Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utvärdera den antibakteriella effekten av en antibiotikaeluerande polymer för att simulera profylaktisk klinisk tillämpning genom att använda en kommersiellt tillgänglig ATP-baserad självlysande mikrobiell viabilitetsanalys i realtid. Denna metod möjliggör övervakning av den longitudinella aktiviteten hos läkemedelseluerande material och kan anpassas i stor utsträckning för att testa antimikrobiella läkemedelsleveransplattformar.
Abstract
Ultrahög molekylvikt polyeten (UHMWPE) används ofta i totala ledartroplastier som en bärande yta. Periprostetiska ledinfektioner, varav de flesta inträffar strax efter ledbyte, utgör nästan 25% av de totala knärevisionsoperationerna, och fullständig utrotning av bakteriell infektion utgör en stor utmaning. Ett lovande sätt att ta itu med detta problem är att säkerställa lokal hållbar leverans av antibiotikakoncentrationer som är tillräckliga för att hämma bakterierna för att stödja rutinmässig systemisk antibiotikaprofylax. Det finns ökad forskning om utvecklingen av effektiva lokala läkemedelsleveransanordningar. Även om etablerade antibakteriella testmetoder för läkemedel kan användas för att testa den antibakteriella effekten av läkemedelseluerande material, saknas de när det gäller att tillhandahålla realtids- och longitudinella antibakteriella effektdata som kan korreleras med elueringsprofilerna för antibiotika från dessa enheter. Här rapporterar vi en direkt och mångsidig metod för att bestämma den antibakteriella effekten av antibiotikaavgivande UHMWPE-implantat. Denna metod kan användas som en plattform för att undvika bakteriekultur vid varje tidpunkt i ett långt experiment och kan också anpassas till andra lokala läkemedelsleveransenheter.
Introduction
Artros är ett betydande degenerativt tillstånd som drabbar 500 miljoner vuxna världen över1. Guldstandarden vid behandling av artrit i slutstadiet är total ledplastik, som beräknas utföras på över 2 miljoner patienter årligen enbart i USA år 20302, med en global efterfrågan som också ökar enormt 3,4. Förfarandet innebär att ledade broskytor i lederna ersätts med bärande syntetiska material av metall/keramik och starkt tvärbunden polyeten med ultrahög molekylvikt (UHMWPE). Totala ledproteser förbättrar livskvaliteten avsevärt för patienter som lider av artrit5, men en signifikant komplikation som äventyrar implantatens prestanda och patienternas tillfredsställelse är periprostetisk ledinfektion (PJI), som står för 15% -25% av revisionsoperationerna6. Orsaken till infektion antas i de flesta fall vara den mikrobiella kontamineringen av implantatstället under operationen7. Den förorenande populationen expanderar sedan på implantatet och vävnadsytorna8. Värdens immunsystem utlöses som svar, men tillväxthastigheten och biofilmbildningen av de förorenande organismerna kan göra det möjligt för dem att undvika immuncellerna, vilket kan leda till en ökad cytokin- och kemokinstorm utan utrotning av bakterierna 9,10,11. Den resulterande djupa infektionen i benet äventyrar implantatets fixering och prestanda samt patientens hälsa12.
Staphylococcus aureus och koagulasnegativa stafylokocker är de dominerande orsakande organismerna till PJI13. Svårighetsgraden av stafylokockinfektioner är hög på grund av deras ökade resistens mot antibiotika, biofilmbildning och förmåga att kvarstå som små kolonivarianter14,15,16. Implantatassocierade infektioner uppstår på grund av vidhäftning av mikroorganismer på implantatets yta och upprättandet av en komplex biofilmmatris som gör det möjligt för bakterierna att undvika skadliga värdimmunfaktorer och effektiva koncentrationer av antibiotika14,15,16. Konventionella behandlingsmetoder inkluderar intravenösa och orala antibiotikakombinationer under en längre period17. En stor nackdel med detta tillvägagångssätt är läkemedlets låga biotillgänglighet på infektionsstället och svårigheten att uppnå tillräckliga koncentrationer av antibiotika för att utrota bakterierna konsekvent under behandlingsperioden, vilket ofta resulterar i dåliga resultat18. För att ta itu med dessa brister utformades ett fullt fungerande lokaliserat UHMWPE-implantat för att säkerställa en varaktig frisättning av effektiva koncentrationer av antibiotika i ledutrymmet19. Lokal eluering från läkemedelselueringsimplantatet används som ett kompletterande verktyg för att förhindra tillväxt och kolonisering av eventuella bakterier som återstår efter implantatavlägsnande och debridering av vävnaden. In vitro antibakteriell testning av denna antibiotikaeluerande UHMWPE kan utföras genom att materialet inkuberas direkt med bakterierna och kvantifieras med spridningsplattmetoden20,21. Alternativt kan alikvoter av elueringsmedel testas mot bakterier med metoder som agardiskdiffusionsmetoden, buljongutspädningsmetoder och tidsdödande testning22. Alla dessa metoder bygger på tillväxtobservation cirka 16-18 timmar efter insamling av alikvoterna med hjälp av koloniräkning och grumlighetsmätningar. Elueringen av antibiotika från sådana produkter kan kvantifieras longitudinellt med hjälp av dessa in vitro-metoder. För att bestämma translationsvärdet för dessa koncentrationsprofiler behövs dock en robust in vitro-metod i realtid för att bedöma antibakteriell aktivitet.
Den mikrobiella viabilitetsanalysen som användes i denna studie utvecklades för kvantifiering av livskraftiga bakterier genom att mäta luminiscensen motsvarande adenosintrifosfat (ATP) frisatt från en levande bakteriecell med användning av luciferin-luciferasbaserad detektionsteknik. ATP, som levande cellers energivaluta, fungerar som en direkt indikator på fysiologiskt livskraftiga celler. Reagenset utför celllys, vilket frigör ATP-molekyler från livskraftiga celler som sedan detekteras i form av luminiscens. Denna luminiscens har en direkt korrelation med andelen livskraftiga bakterieceller i provet23. Detta är en realtids, enkel, mångsidig, snabb, enda reagensbaserad analys som kan anpassas till en mängd olika analysdesigner och förhållanden med både grampositiva och gramnegativa mikroorganismer. Här rapporterar vi en metod för att bestämma den antibakteriella aktiviteten i realtid av antibiotikaeluerande UHMWPE inkuberad med laboratorie- och kliniska stammar av S. aureus med hjälp av en modifierad tidsdödande analys baserad på den mikrobiella viabilitetsanalysen (t.ex. BacTiter Glo). Medan metodiken beskrivs med ett specifikt implantatmaterial och en specifik ortopedisk applikation, kan metoden ge en plattform för att testa andra antibiotikaavgivande leveransenheter med kliniska tillämpningar.
Protocol
1. Beredning av reagenser
- Mueller-Hinton buljong (MHB) beredning: Lös 22 g katjonjusterad MHB i 1 liter avjoniserat vatten. Autoklavera mediet vid 121 °C och 15 lb tryck i 20 minuter, se till att flaskan är löst täckt. Förvara den beredda sterila buljongen vid 4 °C tills den används.
- Tryptisk sojaagar (TSA) beredning: Lös 20 g TSA-pulver i 500 ml avjoniserat vatten. Autoklavera agarblandningen vid 121 °C och 15 lb i 20 minuter. Överför det sterila mediet till ett 55 °C vattenbad för att sänka temperaturen på den smälta agaren. Häll den kylda beredda agaren på sterila petriskålar (~ 15 ml) och låt den stelna. Förvara de stelnade agarplattorna inverterade för att undvika kondens.
- Tryptisk sojabuljong (TSB) beredning: Lös 15 g TSB-pulver i 500 ml avjoniserat vatten. Autoklav buljongblandningen vid 121 °C och 15 lb i 20 min. Förvara den beredda sterila buljongen vid 4 °C tills den används.
- Fosfatbuffrad saltlösning (PBS): Autoklav köps kommersiellt 1x PBS vid 121 ° C och 15 lb i 20 minuter före steril användning.
- Reagensberedning för analys av mikrobiell viabilitet: Balansera analysens innehåll till rumstemperatur. Blanda 10 ml buffert med det frystorkade luminescerande reagenspulvret och förvara det beredda reagenset vid −20 °C som 1 ml alikvoter. Före varje tidpunkt, tina det ljuskänsliga reagenset och bringa det till rumstemperatur.
- Gentamicinsulfatlösning: Lös 80 mg gentamicinsulfat (GS) i 10 ml 1x PBS. Virvla läkemedelslösningen noggrant för att erhålla en 8 mg/ml GS-stamlösning.
- Vankomycinhydrokloridlösning: Lös 10 mg vankomycinhydrokloridpulver noggrant i 10 ml avjoniserat vatten så att en 1 mg/ml stamlösning erhålls.
- Borsyrabuffertlösning: Lös 24,7 g (0,4 M) borsyra i 900 ml avjoniserat vatten. Justera lösningens pH till 10,4 med en 50 % (vikt/volym) natriumhydroxidlösning. Efter detta steg, tillsätt avjoniserat vatten för att göra det till 1 L.
- O-ptaldialdehydreagens (OPA): Lös 0,2 g OPA i 1 ml metanol. Tillsätt 19 ml 0,4 M borsyrabuffert (pH 10,4) till OPA-lösningen. Tillsätt 0,4 ml 2-merkaptoetanol till OPA-borsyrablandningen. Täck injektionsflaskan med reagens i aluminiumfolie och förvara vid 4 °C för användning upp till 2-3 dagar efter beredning.
VARNING: Undvik kontakt med hud, ögon och kläder. Hantering av OPA- och 2 merkaptoetanolreagens bör endast utföras under dragskåp med lämplig frånluftsventilation med lämplig personlig skyddsutrustning. Undvik att andas in ångor, damm eller aerosoler.
2. Beredning av jungfrulig och läkemedelsladdad UHMWPE
- Sikta 2 g vardera av gentamicinsulfat och vankomycinhydrokloridpulver med en sil (75 μm porstorlek) och dehydrera vid 45 °C i vakuumugn (<0,1 atm) i 18-24 timmar.
- Blanda det uttorkade läkemedlet med UHMWPE-pulver vid 7% w/w (1,12 g antibiotikum + 14,88 g UHMWPE) i en behållare med en mekanisk mixer i 5 min.
- Förvärm en aluminiumbronsanpassad form (85 mm x 50 mm) med insatsplattor av rostfritt stål till 180 ° C i en konvektionsugn i 1 timme. Förvärm pressens plattor till 170 °C.
- Tillsätt det blandade pulvret i formen och komprimera vid 10 MPa, 170 ° C i 10 minuter, följt av en 45 min vattenkylningscykel vid 10 MPa.
- Ta bort det gjutna UHMWPE-blocket (~ 3,5 mm) från pressen med en hydraulisk press.
- Fräs blockets övre och nedre ytor med hjälp av en datoriserad numerisk styrning (CNC) för att avlägsna eventuella ojämnheter och föroreningar i ytan.
- Skär blocket i 3 mm x 5 mm x 20 mm remsor med CNC.
- Förbered jungfrulig UHMWPE (utan tillsats av antibiotika) med samma metod som beskrivs som en kontroll för studien.
Kompletterande figur 1: Delar av formen som används för gjutning av UHMWPE-proverna. (A) Insatsplatta av rostfritt stål; b) formhålighet, c) kolven, (D) bakplatta Klicka här för att ladda ner den här filen.
3. Bestämning av elueringskinetiken för läkemedelseluerande UHMWPE
- Placera en remsa på 3 mm x 5 mm x 20 mm i en 3 ml spruta med ett Luer-lås och en 25 G nål.
- Tvätta remsan genom att fylla sprutan med avjoniserat vatten och vända sprutan upp och ner flera gånger.
- Fyll sprutan med avjoniserat vatten upp till 2 ml gradering.
- Placera sprutuppsättningen på en shaker vid 100 rpm vid rumstemperatur.
- Vid varje tidpunkt (6 timmar, 1 dag, 2 dagar, 3 dagar, 1 vecka) samlas eluenten i en 2 ml injektionsflaska.
- Tvätta remsan vid varje tidpunkt genom att fylla sprutan med avjoniserat vatten och vända sprutan. Kassera lösningen och fyll sprutan med avjoniserat vatten upp till 2 ml gradering för att fortsätta experimentet till nästa tidpunkt.
4. Bestämning av vankomycinkoncentrationen
- Detektera vankomycinkoncentration spektrofotometriskt i avjoniserat vatten vid en maximal absorptionsvåglängd på 280 nm.
- Bered kända standarder för koncentrationsintervall genom att tillsätta 100 μl stamlösning på 1 mg/ml till UV 96-brunnsplattan och seriellt späda med 100 μL avjoniserat vatten för att erhålla sex nivåer av kända koncentrationer (1 mg/ml till 0,03125 mg/ml).
- Överför 100 μl av eluenterna till UV-klara 96-brunnsplattor och bestäm koncentrationen vid 280 nm med hjälp av en mikroplattläsare.
- Skapa en kalibreringskurva genom att plotta de kända läkemedelskoncentrationerna mot motsvarande absorbansvärden. Beräkna den okända läkemedelskoncentrationen i eluenten med hjälp av den linjära ekvationen som genereras av kalibreringskurvan.
- Bestäm läkemedelsmassan genom att multiplicera koncentrationen med elueringsvolymen (~ 1,7 ml).
- Beräkna den kumulativa läkemedelsfrisättningen (mg) vid en tidpunkt genom att summera läkemedelsfrisättningen från alla föregående tidpunkter.
- Normalisera läkemedelsfrisättningen till remsans yta (3,5 cm 2) för att bestämma den kumulativa läkemedelsfrisättningen per centimeter kvadrat (cm2) av implantatet.
5. Bestämning av gentamicinkoncentrationen med OPA-märkningsmetoden 27
- Förbered GS-standardlösningar för att utföra OPA-analysen.
- Överför 1 ml av 80 μg/ml GS-lösningen till ett centrifugrör.
- Tillsätt 500 μL PBS till ytterligare fem centrifugrör.
- Utför en serieutspädning med dessa rör för att erhålla GS-koncentrationer på 80 μg / ml, 40 μg / ml, 20 μg / ml, 10 μg / ml, 5 μg / ml och 2,5 μg / ml. Dessa fungerar som kalibreringslösningar för analysen.
- Tillsätt 80 μl PBS till brunn A-1 i en klar platta med 96 brunnar och 80 μl kalibreringslösningar till brunnarna A-2 till A-7 i stigande koncentration. Detta fungerar som en intern kalibrering för analysen.
- Tillsätt 80 μl av varje prov till de tomma brunnarna i tre exemplar för analys i samma 96-brunnsplatta. Begränsa antalet prover per brunnsplatta till <50 så att tidpunkten för tillsats av OPA-lösningen till proverna är ungefär densamma för alla prover och för att undvika avdunstning.
- Lägg till OPA-reagens till alla standarder och provlösningar.
- Fyll en 25 ml reagensbehållare med metanol i en dragskåp.
- Tillsätt 8 ml metanol och 1 ml beredd OPA-lösning till en andra reagensbehållare (punkt 1.8). Blanda lösningen noggrant genom pipettering upp och ner.
- Med en flerkanalig 100 μL mikropipett, tillsätt 48 μL metanol från den första reservoaren till alla provinnehållande brunnar i 96-brunnsplattan.
- Efter detta steg, tillsätt 72 μL utspädd OPA-lösning från den andra behållaren till alla provinnehållande brunnar i 96-brunnsplattan. Inkubera brunnsplattan i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Mät fluorescensintensiteten (excitation 340 nm, emission 455 nm) med hjälp av en mikroplattläsare omedelbart efter 10 minuters inkubation.
- Rita upp kalibreringskurvan med hjälp av intensitetsavläsningarna för lösningarna med kända koncentrationer av GS. Lägg till en linjär linje för att bestämma den bästa passformen och generera motsvarande ekvation.
- Beräkna läkemedelskoncentrationen i eluenten från kalibreringskurvorna som genereras genom att plotta de kända läkemedelskoncentrationerna mot motsvarande absorbansvärden.
- Beräkna läkemedelsmassan genom att multiplicera koncentrationen med elueringsvolymen (~ 1,7 ml).
- Bestäm den kumulativa läkemedelsfrisättningen (mg) vid en tidpunkt genom att summera läkemedelsfrisättningen från alla föregående tidpunkter.
- Normalisera läkemedelsfrisättningen till remsans yta (3,5 cm 2) för att bestämma den kumulativa läkemedelsfrisättningen per centimeter kvadrat (cm2) av implantatet.
6. Bakterieberedning
OBS: Följande S. aureus-stammar användes i denna studie: typstam 12600, kliniska stammar L1101 och L1163 (erhållna från Dr. Kerry LaPlante vid University of Rhode Island). Känslighetsprofilerna för dessa stammar presenteras i tabell 1.
| Bakteriella stammar | Gentamicin MIC | Vankomycin MIC | |
| ATCC 12600 | ≤1 μg/ml (känslig) | ≤0,5 μg/ml (känslig) | |
| L1101 (Klinisk stam) | ≥16 μg/ml (resistent) | 8 μg/ml (mellanliggande) | |
| L1163 (Klinisk stam) | ≤1 μg/ml (känslig) | 8 μg/ml (mellanliggande) | |
Tabell 1: Antibiotiska känslighetsprofiler för kontroll och kliniska S. aureus-stammar.
VARNING: Alla steg som involverar hantering av bakteriekulturer och suspensioner utfördes i ett BSL-2-laboratorieutrymme i ett klass II, typ A2 biosäkerhetsskåp.
- Tina bakterielagren från -80 ° C på TSA-plattor för att underlätta tillväxten av S. aureus. Inkubera plattorna statiskt över natten vid 35 °C.
- Överför två till tre kolonier från de över natten odlade agarplattkulturerna till 1 ml steril TSB och inkubera statiskt över natten vid 35 °C.
- Överför 100 μL bakterier till en klar platta med 96 brunnar för att spektrofotometriskt mäta grumligheten genom att bestämma absorbansen vid 600 nm.
- Späd bakterierna 10 000 gånger med steril MHB innan du bestämmer antalet livsdugliga bakterier med hjälp av den självlysande analysen.
7. Utföra analys av mikrobiell viabilitet i realtid
- Utför den luminiscensbaserade analysen med vita ogenomskinliga bottenplattor med 96 brunnar.
- Blanda 100 μl utspädda bakteriesuspensioner med 100 μl analysreagens som beretts i avsnitt 1.5.
- Lägg ett lock täckt med aluminiumfolie över den förberedda 96-brunnsplattan och inkubera i 5 minuter med 100 rpm skakning.
- Mät luminiscensen omedelbart med en mikroplattläsare med följande inställningar i programvaran Gen5 3.11.
- Klicka på Nytt om du vill konfigurera ett protokoll i fönstret Aktivitetshanteraren .
- Välj Costar 96 vit ogenomskinlig i rullgardinsmenyn för Platttyp.
- Klicka på Läs under menyn Välj steg > Åtgärder .
- Klicka på Luminiscens i fönstret Läs metod. Låt fiberalternativen Slutpunkt/kinetik och Luminiscens vara markerade under Lästyp respektive Optiktyp. Klicka på OK.
- Behåll inställningarna
i fönstret Läs steg (förstärkning = 135; integrationstid = 1 sek; läshöjd = 4,5 mm). Klicka på OK. - Skyltlayoutfönstret visas klart för körningen. Markera rutan Använd lock i lastskyltsfönstret och klicka på OK.
- Placera 96-brunnsplattan i maskinen för att läsa luminiscensvärdena.
8. Generera en standardkurva för luminiscens kontra livskraftig räkning för varje bakteriestam
OBS: Odla och räkna upp alla S. aureus-stammar enligt den metod som beskrivs i avsnitt 6.
- Förbered seriellt utspädda bakteriesuspensioner för att fungera som standarder.
- Räkna upp den över natten odlade bakteriesuspensionen genom spektrofotometrisk mätning av grumligheten.
- Centrifugera vid 6 000 × g i 5 minuter för att pellet bakterierna och suspendera pelleten i steril MHB för att justera koncentrationen till 1 x 109 CFU / ml.
- Späd 100 μL ren suspension med 900 μL MHB och utför en 10-faldig serieutspädning för att nå 1 x 101 CFU/ml.
- Utför luminiscenstestet på de beredda bakteriesuspensionerna enligt beskrivningen i avsnitt 7.
- Använd steril MHB som en blindkontroll för experimentet och subtrahera det tomma luminiscensvärdet från testprovets luminiscensvärden.
- Rita stocken (CFU) mot stocken (luminiscens) för att generera en standardkurva. Registrera ekvationen och R2-värdet .
- Bestäm CFU / ml som motsvarar luminiscensvärdena med hjälp av den töjningsspecifika ekvationen under hela studien.
9. Studieupplägg för tidsberoende antibakteriell aktivitet
Figur 1: En schematisk representation av experimentuppställningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Odla bakterierna över natten i 1 ml TSB-buljong.
- Späd den över natten odlade bakteriesuspensionen till 105 CFU/ml i sterilt MHB (avsnitt 6) och kontrollera antalet bakterier som är livsdugliga med hjälp av luminiscensenheterna innan försöket påbörjas (avsnitt 7).
- Placera de nya UHMWPE-remsorna och läkemedelsladdade UHMWPE-remsor (3 mm x 5 mm x 10 mm, halva dimensionen av remsorna som förberetts för elueringsstudierna i avsnitt 2) i en 3 ml spruta.
- Dra upp MHB innehållande 10 5 CFU/ml i sprutan genom den fastsatta nålen upp till1,5 ml-märket, vilket motsvarar 1,35 ml MHB (figur 1: steg 1).
- Placera sprutuppsättningen på en skakande inkubator (100 rpm) vid 37 °C tills de angivna tidpunkterna 6 timmar, Dag 1, Dag 2, Dag 3, Dag 4, Dag 5, Dag 6 och Dag 7 (Figur 1: Steg 2).
- Vid varje angiven tidpunkt ska sprutuppställningen tas ut och en analys av mikrobiell viabilitet i realtid utföras enligt avsnitt 7 på 100 μl bakteriesuspension (figur 1: steg 3–4).
- Bestäm antalet livskraftiga bakterier för 6 timmar, dag 1, dag 2, dag 3 och dag 7. Bestäm CFU/ml från luminiscensenheterna med motsvarande standardkurva.
- Kontrollera frånvaron av viabla bakterier i proverna som visade luminiscensvärden under detektionsgränsen genom att utföra spridningsplattmetoden på TSA-plattor och inkubera vid 35 °C över natten. Kontrollera om det finns kolonier nästa dag.
- Centrifugera den återstående bakteriesuspensionen vid 10 000 × g i 10 minuter och aspirera försiktigt det använda mediet. För rör där pellets inte observeras visuellt på grund av läkemedlets antibakteriella aktivitet, lämna 100 μL i röret för att säkerställa att den osynliga pelleten inte störs (Figur 1: Steg 5).
- Återsuspendera de pelleterade bakterierna i färskt MHB och dra tillbaka bakteriesuspensionen i samma sprutuppställning genom den bifogade nålen (figur 1: steg 6).
10. Kvantifiering av vidhäftande bakterier på UHMWPE-ytan
- Hämta nya UHMWPE- och läkemedelsladdade UHMWPE-ytor från sprutuppsättningen efter avslutad studie på dag 7.
- Överför ytorna till 1,5 ml rör och skölj med 1 ml steril PBS (tre gånger).
- Sonicate ytan för 40 min i 1 mL steril PBS. Bestäm vidhäftande bakteriers livskraft genom att utföra en luminiscensanalys på 100 μL av det sonikerade provet, som beskrivs i avsnitt 7.
Representative Results
Efter protokollet formades UHMWPE med gentamicin och vankomycin vid 7% w/w och eluerades till avjoniserat vatten. Läkemedelskoncentrationen i eluenten från materialet bestämdes vid 6 h, 1 dag, 2 dagar, 3 dagar och 1 vecka. Läkemedelsfrisättningen från vankomycin och gentamicinladdad UHMWPE visade en burstfrisättning vid 6 timmar följt av en stadig frisättningshastighet med en frisättningskoncentration större än den minsta hämmande koncentrationen (MIC) fram till 7 dagar (figur 2, tabell 2).
Före den antibakteriella studien genererades en standardkurva för att korrelera luminiscensenheterna till CFU / ml för bakterierna för varje S. aureus-stam (ATCC 12600, L1101 och L1163). Motsvarande loggvärden (luminiscens) ritades mot stocken (CFU/ml) för att generera en standardkurva (figur 3). De beräknadeR2-värdena var 0,997, 0,996 och 0,994 för ATCC 12600, L1101 respektive L1163, vilket indikerar en stark passform för koncentrationsområdet. Den härledda ekvationen användes därefter för att beräkna bakteriell livskraft över alla experiment. ATCC 12600 och L1101 visade en detektionsgräns inom ett intervall på 1 x 102-1 x 103 CFU/ml. Å andra sidan visade sig detektionsgränsen för L1163-stammen vara 1 x 104 CFU/ml.
Den tidsberoende antibakteriella aktivitetsanalysen utfördes med användning av 1 x 105 CFU / ml som startinokulat för 12600, L1163 och L1101, som exponerades för 7% w/w läkemedelseluerande material under en period av 1 vecka. Vid varje tidpunkt (6 timmar, 1 dag, 2 dagar, 3 dagar, 1 vecka) uppdaterades mediet och bakteriepopulationen suspenderades igen. Exponeringen av bakterierna för efterföljande frisättning av läkemedel från materialet fortsatte fram till nästa tidpunkt. UHMWPE med 7 % vankomycin och UHMWPE med gentamycin på 7 % w/w visade >3log reduktion för mottaglig ATCC 12600 med början vid 6 timmar, och fullständig utrotning (ingen kolonitillväxt) observerades efter 3 dagar (figur 4A). För gentamicin-mottaglig och vankomycin-intermediär stam L1163 orsakade båda läkemedelseluerande material >3log reduktion vid 6 timmar, och fullständig utrotning (ingen kolonitillväxt) observerades på dag 1 av experimentet (figur 4B). För den gentamicinresistenta och vankomycinintermediära stammen L1101 påverkade gentamicineluering från UHMWPE inte den bakteriella viabiliteten hos L1101 (figur 4C). Bakterierna förökade sig och populationen stabiliserades inom 6 timmar i närvaro av jungfrulig UHMWPE utan eluering av antibiotika. I närvaro av gentamicineluerande UHMWPE nådde populationen en liknande tillväxtnivå dag 2. Tvärtom minskade vankomycinelueringen från UHMWPE signifikant bakteriell viabilitet (>3log) vid 6 timmar, och fullständig livskraftsförlust (ingen kolonitillväxt) visades dag 4.
Ytorna på både gentamicineluerande och vankomycineluerande UHMWPE visade inga livskraftiga vidhäftande bakterier när de exponerades för känsliga och medelresistenta stammar efter dag 7 eller fullständig utrotning, beroende på vilket som kom först. Vissa livsdugliga bakterier (1 x 105 CFU/ml) fanns på gentamicineluerande UHMWPE exponerade för gentamicinresistent L1101. På liknande sätt återfanns cirka 1 x 10 5 CFU/ml viabla vidhäftande bakterier från kontrollfunktionen för jungfrulig PE (figur 5).
Figur 2: Tidsberoende genomsnittlig antibiotikafrisättning från 7% w/w antibiotikaladdad UHMWPE-remsa. Den genomsnittliga antibiotikafrisättningen mellan tidpunkter från en 7% w/w gentamicin och vankomycinladdad UHMWPE-remsa (3 mm, 3 x 5 mm, 3 x 10 mm,3 ~ 2 cm, 2 yta). MIC mot kontrollstammen ATCC 12600 visas som en prickad linje för gentamicin och en heldragen linje för vankomycin. Felstaplarna representerar standardavvikelsen för medelvärdet från sex replikat (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Standardkurva för självlysande analys i realtid för alla S. aureus-stammar. Log (luminiscens) plottades mot log (CFU/ml) för att generera standardkurvor för kontroll, (A) ATCC 12600, och kliniska stammar, (B) L1101 och (C) L1163. Ekvationerna som beskriver linjen med bäst passform och motsvarande R2-värden anges i diagrammen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bakteriell viabilitet bestämd med hjälp av ett självlysande test för 7 % gentamicineluerande UHMWPE och 7 % vankomycineluerande UHMWPE. Den tidsberoende antibakteriella aktiviteten hos gentamicin och vankomycin som eluerats från UHMWPE mot kontrollstammar, (A) ATCC 12600, och kliniska stammar, (B) L1163 och (C) L1101, visas. Virgin 1020 PE fungerade som en kontroll för experimentet. Den gula linjen i diagrammen anger detektionsgränsen för respektive S. aureus-stam. Data visas som medelvärde ± standardavvikelse (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Adherent bakterieviabilitet bestämd med hjälp av självlysande Glo-test för 7% w/w gentamicin-eluering och 7% w/w vankomycin-eluerande UHMWPE mot alla S. aureus-stammar. Stapeldiagrammet visar vidhäftande bakterier (CFU) som återvunnits per centimeter kvadrat (cm2) av 7% gentamicinladdad och 7% vankomycinladdad UHMWPE vid slutet av studieperioden för alla testade stammar. Staplarna visar data som medelvärde ± standardavvikelse (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Tidpunkter | Vancomycin | Gentamicin |
| Toppkoncentration (μg/ml) | Toppkoncentration (μg/ml) | |
| 0 - 6 timmar | 336 ± 72 | 263 ± 24 |
| 6 h -1 dag | 57 ± 18 | 16 ± 2 |
| 1 dag - 2 dagar | 60 ± 18 | 7 ± 1 |
| 2 dagar - 3 dagar | 23 ± 6 | 5 ± 0.4 |
| 3 dagar - 7 dagar | 49 ± 20 | 15 ± 1 |
Tabell 2: Maximal läkemedelskoncentration (μg/ml) vid olika tidpunkter. Data visas som medelvärde ± standardavvikelse (n = 6).
Kompletterande figur 2: Luminiscenssignalförfall under en period av 10 minuter från tillsatsen av analysreagens till provet. En ±5% skillnad i signalen visas som en prickad linje Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Den lokaliserade ihållande leveransen av antibiotika är ett nödvändigt verktyg vid hantering av periprostetiska ledinfektioner. Systemiska antibiotika är den primära strategin för att utrota bakteriell infektion, och den lokala elueringen används som ett kompletterande verktyg för att förhindra tillväxt och kolonisering av eventuella bakterier kvar efter implantatavlägsnande och debridering av vävnaden. Målet för den effektiva arean under kurvan (koncentration över en period) för antibiotika med lokal administrering är inte väl förstådd. Elueringen av antibiotika från sådana anordningar kan kvantifieras longitudinellt in vitro. För att bestämma translationsvärdet av dessa koncentrationsprofiler behövs dock en robust in vitro-metod för att bedöma antibakteriell aktivitet. I detta dokument beskrivs en sådan realtidsmetod för att bestämma den antibakteriella aktiviteten hos läkemedelseluerande UHMWPE som ska användas som en hållbar leveransanordning vid ledbyten.
Realtidsövervakning av bakteriell livskraft är en avgörande parameter av intresse, och konventionella mikrobiologiska metoder saknar ramverket för att tillgodose denna specifika aspekt av studien. Den mikrobiella viabilitetsanalysen som användes i denna studie utvecklades för kvantifiering av livskraftiga bakterier genom att mäta luminiscensen motsvarande adenosintrifosfat (ATP). För att direkt undersöka den tidsberoende aktiviteten hos antibiotika som elueras från implantatmaterialen inkuberades tre olika stammar med distinkta antibiotikakänslighetsprofiler med dem. Anledningen till att använda laboratorie- och kliniska stammar med varierande resistens mot gentamicin och vankomycin var att förstå aktivitetsområdet för en given implantatformulering. Vidare är den antibakteriella aktiviteten och effekten mot dessa distinkta populationer beroende av tidpunkten för administrering. Metoden fokuserar på genomförbarheten av profylax mot dessa stammar baserat på att >70% av periprostetiska ledinfektioner orsakas av kontaminering av såret vid operationstillfället24.
Som startinokulat för att utveckla denna metod användes 1 x 105 CFU/ml. Olika kontaminerande koncentrationer har använts för djurmodeller, även om inte mycket är känt om den kliniskt relevanta infektionsbelastningen för PJI. Djurinfektionsmodeller för PJI har rutinmässigt etablerats med användning av 1 x 105 CFU, och ett liknande intervall används ofta i standardiserade metoder (CLSI) för att bestämma antibakteriell aktivitet25,26,27. Genom att använda 1 x 105 CFU/ml som en initial kontaminerande koncentration kunde vi utvärdera både tillväxt- och utrotningsparametrarna samtidigt.
Konventionellt bestäms MIC-värden för en konstant antibiotikakoncentration för ett visst antal bakterier, och de misslyckas med att visa graden av antibakteriell verkan. På grund av denna aspekt ger MIC-värden inte någon kvantitativ differentiering för att beskriva den antimikrobiella aktivitetsprofilen28. Data från den nuvarande metoden betonar fördelen med att utvärdera antibiotikas stamberoende dödskinetik snarare än att använda MIC för att fatta doseringsbeslut. Med denna metod kunde man skilja både i vilken utsträckning och i vilken takt implantatmaterialen påverkade de olika stammarna. Gentamicin eluerat från implantatmaterialremsorna var effektivt för att utrota L1163 på 1 dag och utrota ATCC 12600 på 2-3 dagar, men det var ineffektivt för att utrota L1101 (figur 4). Förutom den förväntade avsaknaden av aktivitet av gentamicineluering mot L1101 (MIC >32 μg/ml) på grund av dess inneboende gentamicinresistens (figur 4C), observerades subpopulationernas persistens vid exponering för vankomycin, för vilket L1101 uppvisar intermediär resistens. Däremot utrotades L1163 definitivt i närvaro av vankomycineluerande UHMWPE trots att det uppvisade liknande intermediär resistens mot vankomycin som L1101 (en MIC på 8 μg/ml har observerats för båda stammarna).
Observationerna att aktivitetshastigheten för gentamicin mot 12600 och L1163, som är gentamicinkänsliga med liknande MIC-värden (en MIC på 1 μg/ml har observerats för båda stammarna), var olika, liksom att graden av aktivitet av vankomycin mot intermediärresistenta L1101 och L1163 var olika (figur 4A,B), stödde hypotesen att denna realtidsmetod i närvaro av det eluerande materialet skulle kunna särskilja longitudinella skillnader i aktiviteten.
Förutom resultatens translationella värde för att tolka hur effektiv en given eluerad koncentration kan vara mot dessa bakterier finns det flera experimentella metodologiska fördelar. (1) Bakteriekoncentrationen bestäms omedelbart vid en given tidpunkt, i motsats till konventionella metoder där bakterierna inkuberas i buljong eller på agar i 18-24 timmar för att bestämma livsdugligheten. Denna tillväxtperiod kan ge ytterligare tid för bakterierna att återhämta sig från antibiotikastress, vilket introducerar en ytterligare möjlig källa till fel / variabilitet. (2) Mediet byts kontinuerligt ut samtidigt som bakterierna behålls, vilket mer liknar in vivo-förhållanden än statiska förhållanden. (3) Denna analys inkluderar i sig läkemedelsfrisättningskinetiken från implantatet, vilket möjliggör bättre prestandaförutsägelse. (4) Metoden har utvecklats med användning av allmänt tillgängliga förbrukningsvaror utan behov av några särskilda eller dyra maskiner.
Robusta in vitro-testmetoder för att utvärdera läkemedelsleveransapplikationer är nödvändiga innan man går vidare till in vivo-djurstudier och kliniska prövningar. Denna analys kan modifieras och anpassas för att rymma olika tillvägagångssätt och läkemedelsleveransplattformar såsom partiklar, geler, filmer och andra läkemedelseluerande material för att bestämma effektiviteten av bakteriell utrotning i en simulerad in vitro-inställning. Modifieringar kan utföras för provuppsättningen genom att byta till en lämplig in vitro-mediummiljö, vilket har visat sig påverka aktiviteten hos flera antibiotika29,30.
Metoden underlättar också livskraftig vidhäftande bakteriebestämning, vilket är lovande, eftersom konventionella metoder för att bestämma minsta biofilmutrotningskoncentration är tidskrävande och ger inkonsekventa resultat. Metoden ska dock testas noggrant på biofilmer för att utveckla en tillförlitlig och robust metod för att bestämma dess känslighet. Den ATP-baserade självlysande metoden kan vara tillräckligt känslig för att detektera livskraftiga former av bakterier i biofilmer, inklusive persisterare, som kan detekteras eller inte kan detekteras på en agarplatta som synliga kolonier. Sammantaget har denna mångsidiga plattform potential att införliva relevanta parametrar för att registrera realtidsobservationer om antibakteriell och anti-biofilmaktivitet hos läkemedel av intresse.
Effekten av denna metod styrs av följande aspekter:
Förutbestämda elueringsegenskaper och provstorlek
Elueringsprofilen för det antibiotikaeluerande materialet kan identifieras i ett separat experiment före denna antibakteriella aktivitetsmätning så att mängden material som krävs för att aktivt genomföra experimentet inom en fastställd tid kan bestämmas.
Bestämning av behållare och volym
Det är viktigt att utforma en inställning där experimentets medievolym kan rymma hela ytan av samma material och för att säkerställa tillräcklig volym för fri frisättning av läkemedlet från den läkemedelsladdade ytan. Installationen som användes baserades på tidigare experiment, vilket säkerställde "perfekta sänka" förhållanden för dessa hydrofila läkemedel så att deras diffusion inte hindras av löslighetsbegränsningar.
Tillväxtmediets egenskaper
Valet av tillväxtmedier bör undersökas för att säkerställa stabiliteten och optimal prestanda hos det eller de valda läkemedlen29. Katjonjusterad Mueller Hinton buljong (CAMHB), som ofta används i buljongutspädningsmetoden, användes för att bestämma MIC för kända antibiotika. Mediet möjliggör optimal läkemedelsaktivitet utan interferens av toxisk sekundär metabolitackumulering31. Analysreagenset har testats och rapporterats stabilt i olika typer av medier, inklusive de med serumkomponenterna23,28. Även om de relativa luminiscensenhetsvärdena kan variera mellan olika medier har mediets komponenter visat sig inte störa analysen32,33. Den experimentella volymen optimerades ytterligare till 1,5 ml, vilket ligger nära synovialvätskevolymen som finns i ett vuxet knäledsutrymme34.
Temperaturstabilitet för analysen
Hanteringen och tillsatsen av det självlysande reagenset till testet ska utföras på ett konsekvent sätt i alla experiment. Temperaturförändringar förändrar analysens känslighet, så det är viktigt att inkubera reagenset vid rumstemperatur i 2 timmar innan det tillsätts till bakterierna23.
Inkubationstid för reagens
Luminiscensen från reagenset sönderfaller med tiden. Den självlysande signalen har en halveringstid på över 30 min, vilket till stor del beror på mediet och typen av bakterie som används i experimentet23. Dessutom kommer eventuella skillnader i inkubationstid (dvs. tiden mellan tillsats av reagenset till bakterierna och avläsning av luminiscensen) att resultera i inkonsekventa avläsningar för samma koncentration av bakterier. En skillnad på 5 % observerades i den självlysande signalen när den togs inom 1 min efter inkubationstiden på 5 minuter enligt tillverkarens anvisningar (kompletterande figur 2). Med hänsyn till dessa data registrerades luminiscensavläsningarna inom 1 min under hela studien för att säkerställa att signalförlusten inte var mer än 5%. Vidare är det viktigt att begränsa antalet prover per platta för att minska felet som införs på grund av luminiscensförfall från den första brunnen till den sista brunnen.
Underhåll av bakteriepopulationen under hela studien
Metoden försökte modellera läkemedelsclearance och synovialvolymomsättning genom att kontinuerligt separera det använda mediet från bakteriepopulationen vid varje tidpunkt med höghastighetscentrifugering vid 10 000 x g i 10 min35. Detta kritiska steg säkerställer sedimentering av alla livskraftiga och icke-livskraftiga bakterieceller. Utöver detta rekonstitueras de sedimenterade bakterierna enhetligt i färsk MHB och överförs till sprutuppsättningen, vilket underlättar fullständig överföring av den drabbade mikrobiella populationen tillbaka till experimentuppställningen. Reproducerbarheten och tillförlitligheten hos denna metod är starkt beroende av att simulera den ihållande exponeringen av antibiotika för den mikrobiella populationen härledd från den ursprungliga ympningen.
En viktig begränsning med denna metod är att det är en semistatisk analys som inte exakt simulerar läkemedelshalveringstider och kontinuerlig synovialomsättning. Kontinuerlig mediumersättning kompenserar dock delvis för denna begränsning. Känsligheten hos analysen av mikrobiell viabilitet var töjningsberoende, från 1 x 102-1 x 104 CFU/ml, vilket begränsar detektionsförmågan. Dessutom måste en standardkurva ritas upp för varje organism eftersom töjningstypen bidrar till känsligheten och prestandan hos det självlysande reagenset. Både bakteriernas tillväxtdynamik och aktiviteten hos den använda läkemedelsföreningen kan påverkas av mediekomponenterna, vilket bör undersökas ytterligare.
Disclosures
Den äldre författaren (E.O.) erhåller royalties som härrör från licensiering av immateriella rättigheter till följande företag: Corin, Iconacy, Renovis, Arthrex, ConforMIS, Meril Healthcare, Exactech. Det finns ingen intressekonflikt med någon av de studier som presenteras här.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades delvis av National Institutes of Health Grant No. AR077023 (R01) och av Harris Orthopaedic Laboratory. Författarna tackar Dr. Kerry Laplante och hennes team vid University of Rhode Island för att tillhandahålla de kliniska stammarna L1101 och L1163.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates - polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
| ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
| BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
| BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
| BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
| Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
| Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
| Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
| Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
| Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
| Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
| Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
| Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
| Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
| press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
| ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
| Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
| UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
| Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
| WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |
References
- Hunter, D. J., March, L., Chew, M. Osteoarthritis in 2020 and beyond: A Lancet Commission. Lancet. 396 (10264), 1711-1712 (2020).
- Sloan, M., Premkumar, A., Sheth, N. P. Projected volume of primary total joint arthroplasty in the U.S., 2014 to 2030. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 100 (17), 1455-1460 (2018).
- Gao, J., Xing, D., Dong, S., Lin, J. The primary total knee arthroplasty: A global analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 190 (2020).
- UpToDate. Prosthetic joint infection: Treatment. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/prosthetic-joint-infection-treatment (2022).
- Dapunt, U., Radzuweit-Mihaljevic, S., Lehner, B., Haensch, G. M., Ewerbeck, V. Bacterial infection and implant loosening in hip and knee arthroplasty: Evaluation of 209 cases. Materials. 9 (11), 871 (2016).
- Kamath, A. F., et al. Quantifying the burden of revision total joint arthroplasty for periprosthetic infection. The Journal of Arthroplasty. 30 (9), 1492-1497 (2015).
- Tande, A. J., Patel, R.
- Davidson, D. J., Spratt, D., Liddle, A. D. Implant materials and prosthetic joint infection: The battle with the biofilm. EFORT Open Reviews. 4 (11), 633-639 (2019).
- de Vor, L., Rooijakkers, S. H. M., van Strijp, J. A. G. Staphylococci evade the innate immune response by disarming neutrophils and forming biofilms. FEBS Letters. 594 (16), 2556-2569 (2020).
- Dapunt, U., Giese, T., Stegmaier, S., Moghaddam, A., Hänsch, G. M. The osteoblast as an inflammatory cell: Production of cytokines in response to bacteria and components of bacterial biofilms. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 243 (2016).
- González, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
- Dapunt, U., Giese, T., Prior, B., Gaida, M. M., Hänsch, G. M. Infectious versus non-infectious loosening of implants: activation of T lymphocytes differentiates between the two entities. International Orthopaedics. 38 (6), 1291-1296 (2014).
- Tai, D. B. G., Patel, R., Abdel, M. P., Berbari, E. F., Tande, A. J. Microbiology of hip and knee periprosthetic joint infections: A database study. Clinical Microbiology and Infection. 28 (2), 255-259 (2022).
- Foster, T. J. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Current status and future prospects. FEMS Microbiology Reviews. 41 (3), 430-449 (2017).
- Kranjec, C., et al. Staphylococcal biofilms: challenges and novel therapeutic perspectives. Antibiotics. 10 (2), 131 (2021).
- Kahl, B. C., Becker, K., Löffler, B. Clinical significance and pathogenesis of staphylococcal small colony variants in persistent infections. Clinical Microbiology Reviews. 29 (2), 401-427 (2016).
- Li, C., Renz, N., Trampuz, A.
- Davis, J. S., et al. Predictors of treatment success after periprosthetic joint infection: 24-month follow up from a multicenter prospective observational cohort study of 653 patients. Open Forum Infectious Diseases. 9 (3), (2022).
- Suhardi, V. J., et al. A fully functional drug-eluting joint implant. Nature Biomedical Engineering. 1, 0080 (2017).
- Gil, D., Grindy, S., Muratoglu, O., Bedair, H., Oral, E. Antimicrobial effect of anesthetic-eluting ultra-high molecular weight polyethylene for post-arthroplasty antibacterial prophylaxis. Journal of Orthopaedic Research. 37 (4), 981-990 (2019).
- Robu, A., et al. Additives imparting antimicrobial properties to acrylic bone cements. Materials. 14 (22), 7031 (2021).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- BacTiter-Glo microbial cell viability assay instructions for use of products G8230, G8231, G8232 and G8233. <101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol. Promega Corporation. , Available from: https://www.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol/ (2022).
- Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: Current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
- López-Torres, I. I., Sanz-Ruíz, P., Navarro-García, F., León-Román, V. E., Vaquero-Martín, J. Experimental reproduction of periprosthetic joint infection: Developing a representative animal model. The Knee. 27 (3), 1106-1112 (2020).
- Carli, A. v, et al. Quantification of peri-implant bacterial load and in vivo biofilm formation in an innovative, clinically representative mouse model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 99 (6), 25 (2017).
- Humphries, R. M., et al. CLSI Methods Development and Standardization Working Group best practices for evaluation of antimicrobial susceptibility tests. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), 01934 (2018).
- Mueller, M., de la Peña, A., Derendorf, H. Issues in pharmacokinetics and pharmacodynamics of anti-infective agents: Kill curves versus MIC. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (2), 369-377 (2004).
- Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Medical Principles and Practice. 28 (1), 28-35 (2019).
- Steixner, S. J. M., et al. Influence of nutrient media compared to human synovial fluid on the antibiotic susceptibility and biofilm gene expression of coagulase-negative Staphylococci In vitro. Antibiotics. 10 (7), 790 (2021).
- Sigma Aldrich. Mueller Hinton Broth (M-H Broth). Sigma Aldrich. , 70192 (2018).
- Thiriard, A., Raze, D., Locht, C. Development and standardization of a high-throughput Bordetella pertussis growth-inhibition assay. Frontiers in Microbiology. 11, 777 (2020).
- Clow, F., O'Hanlon, C. J., Christodoulides, M., Radcliff, F. J. Feasibility of using a luminescence-based method to determine serum bactericidal activity against Neisseria gonorrhoeae. Vaccines. 7 (4), 191 (2019).
- Kraus, V. B., Stabler, T. v, Kong, S. Y., Varju, G., McDaniel, G. Measurement of synovial fluid volume using urea. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (10), 1217-1220 (2007).
- Gonçalves, F. D. A., de Carvalho, C. C. C. R. Phenotypic modifications in Staphylococcus aureus cells exposed to high concentrations of vancomycin and teicoplanin. Frontiers in Microbiology. 7, 13 (2016).
