Summary
Ici, nous présentons un protocole pour évaluer l’efficacité antibactérienne d’un polymère à élution d’antibiotique afin de simuler une application clinique prophylactique en utilisant un test de viabilité microbienne luminescente en temps réel disponible dans le commerce. Cette méthode permet de surveiller l’activité longitudinale des matériaux à élution de médicaments et peut être largement adaptée pour tester les plateformes d’administration de médicaments antimicrobiens.
Abstract
Le polyéthylène de très haut poids moléculaire (UHMWPE) est largement utilisé dans les arthroplasties articulaires totales comme surface porteuse. Les infections articulaires périprothétiques, dont la majorité surviennent peu de temps après le remplacement articulaire, représentent près de 25% du total des chirurgies de révision du genou, et l’éradication complète de l’infection bactérienne pose un défi majeur. Une façon prometteuse de s’attaquer à ce problème est d’assurer l’administration locale soutenue de concentrations d’antibiotiques suffisantes pour inhiber les bactéries afin de soutenir la prophylaxie antibiotique systémique de routine. Il y a de plus en plus de recherches sur le développement de dispositifs locaux efficaces d’administration de médicaments. Bien que les méthodes d’essai antibactériennes établies pour les médicaments puissent être utilisées pour tester l’efficacité antibactérienne des matériaux à élution de médicaments, elles manquent pour ce qui est de fournir des données d’efficacité antibactérienne en temps réel et longitudinales qui peuvent être corrélées aux profils d’élution des antibiotiques de ces dispositifs. Ici, nous rapportons une méthodologie directe et polyvalente pour déterminer l’efficacité antibactérienne des implants UHMWPE à élution d’antibiotiques. Cette méthodologie peut être utilisée comme plate-forme pour éviter la culture bactérienne à chaque point temporel d’une longue expérience et peut également être adaptée à d’autres dispositifs locaux d’administration de médicaments.
Introduction
L’arthrose est une maladie dégénérative importante qui touche 500 millions d’adultes dans le monde1. L’étalon-or dans le traitement de l’arthrite terminale est le remplacement total des articulations, qui devrait être effectué chez plus de 2 millions de patients chaque année aux États-Unis d’ici 20302, la demande mondiale augmentant également considérablement 3,4. La procédure implique le remplacement des surfaces cartilagineuses articulées des articulations par des matériaux synthétiques porteurs en métal/céramique et en polyéthylène de poids moléculaire ultra-élevé hautement réticulé (UHMWPE). Les remplacements articulaires totaux améliorent considérablement la qualité de vie des patients souffrant d’arthrite5, mais une complication importante qui met en danger la performance des implants et la satisfaction des patients est l’infection articulaire périprothétique (PJI), qui représente 15% à 25% des chirurgies de révision6. Dans la plupart des cas, on pense que la cause de l’infection est la contamination microbienne du site de l’implant pendant la chirurgie7. La population contaminante se dilate alors sur les surfaces de l’implant et des tissus8. Le système immunitaire de l’hôte est déclenché en réponse, mais le taux de croissance et la formation de biofilm des organismes contaminants peuvent leur permettre d’échapper aux cellules immunitaires, ce qui peut entraîner une tempête accrue de cytokines et de chimiokines sans l’éradication de la bactérie 9,10,11. L’infection profonde de l’os qui en résulte compromet la fixation et la performance de l’implant ainsi que la santé du patient12.
Staphylococcus aureus et staphylocoques coagulases négatives sont les principaux organismes responsables de PJI13. La gravité des infections à staphylocoques est élevée en raison de leur résistance accrue aux antibiotiques, de la formation de biofilms et de leur capacité à persister en tant que petites variantes de colonies14,15,16. Les infections associées à l’implant se produisent en raison de l’adhésion de micro-organismes à la surface de l’implant et de l’établissement d’une matrice complexe de biofilm qui permet aux bactéries d’échapper aux facteurs immunitaires délétères de l’hôte et aux concentrations efficaces d’antibiotiques14,15,16. Les méthodes de traitement conventionnelles comprennent des combinaisons d’antibiotiques par voie intraveineuse et orale pendant une période prolongée17. Un inconvénient majeur de cette approche est la faible biodisponibilité du médicament au site d’infection et la difficulté d’atteindre des concentrations suffisantes d’antibiotiques pour éradiquer les bactéries de manière constante au cours de la période de traitement, ce qui entraîne souvent de mauvais résultats18. Pour remédier à ces lacunes, un implant UHMWPE localisé entièrement fonctionnel a été conçu pour assurer une libération durable des concentrations efficaces d’antibiotiques dans l’espace articulaire19. L’élution locale de l’implant à élution médicamenteuse est utilisée comme outil complémentaire pour empêcher la croissance et la colonisation de toute bactérie restante après le retrait de l’implant et le débridement du tissu. Des tests antibactériens in vitro de cet UHMWPE à élution d’antibiotiques peuvent être effectués en incubant le matériau directement avec les bactéries et en quantifiant les bactéries par la méthode de la plaque étalée20,21. Alternativement, les aliquotes de milieux éluants peuvent être testées contre les bactéries en utilisant des méthodes telles que la méthode de diffusion sur disque d’agar, les méthodes de dilution du bouillon et l’essai de destruction temporelle22. Toutes ces méthodes reposent sur l’observation de la croissance environ 16 à 18 heures après la collecte des aliquotes au moyen de comptage des colonies et de mesures de turbidité. L’élution des antibiotiques de ces dispositifs peut être quantifiée longitudinalement à l’aide de ces méthodes in vitro; Cependant, pour déterminer la valeur translationnelle de ces profils de concentration, une méthode in vitro robuste en temps réel pour évaluer l’activité antibactérienne est nécessaire.
Le test de viabilité microbienne utilisé dans cette étude a été développé pour la quantification des bactéries viables en mesurant la luminescence correspondant à l’adénosine triphosphate (ATP) libérée par une cellule bactérienne vivante à l’aide de la technologie de détection basée sur la luciférine-luciférase. L’ATP, en tant que monnaie énergétique des cellules vivantes, sert d’indicateur direct des cellules physiologiquement viables. Le réactif effectue la lyse cellulaire, qui libère des molécules d’ATP à partir de cellules viables qui sont ensuite détectées sous forme de luminescence. Cette luminescence a une corrélation directe avec la proportion de cellules bactériennes viables dans l’échantillon23. Il s’agit d’un test en temps réel, simple, polyvalent, rapide, à base de réactif unique qui peut être adapté à une variété de conceptions et de conditions de test avec des micro-organismes gram-positifs et gram-négatifs. Nous rapportons ici une méthode pour déterminer l’activité antibactérienne en temps réel de l’UHMWPE à élution d’antibiotiques incubé avec des souches de laboratoire et cliniques de S. aureus à l’aide d’un test de destruction temporelle modifié basé sur le test de viabilité microbienne (par exemple, BacTiter Glo). Bien que la méthodologie soit décrite avec un matériau implantaire spécifique et une application orthopédique spécifique, la méthode peut fournir une plate-forme pour tester d’autres dispositifs d’administration à élution d’antibiotiques avec des applications cliniques.
Protocol
1. Préparation des réactifs
- Préparation de bouillon Mueller-Hinton (MHB) : Dissoudre 22 g de MHB ajusté aux cations dans 1 L d’eau désionisée. Autoclaver le média à 121 °C et 15 lb de pression pendant 20 min, en s’assurant que la bouteille est bien bouchée. Conserver le bouillon stérile préparé à 4 °C jusqu’à utilisation.
- Préparation de gélose tryptique au soja (TSA) : Dissoudre 20 g de poudre de TSA dans 500 mL d’eau désionisée. Autoclaver le mélange de gélose à 121 °C et 15 lb pendant 20 min. Transférer le milieu stérile dans un bain-marie à 55 °C pour abaisser la température de la gélose fondue. Verser la gélose préparée refroidie sur des boîtes de Petri stériles (~15 mL) et laisser se solidifier. Entreposer les plaques de gélose solidifiées inversées pour éviter la condensation.
- Préparation tryptique de bouillon de soya (BST) : Dissoudre 15 g de poudre de BST dans 500 mL d’eau désionisée. Autoclaver le mélange de bouillon à 121 °C et 15 lb pendant 20 min. Conserver le bouillon stérile préparé à 4 °C jusqu’à utilisation.
- Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : Autoclave acheté commercialement 1x PBS à 121 °C et 15 lb pendant 20 minutes avant utilisation stérile.
- Préparation du réactif de dosage de viabilité microbienne : Équilibrer le contenu de l’essai à température ambiante. Mélanger 10 mL de tampon avec la poudre de réactif luminescent lyophilisé et conserver le réactif préparé à −20 °C sous forme d’aliquotes de 1 mL. Avant chaque point temporel, décongelez le réactif photosensible et amenez-le à température ambiante.
- Solution mère de sulfate de gentamicine : Dissoudre 80 mg de sulfate de gentamicine (GS) dans 10 mL de 1x PBS. Vortex la solution médicamenteuse à fond pour obtenir une solution mère de 8 mg/mL de GS.
- Solution mère de chlorhydrate de vancomycine : Dissoudre soigneusement 10 mg de poudre de chlorhydrate de vancomycine dans 10 mL d’eau désionisée pour obtenir une solution mère de 1 mg/mL.
- Solution tampon d’acide borique : Dissoudre 24,7 g (0,4 M) d’acide borique dans 900 mL d’eau désionisée. Ajuster le pH de la solution à 10,4 avec une solution d’hydroxyde de sodium à 50 % (p/v). Suite à cette étape, ajoutez de l’eau désionisée pour obtenir 1 L.
- Réactif O-pthaldialdéhyde (OPA) : Dissoudre 0,2 g d’OPA dans 1 mL de méthanol. Ajouter 19 mL de tampon d’acide borique 0,4 M (pH 10,4) à la solution d’OPA. Ajouter 0,4 mL de 2-mercaptoéthanol au mélange OPA-acide borique. Couvrir le flacon de réactif dans une feuille d’aluminium et conserver à 4 °C pour une utilisation jusqu’à 2-3 jours après la préparation.
ATTENTION : Évitez tout contact avec la peau, les yeux et les vêtements. La manipulation de l’OPA et des 2 réactifs au mercaptoéthanol ne doit être effectuée que sous une hotte munie d’une ventilation par aspiration appropriée, tout en portant un équipement de protection individuelle approprié. Évitez de respirer les vapeurs, la poussière ou les aérosols.
2. Préparation de l’UHMWPE vierge et chargé de médicaments
- Tamiser 2 g de sulfate de gentamicine et de poudre de chlorhydrate de vancomycine avec un tamis (taille des pores de 75 μm) et déshydrater à 45 °C dans une étuve à vide (<0,1 atm) pendant 18-24 h.
- Mélanger le médicament déshydraté avec la poudre UHMWPE à 7% p/p (1,12 g d’antibiotique + 14,88 g d’UHMWPE) dans un récipient à l’aide d’un mélangeur mécanique pendant 5 min.
- Préchauffez un moule sur mesure en bronze d’aluminium (85 mm x 50 mm) avec des plaques d’insertion en acier inoxydable à 180 °C dans un four à convection pendant 1 h. Préchauffer les plaques de la presse à 170 °C.
- Ajouter la poudre mélangée dans le moule et comprimer à 10 MPa, 170 °C pendant 10 min, suivi d’un cycle de refroidissement par eau de 45 min à 10 MPa.
- Retirez le bloc UHMWPE moulé (~3,5 mm) de la presse à l’aide d’une presse hydraulique.
- Fraisez les surfaces supérieure et inférieure du bloc à l’aide d’une commande numérique informatisée (CNC) pour éliminer les irrégularités de surface et les contaminants.
- Coupez le bloc en bandes de 3 mm x 5 mm x 20 mm à l’aide de la CNC.
- Préparer l’UHMWPE vierge (sans ajout d’antibiotiques) en utilisant la même méthodologie que celle décrite comme témoin pour l’étude.
Figure supplémentaire 1 : Parties du moule utilisées pour mouler les échantillons UHMWPE. A) Plaque d’insertion en acier inoxydable; (B) cavité de moisissure; (C) piston; (D) plaque arrière Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
3. Détermination de la cinétique d’élution de l’UHMWPE à élution médicamenteuse
- Placez une bande de 3 mm x 5 mm x 20 mm dans une seringue de 3 ml munie d’un verrou Luer et d’une aiguille de 25 g.
- Lavez la bandelette en remplissant la seringue avec de l’eau désionisée et en inversant la seringue plusieurs fois.
- Remplissez la seringue avec de l’eau désionisée jusqu’à la graduation de 2 mL.
- Placez la seringue sur un agitateur à 100 tr/min à température ambiante.
- À chaque point temporel (6 h, 1 jour, 2 jours, 3 jours, 1 semaine), prélever l’éluant dans un flacon de 2 mL.
- À chaque point de temps, lavez la bandelette en remplissant la seringue d’eau désionisée et en retournant la seringue. Jeter la solution et remplir la seringue d’eau désionisée jusqu’à la graduation de 2 ml pour poursuivre l’expérience jusqu’au prochain point temporel.
4. Détermination de la concentration en vancomycine
- Détecter la concentration de vancomycine par spectrophotométrie dans l’eau désionisée à une longueur d’onde d’absorption maximale de 280 nm.
- Préparer des étalons de plage de concentration connus en ajoutant 100 μL de solution mère de 1 mg/mL à la plaque UV 96 puits et en diluant en série avec 100 μL d’eau désionisée pour obtenir six niveaux de concentrations connues (1 mg/mL à 0,03125 mg/mL).
- Transférer 100 μL des éluants sur des plaques à 96 puits claires aux UV et déterminer la concentration à 280 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
- Générer une courbe d’étalonnage en traçant les concentrations connues du médicament par rapport aux valeurs d’absorbance correspondantes. Calculer la concentration inconnue de médicament dans l’éluant à l’aide de l’équation linéaire générée par la courbe d’étalonnage.
- Déterminer la masse du médicament en multipliant la concentration par le volume d’éluant (~1,7 mL).
- Calculez la libération cumulative de médicament (mg) à un moment donné en additionnant la libération de médicament à partir de tous les points temporels précédents.
- Normaliser la libération du médicament à la surface de la bandelette (3,5 cm 2) pour déterminer la libération cumulative de médicament par centimètre carré (cm2) de l’implant.
5. Détermination de la concentration en gentamicine par la méthode d’étiquetage OPA 27
- Préparer les solutions étalons GS pour effectuer le test OPA.
- Transvaser 1 mL de la solution GS à 80 μg/mL dans un tube à centrifuger.
- Ajouter 500 μL de PBS à cinq autres tubes à centrifuger.
- Effectuer une dilution en série avec ces tubes pour obtenir des concentrations de GS de 80 μg/mL, 40 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL et 2,5 μg/mL. Ceux-ci servent de solutions d’étalonnage pour le test.
- Dans une plaque transparente de 96 puits, ajouter 80 μL de PBS au puits A-1 et 80 μL des solutions d’étalonnage aux puits A-2 à A-7 en concentration croissante. Cela sert d’étalonnage interne pour le test.
- Ajouter 80 μL de chaque échantillon dans les puits vides en triple exemplaire pour être analysé dans la même plaque de 96 puits. Limiter le nombre d’échantillons par plaque de puits à 50 < de sorte que le moment de l’ajout de la solution d’OPA aux échantillons soit approximativement le même pour tous les échantillons et pour éviter l’évaporation.
- Ajouter le réactif OPA à toutes les normes et solutions d’échantillonnage.
- Dans une hotte, remplir un réservoir de réactif de 25 ml avec du méthanol.
- Ajouter 8 mL de méthanol et 1 mL de la solution d’OPA préparée dans un deuxième réservoir de réactif (section 1.8). Bien mélanger la solution en tuyautant de haut en bas.
- À l’aide d’une micropipette multicanal de 100 μL, ajouter 48 μL de méthanol du premier réservoir à tous les puits contenant des échantillons dans la plaque de 96 puits.
- À la suite de cette étape, ajouter 72 μL de solution d’OPA diluée du deuxième réservoir à tous les puits contenant des échantillons dans la plaque de 96 puits. Incuber la plaque de puits pendant 10 min à température ambiante.
- Mesurer l’intensité de fluorescence (excitation de 340 nm, émission de 455 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques immédiatement après l’incubation de 10 minutes.
- Tracer la courbe d’étalonnage en utilisant les lectures d’intensité pour les solutions avec des concentrations connues de GS. Ajoutez une ligne linéaire pour déterminer le meilleur ajustement et générer l’équation correspondante.
- Calculer la concentration du médicament dans l’éluant à partir des courbes d’étalonnage générées en traçant les concentrations connues du médicament par rapport aux valeurs d’absorbance correspondantes.
- Calculer la masse du médicament en multipliant la concentration par le volume d’éluant (~1,7 mL).
- Déterminez la libération cumulative de médicament (mg) à un moment donné en additionnant la libération de médicament à partir de tous les points temporels précédents.
- Normaliser la libération du médicament à la surface de la bandelette (3,5 cm 2) pour déterminer la libération cumulative de médicament par centimètre carré (cm2) de l’implant.
6. Préparation des bactéries
REMARQUE : Les souches de S. aureus suivantes ont été utilisées dans cette étude : souche type 12600, souches cliniques L1101 et L1163 (obtenues du Dr Kerry LaPlante de l’Université du Rhode Island). Les profils de sensibilité de ces souches sont présentés dans le tableau 1.
| Souches bactériennes | Gentamicine MIC | CMI de vancomycine | |
| ATCC 12600 | ≤1 μg/mL (sensible) | ≤0,5 μg/mL (sensible) | |
| L1101 (souche clinique) | ≥16 μg/mL (résistant) | 8 μg/mL (intermédiaire) | |
| L1163 (souche clinique) | ≤1 μg/mL (sensible) | 8 μg/mL (intermédiaire) | |
Tableau 1 : Profils de sensibilité aux antibiotiques des souches témoins et cliniques de S. aureus.
ATTENTION : Toutes les étapes impliquant la manipulation de cultures bactériennes et de suspensions ont été effectuées dans un espace de laboratoire BSL-2 dans une enceinte de biosécurité de classe II, type A2.
- Décongeler les stocks bactériens de −80 °C sur des plaques de TSA pour faciliter la croissance de S. aureus. Incuber statiquement les plaques pendant une nuit à 35 °C.
- Transférer deux à trois colonies des cultures sur plaques de gélose cultivées pendant la nuit dans 1 mL de BST stérile, puis incuber statiquement pendant la nuit à 35 °C.
- Transférer 100 μL de bactéries dans une plaque transparente de 96 puits pour mesurer spectrophotométriquement la turbidité en déterminant l’absorbance à 600 nm.
- Diluer les bactéries 10 000x à l’aide de MHB stérile avant de déterminer le nombre de bactéries viables à l’aide du test luminescent.
7. Réalisation de l’essai de viabilité microbienne en temps réel
- Effectuez le test basé sur la luminescence à l’aide de plaques blanches opaques à fond opaque à 96 puits.
- Mélanger 100 μL de suspensions bactériennes diluées avec 100 μL de réactif d’essai préparé dans la section 1.5.
- Placez un couvercle recouvert de papier d’aluminium sur la plaque préparée à 96 puits et incuber pendant 5 minutes en secouant 100 tr/min.
- Mesurez immédiatement la luminescence avec un lecteur de microplaques en utilisant les paramètres suivants du logiciel Gen5 3.11.
- Cliquez sur Nouveau pour configurer un protocole dans la fenêtre Gestionnaire des tâches .
- Sélectionnez Costar 96 blanc opaque dans le menu déroulant pour Type de plaque.
- Cliquez sur Lire dans le menu Sélectionner les étapes > les actions .
- Cliquez sur Luminescence dans la fenêtre Méthode de lecture. Conservez les options Endpoint/kinetic et Luminescence fiber sélectionnées sous type de lecture et type d’optique, respectivement. Cliquez sur OK.
- Conservez les paramètres
dans la fenêtre Étape de lecture (gain = 135 ; temps d’intégration = 1 seconde ; hauteur de lecture = 4,5 mm). Cliquez sur OK. - La fenêtre de disposition des plaques apparaît prête pour l’exécution. Cochez la case Utiliser le couvercle dans la fenêtre de la plaque de chargement, puis cliquez sur OK.
- Placez la plaque de 96 puits dans la machine pour lire les valeurs de luminescence.
8. Génération d’une courbe standard de luminescence par rapport au comptage viable pour chaque souche bactérienne
NOTE : Cultiver et énumérer toutes les souches de S. aureus selon la méthodologie décrite à la section 6.
- Préparer des suspensions bactériennes diluées en série pour servir d’étalons.
- Énumérer la suspension bactérienne cultivée pendant la nuit en mesurant spectrophotométriquement la turbidité.
- Centrifuger à 6 000 × g pendant 5 minutes pour granuler les bactéries, et remettre la pastille en suspension dans du MHB stérile pour ajuster la concentration à 1 x 109 UFC/mL.
- Diluer 100 μL de suspension pure en utilisant 900 μL de MHB et effectuer une dilution en série 10 fois pour atteindre 1 x 101 UFC/mL.
- Effectuer le test de luminescence sur les suspensions bactériennes préparées comme décrit à la rubrique 7.
- Utiliser le MHB stérile comme témoin à blanc pour l’expérience et soustraire la valeur de luminescence à blanc des valeurs de luminescence de l’échantillon d’essai.
- Tracez le log (CFU) par rapport au log (luminescence) pour générer une courbe standard. Notez l’équation et la valeur R2 .
- Déterminer l’UFC/mL correspondant aux valeurs de luminescence à l’aide de l’équation spécifique à la souche tout au long de l’étude.
9. Configuration de l’étude de l’activité antibactérienne dépendante du temps
Figure 1 : Représentation schématique de la configuration expérimentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Culture de la bactérie pendant la nuit dans 1 mL de bouillon de BST.
- Diluer la suspension bactérienne cultivée pendant la nuit à 105 UFC/mL dans du MHB stérile (section 6) et vérifier le nombre de bactéries viables à l’aide des unités de luminescence avant le début de l’expérience (section 7).
- Placer les bandelettes UHMWPE vierges et les bandelettes UHMWPE chargées de médicaments (3 mm x 5 mm x 10 mm, soit la moitié de la dimension des bandelettes préparées pour les études d’élution de la section 2) dans une seringue de 3 mL.
- Aspirer le MHB contenant 10 5 UFC/mL dans la seringue à l’aide de l’aiguille fixée jusqu’à la marque de1,5 mL, ce qui équivaut à 1,35 mL de MHB (Figure 1 : Étape 1).
- Placez la seringue sur un incubateur à agitation (100 tr/min) à 37 °C jusqu’aux points temporels indiqués de 6 h, Jour 1, Jour 2, Jour 3, Jour 4, Jour 5, Jour 6 et Jour 7 (Figure 1 : Étape 2).
- À chaque point temporel indiqué, retirez la configuration de la seringue et effectuez un test de viabilité microbienne en temps réel conformément à la section 7 sur 100 μL de suspension bactérienne (Figure 1 : Étape 3-4).
- Déterminez le nombre de bactéries viables pour les points temporels 6 h, Jour 1, Jour 2, Jour 3 et Jour 7. Déterminer l’UFC/mL à partir des unités de luminescence à l’aide de la courbe standard correspondante.
- Vérifier l’absence de bactéries viables dans les échantillons dont les valeurs de luminescence étaient inférieures à la limite de détection en appliquant la méthode de la plaque étalée sur des plaques TSA et en incubant à 35 °C pendant une nuit. Vérifiez la présence de colonies le lendemain.
- Centrifuger la suspension bactérienne restante à 10 000 × g pendant 10 min, puis aspirer doucement le milieu usé. Dans le cas des tubes dans lesquels les pastilles ne sont pas observées visuellement en raison de l’activité antibactérienne des médicaments, laisser 100 μL dans le tube pour vous assurer que la pastille invisible n’est pas dérangée (Figure 1 : Étape 5).
- Remettez en suspension les bactéries granulées dans du MHB frais et retirez la suspension bactérienne dans la même seringue à l’aide de l’aiguille fixée (Figure 1 : Étape 6).
10. Quantification des bactéries adhérentes sur la surface de l’UHMWPE
- Récupérez les surfaces vierges UHMWPE et UHMWPE chargées de médicaments de la seringue après la fin de l’étude le jour 7.
- Transférer les surfaces dans des tubes de 1,5 mL et rincer avec 1 mL de PBS stérile (trois fois).
- Sonicer la surface pendant 40 min dans 1 mL de PBS stérile. Déterminer la viabilité des bactéries adhérentes en effectuant un essai de luminescence sur 100 μL de l’échantillon soniqué, comme décrit à la section 7.
Representative Results
Conformément au protocole, l’UHMWPE a été moulé avec de la gentamicine et de la vancomycine à 7% p/p et élué dans de l’eau désionisée. La concentration de drogue dans l’éluant à partir du matériau a été déterminée à 6 h, 1 jour, 2 jours, 3 jours et 1 semaine. La libération de vancomycine et d’UHMWPE chargée de gentamicine a démontré une libération en rafale à 6 heures, suivie d’un taux de libération constant avec une concentration de libération supérieure à la concentration minimale inhibitrice (CMI) jusqu’à 7 jours (figure 2, tableau 2).
Avant l’étude antibactérienne, une courbe standard a été générée pour corréler les unités de luminescence à l’UFC/ml des bactéries pour chaque souche de S. aureus (ATCC 12600, L1101 et L1163). Les valeurs logarithmiques (luminescence) correspondantes ont été tracées par rapport au log (UFC/mL) pour générer une courbe standard (figure 3). Les valeurs R2 calculées étaient respectivement de 0,997, 0,996 et 0,994 pour les ATCC 12600, L1101 et L1163, ce qui indique un ajustement fort pour la plage de concentration. L’équation dérivée a ensuite été utilisée pour calculer la viabilité bactérienne dans toutes les expériences. Les normes ATCC 12600 et L1101 ont démontré une limite de détection comprise entre 1 x 102-1 x 103 UFC/mL. D’autre part, la limite de détection pour la souche L1163 a été montrée à 1 x 104 UFC/mL.
L’essai d’activité antibactérienne dépendant du temps a été effectué en utilisant 1 x 105 UFC / mL comme inoculum de départ pour 12600, L1163 et L1101, qui ont été exposés à 7% p/p de matériaux à élution de médicament pendant une période de 1 semaine. À chaque point temporel (6 h, 1 jour, 2 jours, 3 jours, 1 semaine), le milieu a été rafraîchi et la population bactérienne a été remise en suspension. L’exposition des bactéries à la libération subséquente de médicaments à partir du matériau s’est poursuivie jusqu’au point temporel suivant. L’UHMWPE avec 7 % p/p de vancomycine et l’UHMWPE avec 7 % p/p de gentamycine ont démontré une réduction de >3log pour la sensibilité à l’ATCC 12600 à partir de 6 h, et une éradication complète (aucune croissance de colonie) a été observée au bout de 3 jours (figure 4A). Pour la souche L1163 sensible à la gentamicine et intermédiaire à la vancomycine, les deux matières à élution médicamenteuse ont entraîné une réduction de >3 log à 6 h, et une éradication complète (absence de croissance de colonies) a été observée au jour 1 de l’expérience (figure 4B). Pour la souche L1101 résistante à la gentamicine et intermédiaire à la vancomycine, l’élution de gentamicine par l’UHMWPE n’a pas affecté la viabilité bactérienne de L1101 (figure 4C). La bactérie a proliféré et la population s’est stabilisée en 6 heures en présence d’UHMWPE vierge sans élution antibiotique. En présence d’UHMWPE à élution de gentamicine, la population a atteint un niveau de croissance similaire au jour 2. Au contraire, l’élution de vancomycine par l’UHMWPE a significativement réduit la viabilité bactérienne (>3log) à 6 h, et la perte complète de viabilité (pas de croissance de colonie) a été démontrée au jour 4.
Les surfaces de l’UHMWPE à élution de gentamicine et à élution de vancomycine n’ont montré aucune bactérie adhérente viable lorsqu’elles ont été exposées à des souches sensibles et résistantes aux intermédiaires après le jour 7 ou l’éradication complète, selon la première éventualité. Certaines bactéries viables (1 x 105 UFC/mL) étaient présentes sur l’UHMWPE à élution de gentamicine exposé à la L1101 résistante à la gentamicine. De même, environ 1 x 10 5 UFC/mL de bactéries adhérentes viables ont été récupérées dans l’EP vierge témoin (figure 5).
Figure 2 : Libération moyenne d’antibiotiques en fonction du temps à partir d’une bandelette UHMWPE chargée d’antibiotiques à 7 % p/p. La libération moyenne d’antibiotiques entre les points temporels d’une bandelette UHMWPE chargée de gentamicine à 7 % p/p et de vancomycine (3 mm 3 x 5 mm 3 x 10 mm3 ~ 2 cm2 surface). La CMI contre la souche témoin ATCC 12600 est représentée par une ligne pointillée pour la gentamicine et une ligne continue pour la vancomycine. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne à partir de six répétitions (n = 6). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Courbe étalon luminescente en temps réel pour toutes les souches de S. aureus. Le log (luminescence) a été tracé en fonction du log (UFC/mL) pour générer des courbes standard pour le contrôle, (A) ATCC 12600, et les souches cliniques, (B) L1101 et (C) L1163. Les équations décrivant la droite du meilleur ajustement et les valeurs R2 correspondantes sont indiquées sur les graphiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Viabilité bactérienne déterminée à l’aide d’un test luminescent pour l’UHMWPE à 7 % p/p à élution de gentamicine et l’UHMWPE à élution de vancomycine à 7 % p/p. L’activité antibactérienne dépendante du temps de la gentamicine et de la vancomycine éluées de l’UHMWPE contre les souches témoins, (A) ATCC 12600, et les souches cliniques, (B) L1163 et (C) L1101, sont montrées. Virgin 1020 PE a servi de contrôle pour l’expérience. La ligne jaune dans les graphiques indique la limite de détection pour la souche respective de S. aureus. Les données sont présentées sous forme d’écart type moyen ± (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Viabilité des bactéries adhérentes déterminée à l’aide du test luminescent Glo pour 7 % p/p d’UHMWPE à élution de gentamicine et d’UHMWPE à élution de vancomycine à 7 % p/p contre toutes les souches de S. aureus. Le diagramme à barres indique les bactéries adhérentes (UFC) récupérées par centimètre carré (cm2) de 7 % d’UHMWPE chargé de gentamicine et de 7 % d’UHMWPE chargé de vancomycine à la fin de la période d’étude pour toutes les souches testées. Les barres présentent les données sous forme de moyenne ± écart-type (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Points temporels | Vancomycine | Gentamicine |
| Concentration maximale (μg/mL) | Concentration maximale (μg/mL) | |
| 0 - 6 h | 336 ± 72 | 263 ± 24 |
| 6 h -1 jour | 57 ± 18 | 16 ± 2 |
| 1 jour - 2 jours | 60 ± 18 | 7 ± 1 |
| 2 jours - 3 jours | 23 ± 6 | 5 ± 0,4 |
| 3 jours - 7 jours | 49 ± 20 | 15 ± 1 |
Tableau 2 : Concentration maximale du médicament (μg/mL) à différents moments. Les données sont présentées sous forme d’écart type moyen ± (n = 6).
Figure supplémentaire 2 : Désintégration du signal de luminescence sur une période de 10 minutes à compter de l’ajout du réactif de dosage à l’échantillon. Une différence de ±5% dans le signal est indiquée par une ligne pointillée Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
L’administration soutenue localisée d’antibiotiques est un outil nécessaire dans la prise en charge des infections articulaires périprothétiques. Les antibiotiques systémiques sont la principale stratégie d’éradication de l’infection bactérienne, et l’élution locale est utilisée comme un outil complémentaire pour empêcher la croissance et la colonisation de toute bactérie restante après le retrait de l’implant et le débridement du tissu. L’objectif pour l’aire efficace sous la courbe (concentration sur une période) pour les antibiotiques avec administration locale n’est pas bien compris. L’élution des antibiotiques de ces dispositifs peut être quantifiée longitudinalement in vitro; Cependant, pour déterminer la valeur translationnelle de ces profils de concentration, une méthode in vitro robuste pour évaluer l’activité antibactérienne est nécessaire. Dans cet article, une telle méthode en temps réel est décrite pour déterminer l’activité antibactérienne de l’UHMWPE à élution médicamenteuse à utiliser comme dispositif d’administration soutenue dans les remplacements articulaires.
La surveillance en temps réel de la viabilité bactérienne est un paramètre d’intérêt crucial, et les méthodes microbiologiques conventionnelles n’ont pas le cadre nécessaire pour tenir compte de cet aspect spécifique de l’étude. Le test de viabilité microbienne utilisé dans cette étude a été développé pour la quantification des bactéries viables en mesurant la luminescence correspondant à l’adénosine triphosphate (ATP). Pour étudier directement l’activité dépendante du temps des antibiotiques élués à partir des matériaux implantaires, trois souches différentes avec des profils de sensibilité aux antibiotiques distincts ont été incubées avec eux. La justification de l’utilisation de souches de laboratoire et cliniques présentant des résistances variables à la gentamicine et à la vancomycine était de comprendre l’étendue d’activité d’une formulation implantaire donnée. De plus, l’activité antibactérienne et l’efficacité contre ces populations distinctes dépendent du moment de l’administration. La méthode se concentre sur la faisabilité d’une prophylaxie contre ces souches basée sur >70% des infections articulaires périprothétiques causées par la contamination de la plaie au moment de la chirurgie24.
Comme inoculum de départ pour développer cette méthode, 1 x 105 UFC/mL a été utilisé. Différentes concentrations de contaminants ont été utilisées pour les modèles animaux, bien que l’on ne sache pas grand-chose sur la charge infectieuse cliniquement pertinente pour l’ICP. Des modèles d’infection animale pour l’ICP ont été systématiquement établis en utilisant 1 x 105 UFC, et une plage similaire est largement utilisée dans les méthodes normalisées (CLSI) pour déterminer l’activité antibactérienne25,26,27. L’utilisation de 1 x 105 UFC/mL comme concentration initiale de contamination nous a permis d’évaluer simultanément les paramètres de croissance et d’éradication.
Classiquement, les valeurs de CMI sont déterminées pour une concentration constante d’antibiotiques pour un nombre spécifique de bactéries, et elles ne parviennent pas à démontrer le taux d’action antibactérienne. En raison de cet aspect, les valeurs de CMI ne fournissent pas de différenciation quantitative pour décrire le profil d’activité antimicrobienne28. Les données de la méthode actuelle soulignent l’avantage d’évaluer la cinétique de destruction des antibiotiques en fonction de la souche plutôt que d’utiliser la CMI pour prendre des décisions posologiques. En utilisant cette méthode, il a été possible de différencier à la fois l’étendue et la vitesse à laquelle les matériaux de l’implant affectaient les différentes souches. La gentamicine éluée des bandelettes de matériau de l’implant a été efficace pour éradiquer L1163 en 1 jour et éradiquer ATCC 12600 en 2-3 jours, mais elle a été inefficace pour éradiquer L1101 (Figure 4). En plus de l’absence prévue d’activité de l’élution de gentamicine contre L1101 (CMI >32 μg/mL) en raison de sa résistance inhérente à la gentamicine (figure 4C), la persistance de sous-populations a été observée lorsqu’elles étaient exposées à la vancomycine, pour laquelle L1101 présente une résistance intermédiaire. En revanche, L1163 a été définitivement éradiqué en présence d’UHMWPE à élution de vancomycine malgré une résistance intermédiaire similaire à la vancomycine que L1101 (une CMI de 8 μg/mL a été observée pour les deux souches).
Les observations selon lesquelles le taux d’activité de la gentamicine contre 12600 et L1163, qui sont sensibles à la gentamicine avec des valeurs de CMI similaires (une CMI de 1 μg/mL a été observée pour les deux souches), était différent, ainsi que l’étendue de l’activité de la vancomycine contre les L1101 et L1163 résistantes aux intermédiaires était différente (figure 4A,B), appuyait l’hypothèse selon laquelle cette méthode en temps réel en présence du matériau à élution pouvait différencier les différences longitudinales dans l’activité.
En plus de la valeur translationnelle des résultats dans l’interprétation de l’efficacité d’une concentration éluée donnée contre ces bactéries, il existe plusieurs avantages méthodologiques expérimentaux. (1) La concentration bactérienne est déterminée instantanément à un moment donné, contrairement aux méthodes conventionnelles dans lesquelles les bactéries sont incubées dans un bouillon ou sur gélose pendant 18 à 24 heures pour déterminer la viabilité. Cette période de croissance peut donner plus de temps aux bactéries pour se remettre du stress antibiotique, introduisant une source supplémentaire possible d’erreur / variabilité. (2) Le milieu est continuellement remplacé tout en conservant les bactéries, ce qui ressemble plus à des conditions in vivo qu’à des conditions statiques. (3) Ce test inclut intrinsèquement la cinétique de libération du médicament de l’implant, ce qui permet une meilleure prédiction des performances. (4) La méthode a été mise au point à l’aide de consommables couramment disponibles sans nécessiter de machines spécifiques ou coûteuses.
Des méthodes d’essai in vitro robustes pour évaluer les applications d’administration de médicaments sont nécessaires avant de procéder à des études in vivo sur des animaux et à des essais cliniques. Ce test peut être modifié et adapté pour s’adapter à diverses approches et plates-formes d’administration de médicaments telles que des particules, des gels, des films et d’autres matériaux à élution de médicaments afin de déterminer l’efficacité de l’éradication bactérienne dans une configuration simulée in vitro. Des modifications peuvent être effectuées pour la configuration de l’échantillon en passant à un environnement de milieu in vitro approprié, qui a été montré pour influencer l’activité de plusieurs antibiotiques29,30.
La méthode facilite également la détermination viable des bactéries adhérentes, ce qui est prometteur, car les méthodes conventionnelles pour déterminer la concentration minimale d’éradication du biofilm prennent du temps et donnent des résultats incohérents. Cependant, la méthode doit être rigoureusement testée sur des biofilms afin de développer une méthodologie fiable et robuste pour déterminer sa sensibilité. La méthode luminescente à base d’ATP pourrait être suffisamment sensible pour détecter des formes viables de bactéries dans les biofilms, y compris les persistants, qui peuvent ou non être détectés sur une plaque de gélose en tant que colonies visibles. Ensemble, cette plateforme polyvalente a le potentiel d’intégrer des paramètres pertinents pour enregistrer des observations en temps réel sur l’activité antibactérienne et antibiofilm des médicaments d’intérêt.
L’efficacité de cette méthode est régie par les aspects suivants:
Caractéristiques d’élution et taille de l’échantillon prédéterminées
Le profil d’élution du matériau à élution antibiotique peut être identifié dans une expérience distincte avant cette mesure de l’activité antibactérienne, de sorte que la quantité de matériel nécessaire pour mener activement l’expérience dans un délai stipulé puisse être déterminée.
Détermination du conteneur et du volume
Il est important de concevoir une configuration dans laquelle le volume du milieu de l’expérience peut accueillir toute la surface du même matériau et d’assurer un volume suffisant pour la libération sans obstruction du médicament de la surface chargée de drogue. La configuration utilisée était basée sur des expériences antérieures, assurant des conditions de « puits parfaits » pour ces médicaments hydrophiles de sorte que leur diffusion ne soit pas entravée par des limitations de solubilité.
Caractéristiques des milieux de croissance
La sélection des milieux de croissance doit être étudiée pour assurer la stabilité et le rendement optimal du ou des médicaments sélectionnés29. Le bouillon Mueller Hinton ajusté aux cations (CAMHB), qui est largement utilisé dans la méthode de dilution du bouillon, a été utilisé pour déterminer la CMI des antibiotiques connus. Le milieu permet une activité médicamenteuse optimale sans interférence de l’accumulation de métabolites secondaires toxiques31. Le réactif de dosage a été testé et déclaré stable dans différents types de milieux, y compris ceux contenant des composants sériques23,28. Bien que les valeurs relatives des unités de luminescence puissent varier d’un milieu à l’autre, il a été démontré que les composants du milieu n’interfèrent pas avec le test32,33. Le volume expérimental a été optimisé à 1,5 mL, ce qui est proche du volume de liquide synovial présent dans un espace articulaire du genou adulte34.
Stabilité de la température pour le test
La manipulation et l’ajout du réactif luminescent au test doivent être effectués de manière cohérente dans toutes les expériences. Les changements de température modifient la sensibilité du test, il est donc important d’incuber le réactif à température ambiante pendant 2 h avant de l’ajouter à la bactérie23.
Temps d’incubation du réactif
La luminescence du réactif se désintègre avec le temps. Le signal luminescent a une demi-vie de plus de 30 min, qui dépend en grande partie du milieu et du type de bactérie utilisé dans l’expérience23. De plus, toute différence dans le temps d’incubation (c.-à-d. le temps entre l’ajout du réactif à la bactérie et la lecture de la luminescence) entraînera des lectures incohérentes pour la même concentration de bactéries. Une différence de 5 % a été observée dans le signal luminescent lorsqu’il a été pris dans les 1 minute suivant le temps d’incubation de 5 minutes selon les instructions du fabricant (figure supplémentaire 2). Compte tenu de ces données, les lectures de luminescence ont été enregistrées en 1 minute tout au long de l’étude pour s’assurer que la perte de signal ne dépassait pas 5%. De plus, il est important de limiter le nombre d’échantillons par plaque afin de réduire l’erreur introduite en raison de la désintégration par luminescence du premier puits au dernier puits.
Maintien de la population bactérienne tout au long de l’étude
La méthode a tenté de modéliser la clairance du médicament et le renouvellement du volume synovial en séparant continuellement les milieux usés de la population bactérienne à chaque point temporel en utilisant une centrifugation à grande vitesse à 10 000 x g pendant 10 min35. Cette étape critique assure la sédimentation de toutes les cellules bactériennes viables et non viables. De plus, les bactéries sédimentées sont uniformément reconstituées dans du MHB frais et transférées dans la configuration de la seringue, ce qui facilite le transfert complet de la population microbienne affectée vers la configuration expérimentale. La reproductibilité et la fiabilité de cette méthode reposent fortement sur la simulation de l’exposition prolongée aux antibiotiques de la population microbienne dérivée de l’inoculum initial.
L’une des principales limites de cette méthode est qu’il s’agit d’un test semi-statique qui ne simule pas avec précision les demi-vies des médicaments et le renouvellement synovial continu. Cependant, le remplacement continu du milieu compense partiellement cette limitation. La sensibilité de l’essai de viabilité microbienne dépendait de la souche, allant de 1 x 102-1 x 104 UFC/mL, ce qui limite la capacité de détection. De plus, une courbe standard doit être tracée pour chaque organisme, car le type de souche contribue à la sensibilité et à la performance du réactif luminescent. La dynamique de croissance des bactéries et l’activité du composé médicamenteux utilisé peuvent être affectées par les composants du milieu, qui devraient être étudiés plus avant.
Disclosures
L’auteur principal (E.O.) reçoit des redevances provenant de la concession de licences de propriété intellectuelle aux sociétés suivantes : Corin, Iconacy, Renovis, Arthrex, ConforMIS, Meril Healthcare, Exactech. Il n’y a aucun conflit d’intérêts avec aucune des études présentées ici.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par la subvention n ° AR077023 (R01) des National Institutes of Health et par le Harris Orthopaedic Laboratory. Les auteurs remercient la Dre Kerry Laplante et son équipe de l’Université de Rhode Island d’avoir fourni les souches cliniques L1101 et L1163.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates - polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
| ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
| BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
| BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
| BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
| Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
| Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
| Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
| Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
| Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
| Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
| Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
| Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
| Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
| press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
| ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
| Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
| UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
| Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
| WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |
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