Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת היעילות האנטיבקטריאלית של פולימר פולט אנטיביוטיקה כדי לדמות יישום קליני מניעתי באמצעות בדיקת כדאיות מיקרוביאלית זוהרת מבוססת ATP זמינה מסחרית בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת ניטור של הפעילות האורכית של חומרים פולטי תרופות וניתן להתאים אותה באופן נרחב לבדיקת פלטפורמות אספקת תרופות אנטי-מיקרוביאליות.
Abstract
פוליאתילן במשקל מולקולרי גבוה במיוחד (UHMWPE) נמצא בשימוש נרחב בארתרופלסטיקות מפרקים כוללות כמשטח נושא עומס. דלקות מפרקים פריפרוסתטיות, שרובן מתרחשות זמן קצר לאחר החלפת המפרקים, מהוות כמעט 25% מכלל ניתוחי תיקון הברך, ומיגור מוחלט של זיהום חיידקי מהווה אתגר גדול. דרך מבטיחה להתמודד עם בעיה זו היא להבטיח אספקה מקומית מתמשכת של ריכוזי אנטיביוטיקה מספיקים כדי לעכב את החיידקים כדי לתמוך במניעה אנטיביוטית מערכתית שגרתית. יש מחקר מוגבר על פיתוח של מכשירים מקומיים יעילים לאספקת תרופות. למרות שניתן להשתמש בשיטות בדיקה אנטיבקטריאליות מבוססות לתרופות כדי לבדוק את היעילות האנטיבקטריאלית של חומרים פולטי תרופות, הן חסרות במונחים של מתן נתוני יעילות אנטיבקטריאליים בזמן אמת ולאורך שניתן לקשר אותם לפרופילי הפליטות של אנטיביוטיקה ממכשירים אלה. כאן, אנו מדווחים על מתודולוגיה ישירה ורב-תכליתית לקביעת היעילות האנטיבקטריאלית של שתלי UHMWPE פולטי אנטיביוטיקה. מתודולוגיה זו יכולה לשמש כפלטפורמה למניעת תרבית חיידקים בכל נקודת זמן של ניסוי ארוך וניתן להתאים אותה גם למכשירים מקומיים אחרים להעברת תרופות.
Introduction
דלקת מפרקים ניוונית היא מחלה ניוונית משמעותית ממנה סובלים 500 מיליון מבוגרים ברחבי העולם1. תקן הזהב בטיפול בדלקת מפרקים סופנית הוא החלפת מפרקים כוללת, אשר צפויה להתבצע בלמעלה מ -2 מיליון חולים בשנה בארצות הברית לבדה עד שנת 20302, כאשר גם הביקוש העולמי גדל מאוד 3,4. ההליך כולל החלפת משטחי הסחוס המפרקיים של המפרקים בחומרים סינתטיים נושאי עומס עשויים מתכת/קרמיקה ופוליאתילן בעל משקל מולקולרי גבוה במיוחד (UHMWPE). סה"כ החלפות המפרקים משפרות משמעותית את איכות החיים של חולים הסובלים מדלקת פרקים5, אך סיבוך משמעותי המסכן את ביצועי השתלים ואת שביעות רצונם של המטופלים הוא זיהום מפרקים פריפרוסתטי (PJI), המהווה 15%-25% מניתוחי התיקון6. הגורם לזיהום ברוב המקרים הוא האמין זיהום מיקרוביאלי של אתר השתל במהלך ניתוח7. האוכלוסייה המזהמת מתרחבת על משטחי השתל והרקמה8. מערכת החיסון של המאכסן מופעלת בתגובה, אך קצב הגדילה והיווצרות הביופילם של האורגניזמים המזהמים יכולים לאפשר להם לחמוק מתאי החיסון, מה שיכול להוביל לסערת ציטוקינים וכימוקינים מוגברת ללא חיסול החיידק 9,10,11. הזיהום העמוק שנוצר כתוצאה מכך של העצם מסכן את הקיבוע והביצועים של השתל, כמו גם את בריאותו של המטופל12.
Staphylococcus aureus ו staphylococci שלילי coagulase הם אורגניזמים סיבתיים השולטים של PJI13. חומרת זיהומים סטפילוקוקליים גבוהה בשל עמידותם המוגברת לאנטיביוטיקה, היווצרות ביופילם ויכולתם להתמיד כגרסאות מושבה קטנות14,15,16. זיהומים הקשורים לשתלים מתרחשים עקב הידבקות מיקרואורגניזמים על פני השטח של השתל והקמת מטריצת ביופילם מורכבת המאפשרת לחיידקים לחמוק מגורמים חיסוניים מזיקים של המאכסן ומריכוזים יעילים של אנטיביוטיקה14,15,16. שיטות הטיפול הקונבנציונליות כוללות שילובי אנטיביוטיקה תוך ורידי ודרך הפה לתקופה ממושכת17. חסרון מרכזי של גישה זו הוא הזמינות הביולוגית הנמוכה של התרופה באתר הזיהום והקושי להשיג ריכוזים מספיקים של אנטיביוטיקה כדי לחסל את החיידק באופן עקבי לאורך תקופת הטיפול, מה שמביא לעתים קרובות לתוצאות גרועות18. כדי להתמודד עם חסרונות אלה, שתל UHMWPE מקומי מתפקד באופן מלא ופולט תרופות תוכנן להבטיח שחרור מתמשך של ריכוזים יעילים של אנטיביוטיקה לחלל המפרק19. פליטה מקומית מהשתל פולט התרופה משמשת ככלי משלים למניעת צמיחה והתיישבות של כל החיידקים שנותרו לאחר הסרת השתל והטריית הרקמה. בדיקות אנטיבקטריאליות במבחנה של UHMWPE פולט אנטיביוטיקה זה יכולות להתבצע על ידי דגירה ישירה של החומר עם החיידקים וכימות החיידקים בשיטת צלחת התפשטות20,21. לחילופין, ניתן לבדוק אליציטוטים של מדיה אלואנטית כנגד חיידקים בשיטות כגון שיטת דיפוזיית דיסק אגר, שיטות דילול מרק ובדיקת הרג זמן22. כל השיטות הללו מסתמכות על תצפית גדילה כ-16-18 שעות לאחר איסוף האליציטוטים באמצעות ספירת מושבות ומדידות עכירות. את הפליטות של אנטיביוטיקה ממכשירים כאלה ניתן לכמת לאורך זמן באמצעות שיטות אלה במבחנה; עם זאת, כדי לקבוע את הערך התרגומי של פרופילי ריכוז אלה, יש צורך בשיטת מבחנה חזקה בזמן אמת להערכת פעילות אנטיבקטריאלית.
בדיקת הכדאיות המיקרוביאלית ששימשה במחקר זה פותחה לכימות של חיידקים בני קיימא על ידי מדידת הלומינסנציה המתאימה לאדנוזין טריפוספט (ATP) המשתחרר מתא חיידק חי באמצעות טכנולוגיית זיהוי מבוססת לוציפרין-לוציפראז. ATP, כמטבע האנרגיה של תאים חיים, משמש אינדיקטור ישיר של תאים קיימא מבחינה פיזיולוגית. מגיב מבצע ליזה התא, אשר משחרר מולקולות ATP מתאים קיימא כי הם מזוהים לאחר מכן בצורה של luminescence. להארה זו יש קשר ישיר לשיעור תאי החיידקים הקיימים במדגם23. זוהי בדיקה בזמן אמת, פשוטה, רב-תכליתית, מהירה, מבוססת מגיב יחיד, שניתן להתאים למגוון עיצובים ותנאים של בדיקות עם מיקרואורגניזמים גראם-חיוביים וגראם-שליליים כאחד. כאן אנו מדווחים על שיטה לקביעת הפעילות האנטיבקטריאלית בזמן אמת של UHMWPE פולט אנטיביוטיקה המודגרת עם זנים מעבדתיים וקליניים של S. aureus באמצעות בדיקת הרג זמן שונה המבוססת על בדיקת הכדאיות המיקרוביאלית (למשל, BacTiter Glo). בעוד שהמתודולוגיה מתוארת עם חומר שתל ספציפי ויישום אורתופדי ספציפי, השיטה יכולה לספק פלטפורמה לבדיקת מכשירים אחרים למתן אנטיביוטיקה עם יישומים קליניים.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים
- הכנת מרק מולר-הינטון (MHB): יש להמיס 22 גרם של MHB מותאם קטיון ב-1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה. יש להפעיל את המדיה בלחץ של 121°C ו-15 ליברות למשך 20 דקות, ולוודא שהבקבוק סגור באופן רופף. אחסנו את המרק הסטרילי המוכן ב-4°C עד לשימוש.
- הכנת אגר סויה טריפטי (TSA): יש להמיס 20 גרם אבקת TSA ב-500 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה. הוציאו את תערובת האגר בטמפרטורה של 121°C ו-15 ליברות למשך 20 דקות. העבירו את המדיה הסטרילית לאמבט מים בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס כדי להוריד את הטמפרטורה של האגר המותך. יוצקים את האגר המוכן המקורר על כלי פטרי סטריליים (~ 15 מ"ל), ומניחים לו להתמצק. אחסנו את לוחות האגר המוצקים הפוכים כדי למנוע עיבוי.
- הכנת ציר סויה טריפטי (TSB): יש להמיס 15 גרם אבקת TSB ב-500 מ"ל מים נטולי יונים. הוציאו את תערובת המרק בטמפרטורה של 121°C ו-15 ליברות למשך 20 דקות. אחסנו את המרק הסטרילי המוכן ב-4°C עד לשימוש.
- מלח חוצץ פוספט (PBS): Autoclave רכשה באופן מסחרי PBS אחד ב 121 ° C ו 15 ליברות במשך 20 דקות לפני שימוש סטרילי.
- הכנת מגיב בדיקת כדאיות מיקרוביאלית: איזון תוכן הבדיקה לטמפרטורת החדר. מערבבים 10 מ"ל של חיץ עם אבקת מגיב זוהר lyophilized, ולאחסן את מגיב מוכן ב -20 ° C כמו 1 מ"ל aliquots. לפני כל נקודת זמן, הפשירו את המגיב הרגיש לאור, והביאו אותו לטמפרטורת החדר.
- תמיסת מלאי ג'נטמיצין סולפט: ממיסים 80 מ"ג גנטמיצין סולפט (GS) ב-10 מ"ל של 1x PBS. מערבול את הפתרון התרופתי ביסודיות כדי לקבל תמיסת מלאי GS 8 מ"ג / מ"ל.
- Vancomycin hydrochloride תמיסת מניות: להמיס 10 מ"ג של אבקת vancomycin hydrochloride ביסודיות ב 10 מ"ל של מים deionized כדי לקבל 1 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי.
- תמיסת חיץ חומצה בורית: ממיסים 24.7 גרם (0.4 מטר) של חומצה בורית ב-900 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה. התאם את רמת החומציות של התמיסה ל-10.4 עם תמיסת נתרן הידרוקסיד של 50% (w/v). בהמשך לשלב זה, להוסיף מים deionized כדי להפוך אותו 1 L.
- מגיב O-pthaldialdehyde (OPA): להמיס 0.2 גרם של OPA ב 1 מ"ל של מתנול. הוסף 19 מ"ל של חיץ חומצה בורית 0.4 M (pH 10.4) לתמיסת OPA. הוסף 0.4 מ"ל של 2-מרקפטואתנול לתערובת חומצה OPA-בורית. מכסים את בקבוקון המגיב ברדיד אלומיניום, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C לשימוש עד 2-3 ימים לאחר ההכנה.
אזהרה: יש להימנע ממגע עם העור, העיניים והבגדים. הטיפול ב- OPA וב- 2 ריאגנטים מרקפטואתנול צריך להתבצע רק תחת מכסה מנוע מנדף עם אוורור פליטה מתאים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים. הימנעו מלנשום אדים, אבק או אירוסולים.
2. הכנת UHMWPE בתולי וטעון תרופות
- יש לנפות 2 גרם כל אחת של אבקות גנטמיצין סולפט וונקומיצין הידרוכלוריד עם מסננת (גודל נקבוביות של 75 מיקרומטר), ולייבש ב-45°C בתנור ואקום (0.1 אטמ<0.1 אטמ) למשך 18-24 שעות.
- ערבבו את התרופה המיובשת עם אבקת UHMWPE ב-7% w/w (1.12 גרם אנטיביוטיקה + 14.88 גרם UHMWPE) במיכל באמצעות מיקסר מכני למשך 5 דקות.
- מחממים תבנית אלומיניום ברונזה בהתאמה אישית (85 מ"מ x 50 מ"מ) עם לוחות הכנסת נירוסטה ל 180 ° C בתנור הסעה למשך שעה. מחממים את הצלחות של המכבש ל 170 מעלות צלזיוס.
- מוסיפים את האבקה המעורבבת לתבנית, ודוחסים ב- 10 MPa, 170 ° C למשך 10 דקות, ולאחר מכן מחזור קירור מים של 45 דקות ב- 10 MPa.
- הסר את בלוק UHMWPE היצוק (~ 3.5 מ"מ) מהמכבש באמצעות מכבש הידראולי.
- טחנו את המשטחים העליונים והתחתונים של הבלוק באמצעות בקרה מספרית ממוחשבת (CNC) כדי להסיר כל חריגה ומזהמים בפני השטח.
- חותכים את הבלוק לרצועות 3 מ"מ x 5 מ"מ x 20 מ"מ באמצעות CNC.
- הכינו UHMWPE בתולי (ללא תוספת אנטיביוטיקה) באותה מתודולוגיה שתוארה כבקרה למחקר.
איור משלים 1: חלקי התבנית המשמשים ליציקת דגימות UHMWPE. (א) לוח הכנסת נירוסטה; (ב) חלל עובש; (ג) בוכנה; (D) לוחית אחורית לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
3. קביעת קינטיקה אלוטיונית של UHMWPE פולט סמים
- מניחים פס 3 מ"מ x 5 מ"מ x 20 מ"מ במזרק 3 מ"ל עם מנעול Luer ומחט 25 G.
- שטפו את הרצועה על ידי מילוי המזרק במים נטולי יונים, והיפוך המזרק מספר פעמים.
- ממלאים את המזרק במים נטולי יונים, עד לסיום הלימודים של 2 מ"ל.
- מניחים את מערך המזרק על שייקר ב-100 סל"ד בטמפרטורת החדר.
- בכל נקודת זמן (6 שעות, יום אחד, יומיים, 3 ימים, שבוע אחד), לאסוף את eluent בבקבוקון 2 מ"ל.
- בכל נקודת זמן, לשטוף את הרצועה על ידי מילוי המזרק עם מים deionized והיפוך המזרק. השליכו את התמיסה, ומלאו את המזרק במים דה-מיוננים עד לסיום 2 מ"ל כדי להמשיך את הניסוי עד לנקודת הזמן הבאה.
4. קביעת ריכוז vancomycin
- זיהוי ספקטרופוטומטרי של ריכוז ונקומיצין במים שעברו דה-יוניזציה באורך גל בליעה שיא של 280 ננומטר.
- הכן תקני טווח ריכוז ידועים על ידי הוספת 100 μL של 1 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי לצלחת UV 96-well ודילול סדרתי באמצעות 100 μL של מים deionized כדי לקבל שש רמות של ריכוזים ידועים (1 מ"ג / מ"ל עד 0.03125 מ"ג / מ"ל).
- מעבירים 100 μL של האלואנטים לצלחות 96 בארות UV-clear, וקובעים את הריכוז ב-280 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-צלחות.
- צור עקומת כיול על ידי התוויית ריכוזי התרופה הידועים כנגד ערכי הספיגה המתאימים. חשב את ריכוז התרופה הלא ידועה ב- eluent באמצעות המשוואה הליניארית הנוצרת על ידי עקומת הכיול.
- לקבוע את מסת התרופה על ידי הכפלת הריכוז עם נפח eluent (~ 1.7 מ"ל).
- חשב את שחרור התרופה המצטבר (מ"ג) בנקודת זמן על-ידי סיכום שחרור התרופה מכל נקודות הזמן הקודמות.
- לנרמל את שחרור התרופה לשטח הפנים של הרצועה (3.5 ס"מ 2) כדי לקבוע את שחרור התרופה המצטבר לסנטימטר בריבוע (ס"מ2) של השתל.
5. קביעת ריכוז הגנטמיצין בשיטת התיוג OPA 27
- הכן פתרונות תקן GS לביצוע בדיקת OPA.
- העבר 1 מ"ל מתמיסת 80 מיקרוגרם/מ"ל GS לצינור צנטריפוגה.
- הוסף 500 μL של PBS לחמישה צינורות צנטריפוגות נוספים.
- בצע דילול סדרתי עם צינורות אלה כדי לקבל ריכוזי GS של 80 מיקרוגרם / מ"ל, 40 מיקרוגרם / מ"ל, 20 מיקרוגרם / מ"ל, 10 מיקרוגרם / מ"ל, 5 מיקרוגרם / מ"ל ו 2.5 מיקרוגרם / מ"ל. אלה משמשים כפתרונות כיול לבדיקה.
- בלוח שקוף של 96 בארות, הוסף 80 μL של PBS לבאר A-1 ו- 80 μL של פתרונות הכיול לבארות A-2 עד A-7 בריכוז עולה. זה משמש כיול פנימי עבור הבדיקה.
- הוסף 80 μL מכל דגימה לבארות הריקות במשולש כדי לנתח באותה צלחת של 96 בארות. הגבילו את מספר הדגימות לצלחת באר ל-<50 כך שעיתוי הוספת תמיסת OPA לדגימות יהיה זהה בקירוב עבור כל הדגימות וכדי למנוע אידוי.
- הוסף מגיב OPA לכל התקנים והפתרונות לדוגמה.
- במכסה אדים, למלא מאגר מגיב 25 מ"ל עם מתנול.
- הוסף 8 מ"ל מתנול ו 1 מ"ל של פתרון OPA מוכן למאגר מגיב שני (סעיף 1.8). מערבבים היטב את התמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
- עם מיקרופיפטה רב-ערוצית של 100 μL, הוסף 48 μL מתנול מהמאגר הראשון לכל הבארות המכילות מדגם בלוח 96 הקידוחים.
- בהמשך לשלב זה, הוסף 72 מיקרוליטר של תמיסת OPA מדוללת מהמאגר השני לכל הבארות המכילות מדגם בלוח 96 הקידוחים. דוגרים על צלחת הבאר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות (עירור של 340 ננומטר, פליטה של 455 ננומטר) באמצעות קורא microplate מיד לאחר הדגירה של 10 דקות.
- התווה את עקומת הכיול באמצעות קריאות העוצמה עבור התמיסות עם ריכוזים ידועים של GS. הוסף קו ליניארי כדי לקבוע את ההתאמה הטובה ביותר וליצור את המשוואה המתאימה.
- חישוב ריכוז התרופה ב- eluent מעקומות הכיול הנוצרות על ידי התוויית ריכוזי התרופה הידועים כנגד ערכי הספיגה המתאימים.
- חשב את מסת התרופה על ידי הכפלת הריכוז עם נפח eluent (~ 1.7 מ"ל).
- קבע את שחרור התרופה המצטבר (מ"ג) בנקודת זמן על-ידי סיכום שחרור התרופה מכל נקודות הזמן הקודמות.
- לנרמל את שחרור התרופה לשטח הפנים של הרצועה (3.5 ס"מ 2) כדי לקבוע את שחרור התרופה המצטבר לסנטימטר בריבוע (ס"מ2) של השתל.
6. הכנת חיידקים
הערה: במחקר זה נעשה שימוש בזני S. aureus הבאים: זן מסוג 12600, זנים קליניים L1101 ו-L1163 (שהתקבלו מד"ר קרי לה-פלנט מאוניברסיטת רוד איילנד). פרופילי הרגישות של זנים אלה מוצגים בטבלה 1.
| זני חיידקים | Gentamicin MIC | Vancomycin MIC | |
| ATCC 12600 | ≤1 מיקרוגרם/מ"ל (רגיש) | ≤0.5 מיקרוגרם/מ"ל (רגיש) | |
| L1101 (זן קליני) | ≥16 מיקרוגרם/מ"ל (עמיד) | 8 מיקרוגרם/מ"ל (בינוני) | |
| L1163 (זן קליני) | ≤1 מיקרוגרם/מ"ל (רגיש) | 8 מיקרוגרם/מ"ל (בינוני) | |
טבלה 1: פרופילי רגישות לאנטיביוטיקה של זני בקרה וזני S. aureus קליניים.
זהירות: כל השלבים הכרוכים בטיפול בתרביות חיידקים ומתלים בוצעו בחלל מעבדה BSL-2 בתוך ארון בטיחות ביולוגית Class II, Type A2.
- הפשיר את מלאי החיידקים מ -80 ° C על לוחות TSA כדי להקל על הצמיחה של S. aureus. באופן סטטי לדגור את הצלחות לילה ב 35 °C (75 °F).
- העבירו שתיים עד שלוש מושבות מתרביות צלחת האגר שגדלו בלילה לתוך 1 מ"ל של TSB סטרילי, ודגרו סטטית למשך הלילה ב -35 מעלות צלזיוס.
- העבירו 100 מיקרוליטר חיידקים לצלחת שקופה בת 96 בארות כדי למדוד ספקטרופוטומטרית את העכירות על ידי קביעת הספיגה ב-600 ננומטר.
- דללו את החיידקים פי 10,000 באמצעות MHB סטרילי לפני שתקבעו את ספירת החיידקים הקיימים באמצעות בדיקת זוהר.
7. ביצוע בדיקת כדאיות מיקרוביאלית בזמן אמת
- בצע את הבדיקה מבוססת ההארה באמצעות לוחות לבנים אטומים בעלי 96 בארות.
- מערבבים 100 μL של תרחיפים חיידקיים מדוללים עם 100 μL של מגיב assay מוכן בסעיף 1.5.
- מניחים מכסה מכוסה ברדיד אלומיניום מעל צלחת 96 בארות מוכנה, ודגרים במשך 5 דקות עם 100 סל"ד רועד.
- מדוד את עוצמת האור באופן מיידי באמצעות קורא microplate באמצעות ההגדרות הבאות בתוכנת Gen5 3.11.
- לחץ על חדש כדי להגדיר פרוטוקול בחלון מנהל המשימות .
- בחר Costar 96 לבן אטום בתפריט הנפתח עבור סוג צלחת.
- לחץ על קריאה בתפריט בחר שלבים > פעולות .
- לחץ על Luminescence בחלון שיטת קריאה . שמור על האפשרויות ' נקודת קצה/סיבים קינטיים' ו'Luminescence ' שנבחרו תחת סוג קריאה וסוג אופטיקה, בהתאמה. לחץ על אישור.
- שמור את ההגדרות <ברירת המחדל> בחלון שלב הקריאה (רווח = 135; זמן שילוב = 1 שניות; גובה קריאה = 4.5 מ"מ). לחץ על אישור.
- חלון פריסת הלוח נראה מוכן להפעלה. סמן את התיבה השתמש במכסה בחלון צלחת הטעינה ולחץ על אישור.
- הכנס את לוח 96 הקידוחים למכונה כדי לקרוא את ערכי ההארה.
8. יצירת עקומת תקן לומינסנציה לעומת ספירה בת קיימא עבור כל זן חיידקי
הערה: תרבית ומנה את כל זני S. aureus בהתאם למתודולוגיה המתוארת בסעיף 6.
- הכינו תרחיפים חיידקיים בדילול סדרתי שישמשו כסטנדרט.
- מנה את תרחיף החיידקים שגדל בלילה על ידי מדידה ספקטרופוטומטרית של העכירות.
- צנטריפוגה ב 6,000 × גרם במשך 5 דקות כדי לגלול את החיידקים, ולהשהות מחדש את הגלולה MHB סטרילי כדי להתאים את הריכוז ל 1 x 109 CFU/mL.
- לדלל 100 μL של תרחיף מסודר באמצעות 900 μL של MHB, ולבצע דילול טורי פי 10 כדי להגיע 1 x 101 CFU/mL.
- בצע את בדיקת ההארה על תרחיפים חיידקיים מוכנים כמתואר בסעיף 7.
- השתמש ב- MHB סטרילי כפקד ריק עבור הניסוי, והפחת את ערך עוצמת האור הריקה מערכי עוצמת האור של דגימת הבדיקה.
- התווה את יומן הרישום (CFU) כנגד יומן הרישום (זוהר) כדי ליצור עקומה סטנדרטית. רשום את המשוואה ואת ערך R2 .
- קבע את CFU/mL המתאים לערכי ההארה באמצעות המשוואה הספציפית לזן לאורך כל המחקר.
9. מערך מחקר פעילות אנטיבקטריאלית תלוי זמן
איור 1: ייצוג סכמטי של מערך הניסוי. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
- תרביתו את החיידקים לילה ב 1 מ"ל של מרק TSB.
- דללו את תרחיף החיידקים שגדל בלילה ל-105 CFU/mL ב-MHB סטרילי (סעיף 6), וודאו את ספירת החיידקים המעשית באמצעות יחידות ההארה לפני תחילת הניסוי (סעיף 7).
- מניחים את רצועות UHMWPE הבתוליות ורצועות UHMWPE עמוסות בתרופות (3 מ"מ x 5 מ"מ x 10 מ"מ, מחצית מממד הרצועות שהוכנו למחקרי האלוציה בסעיף 2) בתוך מזרק 3 מ"ל.
- ציירו MHB המכיל 10 5 CFU/mL לתוך המזרק דרך המחט המחוברת עד לסימן1.5 מ"ל, שהוא שווה ערך ל-1.35 מ"ל MHB (איור 1: שלב 1).
- הניחו את התקנת המזרק על אינקובטור רועד (100 סל"ד) בטמפרטורה של 37°C עד לנקודות הזמן שצוינו של 6 שעות, יום 1, יום 2, יום 3, יום 4, יום 5, יום 6 ויום 7 (איור 1: שלב 2).
- בכל נקודת זמן שצוינה, הוציאו את מערך המזרק, ובצעו בדיקת כדאיות מיקרוביאלית בזמן אמת לפי סעיף 7 על 100 מיקרוליטר של תרחיף חיידקי (איור 1: שלב 3-4).
- קבע את ספירת החיידקים הקיימא עבור 6 שעות, יום 1, יום 2, יום 3 ויום 7 נקודות זמן. קבע את CFU/mL מיחידות עוצמת האור באמצעות העקומה הסטנדרטית המתאימה.
- ודא את היעדרם של חיידקים בני קיימא בדגימות שהראו ערכי לומינסנציה מתחת לגבול הזיהוי על ידי ביצוע שיטת הלוחות הכפולים על לוחות TSA ודגרה ב -35 מעלות צלזיוס בן לילה. בדוק את נוכחותן של מושבות למחרת.
- צנטריפוגו את תרחיף החיידקים הנותר ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות, ושאפו בעדינות את המצע המשומש. עבור צינורות שבהם הכדוריות אינן נצפות באופן חזותי עקב הפעילות האנטי-בקטריאלית של התרופות, השאירו 100 μL בצינור כדי להבטיח שהגלולה הבלתי נראית לא תופרע (איור 1: שלב 5).
- השהו מחדש את החיידקים הכדוריים ב-MHB טרי, ומשכו בחזרה את התרחיף החיידקי לאותו מערך מזרקים דרך המחט המחוברת (איור 1: שלב 6).
10. כימות חיידקים דבקים על משטח UHMWPE
- יש לאחזר משטחי UHMWPE בתוליים ומשטחי UHMWPE עמוסי תרופות ממערך המזרקים לאחר השלמת המחקר ביום 7.
- מעבירים את המשטחים לצינורות של 1.5 מ"ל, ושוטפים עם 1 מ"ל PBS סטרילי (שלוש פעמים).
- סוניק את פני השטח במשך 40 דקות ב 1 מ"ל של PBS סטרילי. לקבוע את כדאיות החיידקים הדבקים על ידי ביצוע בדיקת לומינסנציה על 100 μL של הדגימה הסוניקטיבית, כמתואר בסעיף 7.
Representative Results
בהתאם לפרוטוקול, UHMWPE עוצב עם גנטמיצין וונקומיצין ב-7% w/w ונמהל למים שעברו דה-יוניזציה. ריכוז התרופה בחומר נקבע על 6 שעות, יום אחד, יומיים, 3 ימים ושבוע. שחרור התרופה מוונקומיצין ו-UHMWPE עמוס בגנטמיצין הדגים שחרור פרץ לאחר 6 שעות ואחריו קצב שחרור יציב עם ריכוז שחרור גבוה מהריכוז המעכב המינימלי (MIC) עד 7 ימים (איור 2, טבלה 2).
לפני המחקר האנטיבקטריאלי, נוצרה עקומה סטנדרטית כדי להתאים את יחידות ההארה ל-CFU/mL של החיידקים עבור כל זן S. aureus (ATCC 12600, L1101 ו-L1163). ערכי היומן (עוצמת האור) המתאימים שורטטו כנגד היומן (CFU/mL) כדי ליצור עקומה סטנדרטית (איור 3). ערכי R2 שחושבו היו 0.997, 0.996 ו-0.994 עבור ATCC 12600, L1101 ו-L1163, בהתאמה, מה שמצביע על התאמה חזקה לטווח הריכוז. המשוואה הנגזרת שימשה לאחר מכן לחישוב הכדאיות החיידקית בכל הניסויים. ATCC 12600 ו- L1101 הדגימו גבול זיהוי בטווח של 1 x 102-1 x 103 CFU/mL. מצד שני, גבול הזיהוי של זן L1163 הוכח להיות 1 x 104 CFU/mL.
בדיקת הפעילות האנטיבקטריאלית תלוית הזמן בוצעה באמצעות 1 x 105 CFU/mL כחיסון ההתחלתי עבור 12600, L1163 ו- L1101, שנחשפו לחומרים פולטי תרופות של 7% w/w לתקופה של שבוע אחד. בכל נקודת זמן (6 שעות, יום אחד, יומיים, 3 ימים, שבוע אחד), התווך עבר רענון, ואוכלוסיית החיידקים הושעתה מחדש. חשיפת החיידק לשחרור הבא של תרופות מהחומר נמשכה עד לנקודת הזמן הבאה. UHMWPE עם 7% w/w vancomycin ו-UHMWPE עם 7% w/w gentamycin הדגימו הפחתה של >3log עבור ATCC 12600 רגיש החל מ-6 שעות, וחיסול מלא (ללא גידול מושבה) נצפה בתום 3 ימים (איור 4A). עבור הזן L1163 הרגיש לגנטמיצין ולזן הוונקומיצין-ביניים, שני החומרים פולטי התרופות גרמו להפחתה של >3log לאחר 6 שעות, וחיסול מוחלט (ללא גידול מושבה) נצפה ביום הראשון של הניסוי (איור 4B). עבור הזן L1101 העמיד לגנטמיצין ולוונקומיצין, אלוציית גנטמיצין מ-UHMWPE לא השפיעה על יכולת הקיום החיידקית של L1101 (איור 4C). החיידק התרבה, והאוכלוסייה התייצבה תוך 6 שעות בנוכחות UHMWPE בתולי ללא הדבקה אנטיביוטית. בנוכחות UHMWPE פולט גנטמיצין, האוכלוסייה הגיעה לרמת גידול דומה ביום השני. נהפוך הוא, ונקומיצין אלוציה מ-UHMWPE הפחיתה משמעותית את הכדאיות החיידקית (>3לוג) ב-6 שעות, ואובדן כדאיות מוחלט (ללא צמיחת מושבה) הודגם ביום הרביעי.
פני השטח של UHMWPE פולט גנטמיצין וונקומיצין לא הראו חיידקים דבקים בני קיימא כאשר נחשפו לזנים רגישים ועמידים בינונית לאחר היום השביעי או חיסול מוחלט, המוקדם מביניהם. כמה חיידקים בני קיימא (1 x 10,5 CFU/mL) היו נוכחים על UHMWPE פולט גנטמיצין שנחשפו L1101 עמיד לגנטמיצין. באופן דומה, בערך 1 x 10 5 CFU/mL של חיידקים דבקים קיימא נמצאו מ-PE בתולי הביקורת (איור 5).
איור 2: שחרור אנטיביוטי ממוצע תלוי זמן מ-7% עם רצועת UHMWPE עמוסה באנטיביוטיקה. שחרור האנטיביוטיקה הממוצע בין נקודות זמן מרצועת UHMWPE אחת של 7% w/w גנטמיצין ורצועת UHMWPE עמוסת ונקומיצין (3 מ"מ 3 x 5 מ"מ 3 x 10 מ"מ3 ~ 2 ס"מ2 שטח פנים). המיקרופון נגד זן הבקרה ATCC 12600 מוצג כקו מקווקו עבור גנטמיצין וקו מוצק עבור ונקומיצין. קווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע משישה עותקים משוכפלים (n = 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עקומה סטנדרטית של בדיקה זוהרת בזמן אמת עבור כל זני S. aureus. לוג (לומינסנציה) שורטט כנגד log (CFU/mL) כדי ליצור עקומות סטנדרטיות לשליטה, (A) ATCC 12600, וזנים קליניים, (B) L1101 ו-(C) L1163. המשוואות המתארות את קו ההתאמה הטובה ביותר ואת ערכי R2 המתאימים מסומנות בחלקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כדאיות החיידקים נקבעה באמצעות בדיקה זוהרת עבור 7% w/w gentamicin-eluting ו-7% w/w vancomycin-eluting UHMWPE. הפעילות האנטיבקטריאלית תלוית הזמן של גנטמיצין וונקומיצין המדוללים מ-UHMWPE כנגד זני ביקורת, (A) ATCC 12600, וזנים קליניים, (B) L1163 ו-(C) L1101, מוצגים. וירג'ין 1020 PE שימשה כבקרה לניסוי. הקו הצהוב בחלקות מציין את גבול הזיהוי של זן S. aureus המתאים. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: כדאיות החיידקים הדבקים נקבעה באמצעות בדיקת Glo זוהרת עבור 7% w/w gentamicin-eluting ו-7% w/w vancomycin-eluting UHMWPE כנגד כל זני S. aureus. תרשים העמודות מציין חיידקים דבקים (CFU) שהתאוששו לסנטימטר בריבוע (ס"מ 2) של 7% טעון גנטמיצין ו-7% UHMWPE טעון ונקומיצין בסוף תקופת המחקר עבור כל הזנים שנבדקו. העמודות מציגות נתונים כממוצע ± סטיית תקן (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| נקודות זמן | ונקומיצין | גנטמיצין |
| ריכוז שיא (מק"ג/מ"ל) | ריכוז שיא (מק"ג/מ"ל) | |
| 0 - 6 שעות | 336 ± 72 | 263 ± 24 |
| 6 שעות -1 יום | 57 ± 18 | 16 ± 2 |
| יום אחד - יומיים | 60 ± 18 | 7 ± 1 |
| יומיים - 3 ימים | 23 ± 6 | 5 ± 0.4 |
| 3 ימים - 7 ימים | 49 ± 20 | 15 ± 1 |
טבלה 2: ריכוז שיא של תרופות (מק"ג/מ"ל) בנקודות זמן שונות. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (n = 6).
איור משלים 2: דעיכת אות Luminescence במשך 10 דקות מהוספת מגיב בדיקה לדגימה. הבדל של ±5% באות מוצג כקו מקווקו אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
Discussion
משלוח מתמשך מקומי של אנטיביוטיקה הוא כלי הכרחי בניהול זיהומים מפרקים periprosthetic. אנטיביוטיקה סיסטמית היא האסטרטגיה העיקרית במיגור זיהום חיידקי, והאלוציה המקומית משמשת ככלי משלים למניעת צמיחה והתיישבות של כל החיידקים שנותרו לאחר הסרת השתל והטריית הרקמה. המטרה של האזור היעיל מתחת לעקומה (ריכוז לאורך תקופה) לאנטיביוטיקה עם מתן מקומי אינה מובנת היטב. את ההתחמקות של אנטיביוטיקה ממכשירים כאלה ניתן לכמת לאורך זמן במבחנה; עם זאת, כדי לקבוע את הערך התרגומי של פרופילי ריכוז אלה, יש צורך בשיטה חזקה במבחנה להערכת פעילות אנטיבקטריאלית. במאמר זה, שיטה אחת כזו בזמן אמת מתוארת כדי לקבוע את הפעילות האנטיבקטריאלית של UHMWPE פולט תרופות לשמש כמכשיר משלוח מתמשך בהחלפת מפרקים.
ניטור בזמן אמת של כדאיות חיידקים הוא פרמטר מכריע של עניין, ושיטות מיקרוביולוגיות קונבנציונליות חסרות את המסגרת כדי להתאים היבט ספציפי זה של המחקר. בדיקת הכדאיות המיקרוביאלית ששימשה במחקר זה פותחה לכימות של חיידקים בני קיימא על ידי מדידת הזוהר המתאים לאדנוזין טריפוספט (ATP). כדי לחקור באופן ישיר את הפעילות תלוית הזמן של האנטיביוטיקות הנמהלות מחומרי השתל, הודגרו איתם שלושה זנים שונים בעלי פרופילי רגישות אנטיביוטיים מובהקים. הרציונל לשימוש בזנים מעבדתיים וקליניים בעלי עמידות משתנה לגנטמיצין וונקומיצין היה להבין את טווח הפעילות של פורמולציית שתל נתונה. יתר על כן, הפעילות האנטיבקטריאלית והיעילות נגד אוכלוסיות מובחנות אלה תלויות בעיתוי מתן התרופה. השיטה מתמקדת בהיתכנות של טיפול מונע נגד זנים אלה בהתבסס על >70% מדלקות המפרקים הפריפרוסתטיות הנגרמות כתוצאה מזיהום הפצע בזמן הניתוח24.
כחיסון התחלתי לפיתוח שיטה זו, 1 x 105 CFU/mL שימש. ריכוזי זיהום שונים שימשו עבור מודלים של בעלי חיים, אם כי לא הרבה ידוע על עומס הזיהום הרלוונטי מבחינה קלינית עבור PJI. מודלים של זיהום בבעלי חיים עבור PJI נקבעו באופן שגרתי באמצעות 1 x 105 CFU, וטווח דומה נמצא בשימוש נרחב בשיטות סטנדרטיות (CLSI) כדי לקבוע פעילות אנטיבקטריאלית25,26,27. שימוש ב- 1 x 105 CFU/mL כריכוז זיהום ראשוני איפשר לנו להעריך הן את פרמטרי הגידול והן את פרמטרי החיסול בו זמנית.
באופן קונבנציונלי, ערכי MIC נקבעים עבור ריכוז אנטיביוטי קבוע עבור מספר מסוים של חיידקים, והם אינם מצליחים להדגים את קצב הפעולה האנטיבקטריאלית. בשל היבט זה, ערכי MIC אינם מספקים הבחנה כמותית לתיאור פרופיל הפעילות האנטי-מיקרוביאלית28. הנתונים מהשיטה הנוכחית מדגישים את היתרון של הערכת קינטיקה קטלנית תלוית זן של אנטיביוטיקה במקום להשתמש במיקרופון כדי לקבל החלטות מינון. באמצעות שיטה זו ניתן היה להבדיל הן את ההיקף והן את הקצב שבו חומרי השתל השפיעו על הזנים השונים. גנטמיצין שנפלט מרצועות חומר השתל היה יעיל בחיסול L1163 ביום אחד ובחיסול ATCC 12600 תוך 2-3 ימים, אך הוא לא היה יעיל במיגור L1101 (איור 4). בנוסף לחוסר הפעילות הצפוי של אלוציית גנטמיצין כנגד L1101 (MIC >32 מיקרוגרם/מ"ל) בשל העמידות הטבועה בגנטמיצין (איור 4C), נצפתה התמדה של תת-אוכלוסיות כאשר נחשפו לוונקומיצין, שעבורו L1101 מפגין עמידות בינונית. לעומת זאת, L1163 חוסל סופית בנוכחות UHMWPE פולט ונקומיצין למרות שהפגין עמידות בינונית דומה לוונקומיצין כמו L1101 (מיקרופון של 8 מיקרוגרם/מ"ל נצפה בשני הזנים).
התצפיות שקצב הפעילות של גנטמיצין כנגד 12600 ו-L1163, שהם רגישים לגנטמיצין עם ערכי MIC דומים (מיקרופון של 1μg/mL נצפה עבור שני הזנים), היה שונה, כמו גם שמידת הפעילות של ונקומיצין כנגד L1101 ו-L1163 עמידים בינונית הייתה שונה (איור 4A,B), תמך בהשערה כי שיטה זו בזמן אמת בנוכחות החומר הפולט יכולה להבדיל בין הבדלים אורכיים בפעילות.
בנוסף לערך התרגומי של התוצאות בפירוש מידת היעילות של ריכוז מדולל נתון נגד חיידקים אלה, ישנם מספר יתרונות מתודולוגיים ניסיוניים. (1) ריכוז החיידקים נקבע באופן מיידי בזמן נתון, בניגוד לשיטות המקובלות שבהן מודגרים על החיידקים במרק או על אגר במשך 18-24 שעות כדי לקבוע את הכדאיות. תקופת גדילה זו יכולה לספק זמן נוסף לחיידקים להתאושש מעקה אנטיביוטית, ולהציג מקור אפשרי נוסף לטעות/שונות. (2) המדיה מוחלפת ללא הרף תוך שמירה על החיידקים, אשר דומים יותר לתנאי in vivo מאשר לתנאים סטטיים. (3) בדיקה זו כוללת מטבעה את קינטיקה שחרור התרופה מהשתל, המאפשרת חיזוי ביצועים טוב יותר. (4) השיטה פותחה באמצעות חומרים מתכלים זמינים בדרך כלל ללא צורך במכונות ספציפיות או יקרות.
שיטות בדיקות חוץ גופיות חזקות להערכת יישומים למתן תרופות נחוצות לפני שממשיכים למחקרים בבעלי חיים in vivo ולניסויים קליניים. ניתן לשנות ולהתאים בדיקה זו כדי להתאים לגישות שונות ולפלטפורמות אספקת תרופות כגון חלקיקים, ג'לים, יריעות וחומרים פולטי תרופות אחרים כדי לקבוע את היעילות של חיסול חיידקים במערך מדומה במבחנה. ניתן לבצע שינויים במערך הדגימה על ידי שינוי לסביבה בינונית מתאימה במבחנה, אשר הוכחה כמשפיעה על פעילותן של מספר אנטיביוטיקות29,30.
השיטה גם מאפשרת קביעת חיידקים דבקים בת קיימא, וזה מבטיח, שכן שיטות קונבנציונליות לקביעת ריכוז מינימלי של ביעור ביופילם גוזלות זמן רב ומספקות תוצאות לא עקביות. עם זאת, השיטה תיבדק בקפדנות על ביופילמים כדי לפתח מתודולוגיה אמינה וחזקה כדי לקבוע את רגישותה. השיטה הזוהרת מבוססת ATP יכולה להיות רגישה מספיק כדי לזהות צורות קיימא של חיידקים בביופילמים, כולל מתמידים, אשר עשויים או לא יכולים להיות מזוהים על צלחת אגר כמו מושבות גלויות. יחד, לפלטפורמה רב-תכליתית זו יש פוטנציאל לשלב פרמטרים רלוונטיים לתיעוד תצפיות בזמן אמת על הפעילות האנטי-בקטריאלית והאנטי-ביופילמית של תרופות מעניינות.
יעילותה של שיטה זו נשלטת על ידי ההיבטים הבאים:
מאפייני אלוציה קבועים מראש וגודל מדגם
ניתן לזהות את פרופיל האלוציה של החומר פולט האנטיביוטיקה בניסוי נפרד לפני מדידת פעילות אנטיבקטריאלית זו, כך שניתן יהיה לקבוע את כמות החומר הדרושה לביצוע הניסוי באופן פעיל בזמן שנקבע.
קביעת מיכל ונפח
חשוב לתכנן מערך שבו נפח המדיה של הניסוי יכול להכיל את כל שטח הפנים של אותו חומר ולהבטיח נפח מספיק לשחרור ללא הפרעה של התרופה מהמשטח הטעון בתרופה. המערך בו נעשה שימוש התבסס על ניסויים קודמים, והבטיח תנאי "כיור מושלמים" לתרופות הידרופיליות אלה, כך שפיזורן לא ייפגע על ידי מגבלות מסיסות.
מאפייני מדיה צמיחה
יש לחקור את בחירת מדיית הגידול כדי להבטיח את היציבות ואת הביצועים האופטימליים של התרופה שנבחרה29. מרק מולר הינטון מותאם קטיון (CAMHB), הנמצא בשימוש נרחב בשיטת דילול המרק, שימש לקביעת המיקרופון של אנטיביוטיקה ידועה. התווך מאפשר פעילות מיטבית של התרופה ללא הפרעה של הצטברות מטבוליטים שניונית רעילה31. מגיב הבדיקה נבדק ודווח יציב בסוגים שונים של מדיה, כולל אלה עם רכיבי סרום23,28. למרות שערכי יחידות ההארה היחסיים עשויים להשתנות בין מדיות שונות, הוכח כי רכיבי המדיה אינם מפריעים לבדיקה32,33. נפח הניסוי הותאם עוד יותר ל -1.5 מ"ל, שהוא קרוב לנפח הנוזל הסינוביאלי הקיים בחלל מפרק ברך בוגר34.
יציבות טמפרטורה עבור הבדיקה
הטיפול וההוספה של מגיב זוהר לבדיקה יבוצעו באופן עקבי על פני ניסויים. שינויי טמפרטורה משנים את רגישות הבדיקה, ולכן חשוב לדגור על מגיב בטמפרטורת החדר במשך שעתיים לפני הוספתו לחיידק23.
זמן דגירה מגיב
ההארה מהמגיב דועכת עם הזמן. לאות הזוהר יש זמן מחצית חיים של יותר מ-30 דקות, אשר תלוי במידה רבה בתווך ובסוג החיידק ששימש בניסוי23. בנוסף, כל הבדל בזמן הדגירה (כלומר, הזמן בין הוספת הריאגנט לחיידקים לבין קריאת ההארה) יגרום לקריאות לא עקביות עבור אותו ריכוז חיידקים. הבדל של 5% נצפה באות הזוהר כאשר נלקח תוך דקה אחת לאחר זמן הדגירה של 5 דקות בהתאם להוראות היצרן (איור משלים 2). בהתחשב בנתונים אלה, קריאות ההארה נרשמו תוך דקה אחת לאורך המחקר כדי להבטיח שאובדן האות לא יעלה על 5%. יתר על כן, חשוב להגביל את מספר הדגימות לכל צלחת כדי להפחית את השגיאה שהוצגה עקב דעיכת לומינסנציה מהבאר הראשונה לבאר האחרונה.
שמירה על אוכלוסיית החיידקים לאורך כל המחקר
השיטה ניסתה למדל את פינוי התרופה ואת מחזור הנפח הסינוביאלי על ידי הפרדה מתמדת של המדיה המשומשת מאוכלוסיית החיידקים בכל נקודת זמן באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה של 10,000 x גרם למשך 10 דקות35. שלב קריטי זה מבטיח את שקיעת כל תאי החיידקים בני קיימא ושאינם בני קיימא. בהמשך לכך, החיידקים המשוקעים משוחזרים באופן אחיד ב-MHB טרי ומועברים למערך המזרקים, מה שמקל על הנשיאה המלאה של אוכלוסיית החיידקים הפגועה בחזרה למערך הניסוי. יכולת השחזור והאמינות של שיטה זו מסתמכות במידה רבה על סימולציה של חשיפה מתמשכת של אנטיביוטיקה לאוכלוסיית החיידקים שמקורה בחיסון הראשוני.
מגבלה מרכזית של שיטה זו היא שמדובר בבדיקה חצי-סטטית שאינה מדמה במדויק מחצית חיים של תרופות ותחלופה סינוביאלית רציפה. עם זאת, החלפה מתמשכת בינונית מפצה חלקית על מגבלה זו. הרגישות של בדיקת הכדאיות המיקרוביאלית הייתה תלוית זן, ונעה בין 1 x 102-1 x 104 CFU/mL, מה שמגביל את יכולת הגילוי. יתר על כן, יש לשרטט עקומה סטנדרטית עבור כל אורגניזם מכיוון שסוג הזן תורם לרגישות ולביצועים של מגיב זוהר. הן הדינמיקה של צמיחת החיידקים והן הפעילות של תרכובת התרופה המשומשת עשויות להיות מושפעות מהמרכיבים הבינוניים, אשר יש להמשיך ולחקור.
Disclosures
הכותב הבכיר (E.O.) מקבל תמלוגים שמקורם ברישוי קניין רוחני לחברות הבאות: Corin, Iconacy, Renovis, Arthrex, ConforMIS, Meril Healthcare, Exactech. אין ניגוד עניינים באף אחד מהמחקרים המוצגים כאן.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה חלקית על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות מס 'AR077023 (R01) ועל ידי המעבדה האורתופדית האריס. המחברים מודים לד"ר קרי לפלנט ולצוותה באוניברסיטת רוד איילנד על אספקת הזנים הקליניים L1101 ו-L1163.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates - polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
| ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
| BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
| BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
| BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
| Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
| Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
| Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
| Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
| Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
| Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
| Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
| Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
| Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
| press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
| ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
| Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
| UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
| Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
| WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |
References
- Hunter, D. J., March, L., Chew, M. Osteoarthritis in 2020 and beyond: A Lancet Commission. Lancet. 396 (10264), 1711-1712 (2020).
- Sloan, M., Premkumar, A., Sheth, N. P. Projected volume of primary total joint arthroplasty in the U.S., 2014 to 2030. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 100 (17), 1455-1460 (2018).
- Gao, J., Xing, D., Dong, S., Lin, J. The primary total knee arthroplasty: A global analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 190 (2020).
- UpToDate. Prosthetic joint infection: Treatment. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/prosthetic-joint-infection-treatment (2022).
- Dapunt, U., Radzuweit-Mihaljevic, S., Lehner, B., Haensch, G. M., Ewerbeck, V. Bacterial infection and implant loosening in hip and knee arthroplasty: Evaluation of 209 cases. Materials. 9 (11), 871 (2016).
- Kamath, A. F., et al. Quantifying the burden of revision total joint arthroplasty for periprosthetic infection. The Journal of Arthroplasty. 30 (9), 1492-1497 (2015).
- Tande, A. J., Patel, R.
- Davidson, D. J., Spratt, D., Liddle, A. D. Implant materials and prosthetic joint infection: The battle with the biofilm. EFORT Open Reviews. 4 (11), 633-639 (2019).
- de Vor, L., Rooijakkers, S. H. M., van Strijp, J. A. G. Staphylococci evade the innate immune response by disarming neutrophils and forming biofilms. FEBS Letters. 594 (16), 2556-2569 (2020).
- Dapunt, U., Giese, T., Stegmaier, S., Moghaddam, A., Hänsch, G. M. The osteoblast as an inflammatory cell: Production of cytokines in response to bacteria and components of bacterial biofilms. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 243 (2016).
- González, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
- Dapunt, U., Giese, T., Prior, B., Gaida, M. M., Hänsch, G. M. Infectious versus non-infectious loosening of implants: activation of T lymphocytes differentiates between the two entities. International Orthopaedics. 38 (6), 1291-1296 (2014).
- Tai, D. B. G., Patel, R., Abdel, M. P., Berbari, E. F., Tande, A. J. Microbiology of hip and knee periprosthetic joint infections: A database study. Clinical Microbiology and Infection. 28 (2), 255-259 (2022).
- Foster, T. J. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Current status and future prospects. FEMS Microbiology Reviews. 41 (3), 430-449 (2017).
- Kranjec, C., et al. Staphylococcal biofilms: challenges and novel therapeutic perspectives. Antibiotics. 10 (2), 131 (2021).
- Kahl, B. C., Becker, K., Löffler, B. Clinical significance and pathogenesis of staphylococcal small colony variants in persistent infections. Clinical Microbiology Reviews. 29 (2), 401-427 (2016).
- Li, C., Renz, N., Trampuz, A.
- Davis, J. S., et al. Predictors of treatment success after periprosthetic joint infection: 24-month follow up from a multicenter prospective observational cohort study of 653 patients. Open Forum Infectious Diseases. 9 (3), (2022).
- Suhardi, V. J., et al. A fully functional drug-eluting joint implant. Nature Biomedical Engineering. 1, 0080 (2017).
- Gil, D., Grindy, S., Muratoglu, O., Bedair, H., Oral, E. Antimicrobial effect of anesthetic-eluting ultra-high molecular weight polyethylene for post-arthroplasty antibacterial prophylaxis. Journal of Orthopaedic Research. 37 (4), 981-990 (2019).
- Robu, A., et al. Additives imparting antimicrobial properties to acrylic bone cements. Materials. 14 (22), 7031 (2021).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- BacTiter-Glo microbial cell viability assay instructions for use of products G8230, G8231, G8232 and G8233. <101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol. Promega Corporation. , Available from: https://www.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol/ (2022).
- Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: Current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
- López-Torres, I. I., Sanz-Ruíz, P., Navarro-García, F., León-Román, V. E., Vaquero-Martín, J. Experimental reproduction of periprosthetic joint infection: Developing a representative animal model. The Knee. 27 (3), 1106-1112 (2020).
- Carli, A. v, et al. Quantification of peri-implant bacterial load and in vivo biofilm formation in an innovative, clinically representative mouse model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 99 (6), 25 (2017).
- Humphries, R. M., et al. CLSI Methods Development and Standardization Working Group best practices for evaluation of antimicrobial susceptibility tests. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), 01934 (2018).
- Mueller, M., de la Peña, A., Derendorf, H. Issues in pharmacokinetics and pharmacodynamics of anti-infective agents: Kill curves versus MIC. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (2), 369-377 (2004).
- Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Medical Principles and Practice. 28 (1), 28-35 (2019).
- Steixner, S. J. M., et al. Influence of nutrient media compared to human synovial fluid on the antibiotic susceptibility and biofilm gene expression of coagulase-negative Staphylococci In vitro. Antibiotics. 10 (7), 790 (2021).
- Sigma Aldrich. Mueller Hinton Broth (M-H Broth). Sigma Aldrich. , 70192 (2018).
- Thiriard, A., Raze, D., Locht, C. Development and standardization of a high-throughput Bordetella pertussis growth-inhibition assay. Frontiers in Microbiology. 11, 777 (2020).
- Clow, F., O'Hanlon, C. J., Christodoulides, M., Radcliff, F. J. Feasibility of using a luminescence-based method to determine serum bactericidal activity against Neisseria gonorrhoeae. Vaccines. 7 (4), 191 (2019).
- Kraus, V. B., Stabler, T. v, Kong, S. Y., Varju, G., McDaniel, G. Measurement of synovial fluid volume using urea. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (10), 1217-1220 (2007).
- Gonçalves, F. D. A., de Carvalho, C. C. C. R. Phenotypic modifications in Staphylococcus aureus cells exposed to high concentrations of vancomycin and teicoplanin. Frontiers in Microbiology. 7, 13 (2016).
