brønnsplate for spektrofotometrisk måling av turbiditeten ved å bestemme absorbansen ved 600 nm. Fortynn bakteriene 10.000x ved hjelp av steril MHB før du bestemmer levedyktig bakterietall ved hjelp av luminescerende analyse. 7. Utføre sanntids mikrobiell levedyktighetsanalyse Utfør luminescensbasert analyse ved bruk av hvite ugjennomsiktige bunnplater med 96 brønner. Bland 100 mikrol fortynnede bakterielle suspensjoner med 100 mikrol analysereagens fremstilt i pkt. 1.5. Legg et lokk dekket med aluminiumsfolie over den forberedte 96-brønnsplaten, og inkuber i 5 minutter med 100 o / min risting. Mål luminescensen umiddelbart med en mikroplateleser ved hjelp av følgende innstillinger i Gen5 3.11-programvaren.Klikk Ny for å sette opp en protokoll i vinduet Oppgavebehandling . Velg Costar 96 hvit ugjennomsiktig i rullegardinmenyen for Platetype. Klikk på Les under menyen Velg trinn > handlinger . Klikk på Luminescens i vinduet Les metode. Behold alternativene Endepunkt/kinetisk og Luminescensfiber valgt under henholdsvis lesetype og optikktype. Klikk på OK. Behold innstillingene i lesetrinnvinduet (forsterkning = 135; integrasjonstid = 1 sek; lesehøyde = 4,5 mm). Klikk på OK. Plateoppsettvinduet vises klart for kjøringen. Merk av for Bruk lokk i lastplatevinduet, og klikk på OK. Plasser platen med 96 brønner i maskinen for å lese luminescensverdiene. 8. Generere en luminescens versus levedyktig telle standardkurve for hver bakteriestamme MERK: Dyrk og oppregn alle S. aureus-stammene i henhold til metodikken beskrevet i avsnitt 6. Forbered serielt fortynnede bakterielle suspensjoner for å tjene som standarder.List opp den nattdyrkede bakteriesuspensjonen ved spektrofotometrisk måling av turbiditeten. Sentrifuge ved 6000 × g i 5 minutter for å pelletere bakteriene, og resuspender pelleten i steril MHB for å justere konsentrasjonen til 1 x 109 CFU / ml. Fortynn 100 mikrol pen suspensjon med 900 mikroliter MHB, og utfør en 10 ganger seriell fortynning for å nå 1 x 101 CFU / ml. Utfør luminescensanalysen på de tilberedte bakteriesuspensjonene som beskrevet i avsnitt 7. Bruk steril MHB som en tom kontroll for eksperimentet, og trekk den tomme luminescensverdien fra testeksempelets luminescensverdier. Plott loggen (CFU) mot loggen (luminescens) for å generere en standardkurve. Registrer ligningen og R2-verdien . Bestem CFU / ml som svarer til luminescensverdiene ved hjelp av den belastningsspesifikke ligningen gjennom hele studien. 9. Tidsavhengig studieoppsett for antibakteriell aktivitet Figur 1: En skjematisk fremstilling av det eksperimentelle oppsettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Dyrk bakteriene over natten i 1 ml TSB-buljong. Fortynn bakteriesuspensjonen over natten til 105 CFU/ml i sterilt MHB (avsnitt 6), og verifiser levedyktig bakterieantall ved hjelp av luminescensenhetene før starten av forsøket (avsnitt 7). Plasser de virgine UHMWPE- og legemiddelbelastede UHMWPE-strimlene (3 mm x 5 mm x 10 mm, halve dimensjonen til strimler klargjort for elueringsstudiene i avsnitt 2) i en 3 ml sprøyte. Trekk MHB inneholdende 10 5 CFU/ml inn i sprøyten gjennom den påmonterte kanylen opp til1,5 ml-merket, som tilsvarer 1,35 ml MHB (figur 1: Trinn 1). Plasser sprøyteoppsettet på en risteinkubator (100 rpm) ved 37 °C til de angitte tidspunktene 6 timer, dag 1, dag 2, dag 3, dag 4, dag 5, dag 6 og dag 7 (figur 1: trinn 2). Ved hvert indikerte tidspunkt tar du ut sprøyteoppsettet og utfører en sanntids mikrobiell levedyktighetsanalyse i henhold til avsnitt 7 om 100 mikrol bakteriell suspensjon (figur 1: Trinn 3-4). Bestem levedyktig bakterietall for 6 timer, dag 1, dag 2, dag 3 og dag 7 tidspunkter. Bestem CFU / ml fra luminescensenhetene ved hjelp av den tilsvarende standardkurven. Verifisere fraværet av levedyktige bakterier i prøvene som viste luminescensverdier under deteksjonsgrensen ved å utføre spredningsplatemetoden på TSA-plater og inkubere ved 35 °C over natten. Sjekk om det finnes kolonier neste dag. Sentrifuger den gjenværende bakterielle suspensjonen ved 10 000 × g i 10 minutter, og aspirer det brukte mediet forsiktig. For rør der pellets ikke observeres visuelt på grunn av legemidlenes antibakterielle aktivitet, la 100 μL ligge i røret for å sikre at den usynlige pelleten ikke forstyrres (figur 1: Trinn 5). Resuspender de pelleterte bakteriene i fersk MHB, og trekk bakteriesuspensjonen tilbake i samme sprøyteoppsett gjennom den påmonterte kanylen (figur 1: Trinn 6). 10. Kvantifisering av adherente bakterier på UHMWPE-overflaten Hent jomfruelige UHMWPE- og medikamentbelastede UHMWPE-overflater fra sprøyteoppsettet etter at studien er fullført på dag 7. Overfør overflatene til 1,5 ml rør, og skyll med 1 ml steril PBS (tre ganger). Sonikere overflaten i 40 minutter i 1 ml steril PBS. Bestem adherent bakteriens levedyktighet ved å utføre en luminescensanalyse på 100 μL av den sonikerte prøven, som beskrevet avsnitt 7.

Representative Results

Etter protokollen ble UHMWPE støpt med gentamicin og vancomycin ved 7% w / w og eluert i avionisert vann. Legemiddelkonsentrasjonen i eluenten fra materialet ble bestemt til 6 timer, 1 dag, 2 dager, 3 dager og 1 uke. Legemiddelfrigjøring fra vankomycin og gentamicinbelastet UHMWPE viste burst release ved 6 timer etterfulgt av en jevn frigjøringshastighet med en frigjøringskonsentrasjon større enn minste hemmende konsentrasjon (MIC) inntil 7 dager (figur 2, tabell 2). Før den antibakterielle studien ble det generert en standardkurve for å korrelere luminescensenhetene til CFU / ml av bakteriene for hver S. aureus-stamme (ATCC 12600, L1101 og L1163). De tilsvarende log-verdiene (luminescens) ble plottet mot loggen (CFU/ml) for å generere en standardkurve (figur 3). De beregnede R2-verdiene var 0,997, 0,996 og 0,994 for henholdsvis ATCC 12600, L1101 og L1163, noe som indikerer en sterk passform for konsentrasjonsområdet. Ligningen avledet ble senere brukt til å beregne bakteriell levedyktighet på tvers av alle forsøkene. ATCC 12600 og L1101 viste en deteksjonsgrense innenfor et område på 1 x 102-1 x 103 CFU / ml. På den annen side ble deteksjonsgrensen for L1163-stammen vist å være 1 x 104 CFU / ml. Den tidsavhengige antibakterielle aktivitetsanalysen ble utført ved bruk av 1 x 105 CFU / ml som startinokulum for 12600, L1163 og L1101, som ble utsatt for 7% w / w medikamenteluerende materialer i en periode på 1 uke. Ved hvert tidspunkt (6 timer, 1 dag, 2 dager, 3 dager, 1 uke) ble mediet frisket opp, og bakteriepopulasjonen ble resuspendert. Bakterienes eksponering for den påfølgende frigjøringen av legemidler fra materialet ble videreført til neste tidspunkt. UHMWPE med 7 % w/w vankomycin og UHMWPE med 7 % w/w gentamycin viste >3log reduksjon for følsom ATCC 12600 fra 6 timer, og fullstendig utryddelse (ingen kolonivekst) ble observert etter 3 dager (figur 4A). For den gentamicinfølsomme og vankomycin-mellomliggende stammen L1163 forårsaket begge medikamenteluerende materialer >3 % reduksjon ved 6 timer, og fullstendig utryddelse (ingen kolonivekst) ble observert på dag 1 av forsøket (figur 4B). For den gentamicinresistente og vankomycin-mellomliggende stammen L1101 påvirket gentamicineluering fra UHMWPE ikke den bakterielle levedyktigheten til L1101 (figur 4C). Bakteriene spredte seg, og befolkningen stabiliserte seg innen 6 timer i nærvær av jomfru UHMWPE uten antibiotikaeluering. I nærvær av gentamicin-eluerende UHMWPE nådde populasjonen et tilsvarende vekstnivå på dag 2. Tvert imot reduserte vankomycelusjon fra UHMWPE signifikant bakteriell levedyktighet (>3log) ved 6 timer, og fullstendig levedyktighetstap (ingen kolonivekst) ble demonstrert ved dag 4. Overflatene til både gentamicin-eluerende og vankomycin-eluerende UHMWPE viste ingen levedyktige adherente bakterier når de ble utsatt for følsomme og mellomresistente stammer etter dag 7 eller fullstendig utryddelse, avhengig av hva som kom først. Noen levedyktige bakterier (1 x 105 CFU / ml) var tilstede på gentamicin-eluerende UHMWPE utsatt for gentamicinresistent L1101. Tilsvarende ble ca. 1 x 10 5 CFU / ml av levedyktige adherente bakterier gjenvunnet fra kontrolljomfru PE (figur 5). Figur 2: Tidsavhengig gjennomsnittlig antibiotikautslipp fra 7 % w/w antibiotikabelastet UHMWPE-stripe. Den gjennomsnittlige antibiotikafrigjøringen mellom tidspunkter fra en 7% w / w gentamicin og vancomycin-lastet UHMWPE stripe (3 mm 3 x 5 mm 3 x 10 mm3 ~ 2 cm2 overflateareal). MIC mot kontrollstamme ATCC 12600 er vist som en stiplet linje for gentamicin og en heltrukket linje for vankomycin. Feilfeltene representerer standardavviket til gjennomsnittet fra seks replikater (n = 6). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Standardkurve for selvlysende analyse i sanntid for alle S. aureus-stammene. Log (luminescens) ble plottet mot log (CFU / ml) for å generere standardkurver for kontroll, (A) ATCC 12600, og kliniske stammer, (B) L1101 og (C) L1163. Ligningene som beskriver linjen med best passform og tilsvarende R2-verdier er angitt på tomtene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Bakteriell levedyktighet bestemt ved hjelp av en selvlysende analyse for 7 % w/w gentamicin-eluerende og 7 % w/w vankomycin-eluerende UHMWPE. Den tidsavhengige antibakterielle aktiviteten til gentamicin og vankomycin eluert fra UHMWPE mot kontrollstammer, (A) ATCC 12600, og kliniske stammer, (B) L1163 og (C) L1101, er vist. Virgin 1020 PE fungerte som en kontroll for eksperimentet. Den gule linjen i plottene indikerer deteksjonsgrensen for den respektive S. aureus-stammen. Data vises som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Adherent bakterier levedyktighet bestemt ved hjelp av luminescerende analyse Glo analyse for 7% w / w gentamicin-eluering og 7% w / w vancomycin-eluerende UHMWPE mot alle S. aureus stammer. Stolpediagrammet indikerer adherente bakterier (CFU) gjenvunnet per centimeter kvadrat (cm2) på 7% gentamicinbelastet og 7% vankomycinbelastet UHMWPE ved slutten av studieperioden for alle de testede stammene. Stolpene viser data som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Tidspunkter Vancomycin Gentamicin Maksimal konsentrasjon (μg/ml) Maksimal konsentrasjon (μg/ml) 0 – 6 t 336 ± 72 263 ± 24 6 t -1 dag 57 ± 18 16 ± 2 1 dag – 2 dager 60 ± 18 7 ± 1 2 dager – 3 dager 23 ± 6 5 ± 0,4 3 dager – 7 dager 49 ± 20 15 ± 1 Tabell 2: Maksimal legemiddelkonsentrasjon (μg/ml) ved ulike tidspunkter. Data vises som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 6). Tilleggsfigur 2: Luminescenssignalhenfall over en periode på 10 minutter fra tilsetning av analysereagens til prøven. En forskjell på ±5 % i signalet vises som en stiplet linje Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Den lokaliserte vedvarende levering av antibiotika er et nødvendig verktøy i behandlingen av periprostetiske leddinfeksjoner. Systemiske antibiotika er den primære strategien for å utrydde bakteriell infeksjon, og lokal eluering brukes som et komplementært verktøy for å forhindre vekst og kolonisering av eventuelle bakterier som er igjen etter implantatfjerning og debridement av vevet. Målet for effektivt areal under kurven (konsentrasjon over en periode) for antibiotika med lokal administrasjon er lite forstått. Elusjonen av antibiotika fra slike enheter kan kvantifiseres i lengderetningen in vitro; For å bestemme translasjonsverdien av disse konsentrasjonsprofilene er det imidlertid nødvendig med en robust in vitro-metode for å vurdere antibakteriell aktivitet. I dette papiret er en slik sanntidsmetode beskrevet for å bestemme den antibakterielle aktiviteten til narkotika-eluerende UHMWPE som skal brukes som en vedvarende leveringsenhet i leddutskiftninger.

Sanntidsovervåking av bakteriell levedyktighet er en avgjørende parameter av interesse, og konvensjonelle mikrobiologiske metoder mangler rammeverket for å imøtekomme dette spesifikke aspektet av studien. Den mikrobielle levedyktighetsanalysen som ble brukt i denne studien ble utviklet for kvantifisering av levedyktige bakterier ved å måle luminescensen tilsvarende adenosintrifosfat (ATP). For direkte å undersøke den tidsavhengige aktiviteten til antibiotika eluert fra implantatmaterialene, ble tre forskjellige stammer med forskjellige antibiotikafølsomhetsprofiler inkubert med dem. Begrunnelsen for å bruke laboratorie- og kliniske stammer med varierende resistens mot gentamicin og vankomycin var å forstå aktivitetsområdet for en gitt implantatformulering. Videre er den antibakterielle aktiviteten og effekten mot disse forskjellige populasjonene avhengig av tidspunktet for administrering. Metoden fokuserer på muligheten for profylakse mot disse stammene basert på at >70% av periprostetiske leddinfeksjoner skyldes forurensning av såret på operasjonstidspunktet24.

Som startinokulum for å utvikle denne metoden ble 1 x 105 CFU / ml brukt. Ulike forurensende konsentrasjoner har blitt brukt til dyremodeller, men det er ikke mye kjent om den klinisk relevante infeksjonsbelastningen for PJI. Dyreinfeksjonsmodeller for PJI er rutinemessig etablert ved bruk av 1 x 105 CFU, og et lignende utvalg er mye brukt i standardiserte metoder (CLSI) for å bestemme antibakteriell aktivitet25,26,27. Ved å bruke 1 x 105 CFU / ml som en innledende forurensende konsentrasjon tillot oss å evaluere både vekst- og utryddelsesparametrene samtidig.

Konvensjonelt bestemmes MIC-verdier for en konstant antibiotikakonsentrasjon for et bestemt antall bakterier, og de klarer ikke å demonstrere frekvensen av antibakteriell virkning. På grunn av dette aspektet gir MIC-verdier ikke en kvantitativ differensiering for å beskrive den antimikrobielle aktivitetsprofilen28. Dataene fra den nåværende metoden understreker fordelen ved å evaluere den belastningsavhengige drapskinetikken til antibiotika i stedet for å bruke MIC til å ta doseringsbeslutninger. Ved hjelp av denne metoden var det mulig å differensiere både i hvilken grad og hastigheten implantatmaterialene påvirket de forskjellige stammene. Gentamicin eluert fra strimlene av implantatmaterialet var effektivt i å utrydde L1163 på 1 dag og utrydde ATCC 12600 på 2-3 dager, men det var ineffektivt i å utrydde L1101 (figur 4). I tillegg til den forventede mangelen på aktivitet av gentamicineluering mot L1101 (MIC >32 μg/ml) på grunn av dets iboende gentamicinresistens (figur 4C), ble det observert persistens av subpopulasjoner ved eksponering for vankomycin, hvor L1101 viser middels resistens. I kontrast ble L1163 definitivt utryddet i nærvær av vankomycin-eluerende UHMWPE til tross for at den viste lignende middels resistens mot vankomycin som L1101 (en MIC på 8 μg / ml er observert for begge stammer).

Observasjonene om at gentamicins aktivitetsrate mot 12600 og L1163, som er gentamicinfølsomme med lignende MIC-verdier (en MIC på 1μg/ml er observert for begge stammer), var forskjellig, samt at aktivitetsgraden av vankomycin mot middels resistent L1101 og L1163 var forskjellig (figur 4A,B), støttet hypotesen om at denne sanntidsmetoden i nærvær av elueringsmaterialet kunne skille langsgående forskjeller i aktiviteten.

I tillegg til den translasjonelle verdien av resultatene i å tolke hvor effektiv en gitt eluert konsentrasjon kan være mot disse bakteriene, er det flere eksperimentelle metodologiske fordeler. (1) Bakteriekonsentrasjonen bestemmes øyeblikkelig på et gitt tidspunkt, i motsetning til konvensjonelle metoder der bakteriene inkuberes i buljong eller på agar i 18-24 timer for å bestemme levedyktigheten. Denne vekstperioden kan gi ekstra tid for bakteriene å komme seg fra antibiotikastress, og introdusere en ekstra mulig feilkilde / variabilitet. (2) Mediet skiftes kontinuerlig ut samtidig som bakteriene, som ligner mer in vivo-forhold beholder enn statiske forhold. (3) Denne analysen inkluderer iboende legemiddelfrigivelseskinetikken fra implantatet, noe som muliggjør bedre ytelsesprediksjon. 4) Metoden er utviklet ved bruk av vanlig tilgjengelige forbruksvarer uten behov for spesifikke eller dyre maskiner.

Robuste in vitro-testmetoder for å evaluere applikasjoner for legemiddellevering er nødvendig før du går videre til in vivo dyreforsøk og kliniske studier. Denne analysen kan modifiseres og tilpasses for å imøtekomme ulike tilnærminger og legemiddelleveringsplattformer som partikler, geler, filmer og andre medikamenteluerende materialer for å bestemme effektiviteten av bakteriell utryddelse i et simulert in vitro-oppsett. Modifikasjoner kan utføres for prøveoppsettet ved å bytte til et egnet in vitro mediummiljø, som har vist seg å påvirke aktiviteten til flere antibiotika29,30.

Metoden muliggjør også levedyktig fastsettelse av adherente bakterier, noe som er lovende, da konvensjonelle metoder for å bestemme minimum biofilmutryddelseskonsentrasjon er tidkrevende og gir inkonsekvente resultater. Metoden skal imidlertid testes grundig på biofilm for å utvikle en pålitelig og robust metodikk for å bestemme følsomheten. Den ATP-baserte luminescerende metoden kan være følsom nok til å oppdage levedyktige former for bakterier i biofilmer, inkludert persisters, som kanskje eller ikke kan oppdages på en agarplate som synlige kolonier. Samlet sett har denne allsidige plattformen potensial til å inkorporere relevante parametere for å registrere sanntidsobservasjoner av antibakteriell og anti-biofilmaktivitet av legemidler av interesse.

Effekten av denne metoden styres av følgende aspekter:

Forhåndsbestemte elueringsegenskaper og prøvestørrelse
Elusjonsprofilen til det antibiotikaeluerende materialet kan identifiseres i et separat eksperiment før denne antibakterielle aktivitetsmålingen, slik at mengden materiale som kreves for å aktivt gjennomføre forsøket innen en fastsatt tid, kan bestemmes.

Bestemmelse av beholder og volum
Det er viktig å utarbeide et oppsett der medievolumet av forsøket kan romme hele overflaten av det samme materialet og for å sikre tilstrekkelig volum for uhindret frigjøring av legemidlet fra den stoffbelastede overflaten. Oppsettet som ble brukt var basert på tidligere eksperimenter, og sikret “perfekte vask” -forhold for disse hydrofile legemidlene slik at deres diffusjon ikke hindres av løselighetsbegrensninger.

Egenskaper ved vekstmedier
Seleksjon av vekstmedier bør undersøkes for å sikre stabilitet og optimal ytelse for det valgte stoffet/stoffene29. Kationjustert Mueller Hinton-buljong (CAMHB), som er mye brukt i buljongfortynningsmetoden, ble brukt til å bestemme MIC av kjente antibiotika. Mediet muliggjør optimal legemiddelaktivitet uten interferens av toksisk sekundær metabolittakkumulering31. Analysereagenset er testet og rapportert stabilt i ulike typer medier, inkludert de med serumkomponenter23,28. Selv om de relative luminescensenhetsverdiene kan variere på tvers av forskjellige medier, har komponentene i mediet vist seg å ikke forstyrre analysen32,33. Det eksperimentelle volumet ble videre optimalisert til 1,5 ml, som er nær synovialvæskevolumet som er tilstede i et voksent kneleddsrom34.

Temperaturstabilitet for analysen
Håndtering og tilsetning av det luminescerende reagenset til analysen skal utføres på en konsistent måte på tvers av eksperimenter. Temperaturendringer endrer følsomheten til analysen, så det er viktig å inkubere reagenset ved romtemperatur i 2 timer før det tilsettes bakteriene23.

Reagens inkubasjonstid
Luminescensen fra reagenset henfaller med tiden. Det selvlysende signalet har en halveringstid på over 30 min, noe som i stor grad er avhengig av mediet og typen bakterie som brukes i forsøket23. I tillegg vil eventuelle forskjeller i inkubasjonstid (dvs. tiden mellom tilsetning av reagenset til bakteriene og lesing av luminescensen) resultere i inkonsekvente avlesninger for samme konsentrasjon av bakterier. En forskjell på 5 % ble observert i det selvlysende signalet når det ble tatt innen 1 minutt etter inkubasjonstiden på 5 minutter i henhold til produsentens instruksjoner (tilleggsfigur 2). Ved å ta hensyn til disse dataene ble luminescensavlesningene registrert innen 1 minutt gjennom hele studien for å sikre at signaltapet ikke var mer enn 5%. Videre er det viktig å begrense antall prøver per plate for å redusere feilen som oppstår på grunn av luminescenshenfall fra første brønn til siste brønn.

Vedlikehold av bakteriepopulasjonen gjennom hele studien
Metoden forsøkte å modellere legemiddelclearance og synovialvolumomsetning ved kontinuerlig å separere de brukte mediene fra bakteriepopulasjonen på hvert tidspunkt ved hjelp av høyhastighets sentrifugering ved 10.000 x g i 10 min35. Dette kritiske trinnet sikrer sedimentering av alle levedyktige og ikke-levedyktige bakterieceller. Videre til dette blir de sedimenterte bakteriene jevnt rekonstituert i fersk MHB og overført til sprøyteoppsettet, noe som letter fullstendig overføring av den berørte mikrobielle populasjonen tilbake til det eksperimentelle oppsettet. Reproduserbarheten og påliteligheten til denne metoden er sterkt avhengig av å simulere vedvarende eksponering av antibiotika til den mikrobielle populasjonen avledet fra det første inokulumet.

En viktig begrensning ved denne metoden er at det er en semi-statisk analyse som ikke nøyaktig simulerer halveringstider og kontinuerlig synovial omsetning. Kontinuerlig middels utskifting kompenserer imidlertid delvis for denne begrensningen. Sensitiviteten til den mikrobielle levedyktighetsanalysen var belastningsavhengig, fra 1 x 102-1 x 104 CFU / ml, noe som begrenser deteksjonsevnen. Videre må en standardkurve plottes for hver organisme ettersom stammetypen bidrar til følsomheten og ytelsen til det luminescerende reagenset. Både bakterievekstdynamikken og aktiviteten til den brukte legemiddelforbindelsen kan påvirkes av mediumkomponentene, som bør undersøkes nærmere.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble delvis finansiert av National Institutes of Health Grant No. AR077023 (R01) og av Harris Orthopedic Laboratory. Forfatterne takker Dr. Kerry Laplante og hennes team ved University of Rhode Island for å gi de kliniske stammene L1101 og L1163.

Materials

 96 well plates – polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs Corning, NY, USA CLS3922-100EA
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich, Germany
ATCC 12600 American Type culture Collection, VA, USA
BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay Promega Corporation, USA G8231
BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) Becton-Dickinson, USA BD 211825 purchased from Fisher Scientific, USA
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL BD, USA 309657
BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G BD, USA 305122
BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton-Dickinson, USA B12322 purchased from Fisher Scientific, USA
BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) Becton-Dickinson, USA DF0369-17-6 purchased from Fisher Scientific, USA
Boric Acid  Fisher Chemical, NJ, USA
Branson 1800 ultrasonic bath Emerson, MO, USA
Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid Fisher Scientific, USA 08-757-100D
Gentamicin Sulfate  Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China
Greiner UV-Star 96 well plates Sigma Aldrich, Germany M3812-40EA
Hydraulic press Carver, Inc. Wabash, IN, USA
L1101  Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
L1163  Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
LSE benchtop shaking incubator Corning, NY, USA
Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical Fisher Scientific, NJ, USA A454-1
Napco CO2 6000 Thermo Scientific, MA, USA
PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents Fisher Scientific, USA BP24384
Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) Sigma Aldrich, Germany P1378-5g
Plate reader (Synergy H1 Biotek, VT, USA
press Carver, Inc. Wabash, IN, USA
shaker Innova 2100 New Brunswick Scientific, NJ, USA
ShopBot D2418 ShopBot Tools, Inc., NC, USA
Sodium Hydroxide  Sigma Aldrich, Germany
Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water Fisher Scientific, USA 23-751628
UHMWPE GUR1020, Celanese, TX, USA
Vancomycin Hydrochloride  Fagron, The Netherlands 804148
WAB Turbula WAB Turbula, Switzerland

References

  1. Hunter, D. J., March, L., Chew, M. Osteoarthritis in 2020 and beyond: A Lancet Commission. Lancet. 396 (10264), 1711-1712 (2020).
  2. Sloan, M., Premkumar, A., Sheth, N. P. Projected volume of primary total joint arthroplasty in the U.S., 2014 to 2030. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 100 (17), 1455-1460 (2018).
  3. Gao, J., Xing, D., Dong, S., Lin, J. The primary total knee arthroplasty: A global analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 190 (2020).
  4. . UpToDate. Prosthetic joint infection: Treatment Available from: https://www.uptodate.com/contents/prosthetic-joint-infection-treatment (2022)
  5. Dapunt, U., Radzuweit-Mihaljevic, S., Lehner, B., Haensch, G. M., Ewerbeck, V. Bacterial infection and implant loosening in hip and knee arthroplasty: Evaluation of 209 cases. Materials. 9 (11), 871 (2016).
  6. Kamath, A. F., et al. Quantifying the burden of revision total joint arthroplasty for periprosthetic infection. The Journal of Arthroplasty. 30 (9), 1492-1497 (2015).
  7. Tande, A. J., Patel, R. Prosthetic joint infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (2), 302-345 (2014).
  8. Davidson, D. J., Spratt, D., Liddle, A. D. Implant materials and prosthetic joint infection: The battle with the biofilm. EFORT Open Reviews. 4 (11), 633-639 (2019).
  9. de Vor, L., Rooijakkers, S. H. M., van Strijp, J. A. G. Staphylococci evade the innate immune response by disarming neutrophils and forming biofilms. FEBS Letters. 594 (16), 2556-2569 (2020).
  10. Dapunt, U., Giese, T., Stegmaier, S., Moghaddam, A., Hänsch, G. M. The osteoblast as an inflammatory cell: Production of cytokines in response to bacteria and components of bacterial biofilms. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 243 (2016).
  11. González, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
  12. Dapunt, U., Giese, T., Prior, B., Gaida, M. M., Hänsch, G. M. Infectious versus non-infectious loosening of implants: activation of T lymphocytes differentiates between the two entities. International Orthopaedics. 38 (6), 1291-1296 (2014).
  13. Tai, D. B. G., Patel, R., Abdel, M. P., Berbari, E. F., Tande, A. J. Microbiology of hip and knee periprosthetic joint infections: A database study. Clinical Microbiology and Infection. 28 (2), 255-259 (2022).
  14. Foster, T. J. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Current status and future prospects. FEMS Microbiology Reviews. 41 (3), 430-449 (2017).
  15. Kranjec, C., et al. Staphylococcal biofilms: challenges and novel therapeutic perspectives. Antibiotics. 10 (2), 131 (2021).
  16. Kahl, B. C., Becker, K., Löffler, B. Clinical significance and pathogenesis of staphylococcal small colony variants in persistent infections. Clinical Microbiology Reviews. 29 (2), 401-427 (2016).
  17. Li, C., Renz, N., Trampuz, A. Management of periprosthetic joint infection. Hip & Pelvis. 30 (3), 138-146 (2018).
  18. Davis, J. S., et al. Predictors of treatment success after periprosthetic joint infection: 24-month follow up from a multicenter prospective observational cohort study of 653 patients. Open Forum Infectious Diseases. 9 (3), (2022).
  19. Suhardi, V. J., et al. A fully functional drug-eluting joint implant. Nature Biomedical Engineering. 1, 0080 (2017).
  20. Gil, D., Grindy, S., Muratoglu, O., Bedair, H., Oral, E. Antimicrobial effect of anesthetic-eluting ultra-high molecular weight polyethylene for post-arthroplasty antibacterial prophylaxis. Journal of Orthopaedic Research. 37 (4), 981-990 (2019).
  21. Robu, A., et al. Additives imparting antimicrobial properties to acrylic bone cements. Materials. 14 (22), 7031 (2021).
  22. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  23. BacTiter-Glo microbial cell viability assay instructions for use of products G8230, G8231, G8232 and G8233. <101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol. Promega Corporation Available from: https://www.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol/ (2022)
  24. Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: Current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
  25. López-Torres, I. I., Sanz-Ruíz, P., Navarro-García, F., León-Román, V. E., Vaquero-Martín, J. Experimental reproduction of periprosthetic joint infection: Developing a representative animal model. The Knee. 27 (3), 1106-1112 (2020).
  26. Carli, A. v., et al. Quantification of peri-implant bacterial load and in vivo biofilm formation in an innovative, clinically representative mouse model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 99 (6), 25 (2017).
  27. Humphries, R. M., et al. CLSI Methods Development and Standardization Working Group best practices for evaluation of antimicrobial susceptibility tests. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), 01934 (2018).
  28. Mueller, M., de la Peña, A., Derendorf, H. Issues in pharmacokinetics and pharmacodynamics of anti-infective agents: Kill curves versus MIC. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (2), 369-377 (2004).
  29. Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Medical Principles and Practice. 28 (1), 28-35 (2019).
  30. Steixner, S. J. M., et al. Influence of nutrient media compared to human synovial fluid on the antibiotic susceptibility and biofilm gene expression of coagulase-negative Staphylococci In vitro. Antibiotics. 10 (7), 790 (2021).
  31. Sigma Aldrich. Mueller Hinton Broth (M-H Broth). Sigma Aldrich. , 70192 (2018).
  32. Thiriard, A., Raze, D., Locht, C. Development and standardization of a high-throughput Bordetella pertussis growth-inhibition assay. Frontiers in Microbiology. 11, 777 (2020).
  33. Clow, F., O’Hanlon, C. J., Christodoulides, M., Radcliff, F. J. Feasibility of using a luminescence-based method to determine serum bactericidal activity against Neisseria gonorrhoeae. Vaccines. 7 (4), 191 (2019).
  34. Kraus, V. B., Stabler, T. v., Kong, S. Y., Varju, G., McDaniel, G. Measurement of synovial fluid volume using urea. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (10), 1217-1220 (2007).
  35. Gonçalves, F. D. A., de Carvalho, C. C. C. R. Phenotypic modifications in Staphylococcus aureus cells exposed to high concentrations of vancomycin and teicoplanin. Frontiers in Microbiology. 7, 13 (2016).

Play Video

Cite This Article
Sekar, A., Lekkala, S., Oral, E. A Novel Method to Determine the Longitudinal Antibacterial Activity of Drug-Eluting Materials. J. Vis. Exp. (193), e64641, doi:10.3791/64641 (2023).

View Video