Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bestemmelse av termiske grenser for dyreplankton ved bruk av varmeblokk

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64762
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology Department, Swarthmore College

Summary

Denne protokollen illustrerer bruken av kommersielt tilgjengelige komponenter for å generere en stabil og lineær termisk gradient. Slik gradient kan da brukes til å bestemme den øvre termiske grensen for planktoniske organismer, spesielt virvelløse larver.

Abstract

Termiske grenser og bredde har blitt mye brukt til å forutsi artsfordeling. Etter hvert som den globale temperaturen fortsetter å stige, er det viktig å forstå hvordan termisk grense endres med akklimatisering og hvordan den varierer mellom livsstadier og populasjoner for å bestemme artens sårbarhet for fremtidig oppvarming. De fleste marine organismer har komplekse livssykluser som inkluderer tidlige planktoniske stadier. Mens kvantifisering av den termiske grensen for disse små tidlige utviklingsstadiene (titalls til hundrevis av mikron) bidrar til å identifisere utviklingsflaskehalser, kan denne prosessen være utfordrende på grunn av den lille størrelsen på målorganismer, stort benkplassbehov og høye innledende fabrikasjonskostnader. Her presenteres et oppsett som er rettet mot små volumer (ml til titalls ml). Dette oppsettet kombinerer kommersielt tilgjengelige komponenter for å generere en stabil og lineær termisk gradient. Produksjonsspesifikasjoner for oppsettet, samt prosedyrer for å introdusere og oppregne levende versus døde individer og beregne dødelig temperatur, presenteres også.

Introduction

Termisk toleranse er nøkkelen til organismers overlevelse og funksjon 1,2. Etter hvert som planeten fortsetter å varme på grunn av menneskeskapte karbonutslipp, blir det lagt økende vekt på bestemmelse og anvendelse av termiskegrenser. Ulike endepunkter, som dødelighet, manglende utvikling og tap av mobilitet, har blitt brukt til å bestemme både øvre og nedre termiske grenser4. Disse termiske grensene betraktes ofte som en proxy for en organismes termiske nisje. Denne informasjonen brukes igjen til å identifisere arter som er mer sårbare for global oppvarming, samt forutsi fremtidig artsfordeling og de resulterende artsinteraksjonene 3,5,6,7. Imidlertid kan bestemmelse av termiske grenser, spesielt for små planktoniske organismer, være utfordrende.

For planktoniske organismer, spesielt larvestadiene til marine virvelløse dyr, kan den termiske grensen bestemmes ved kronisk eksponering. Kronisk eksponering oppnås ved å oppdrette larver ved flere temperaturer over dager til uker og bestemme temperaturen der larveoverlevelse og / eller utviklingshastighet reduserer 8,9,10. Denne tilnærmingen er imidlertid ganske tidkrevende og krever store inkubatorer og erfaring med larvehold (se referanse11 for en god innføring i dyrking av marine virvelløse larver).

Alternativt kan akutt eksponering for termisk stress brukes til å bestemme termiske grenser. Ofte innebærer denne bestemmelsesmetoden å plassere små hetteglass med larver i temperaturkontrollerte tørre bad 12,13,14, utnytte termiske gradientfunksjoner i PCR termiske syklister 15,16, eller sette glassflasker / mikrosentrifugerør langs en termisk gradient generert ved påført oppvarming og kjøling på endene av store aluminiumsblokker med hull der hetteglassene passer godt 17, 18,19. Typiske tørre bad genererer en enkelt temperatur; Derfor må flere enheter betjenes samtidig for å vurdere ytelsen over en rekke temperaturer. Termiske syklister genererer en gradient, men har bare plass til et lite prøvevolum (120 μL) og krever forsiktige manipulasjoner. I likhet med termiske syklister skaper store aluminiumsblokker lineære og stabile temperaturgradienter. Begge tilnærmingene kan kombineres med logistisk eller probit regresjon for å beregne den dødelige temperaturen for 50% prosent av befolkningen (LT50) 12,20,21. Aluminiumsblokkene som ble brukt var imidlertid ~ 100 cm lange; Denne størrelsen krever en stor laboratorieplass og tilgang til spesialiserte datamaskin numeriske kontroll fresemaskiner for å bore hullene. Sammen med å bruke to vannbad av forskningskvalitet for å opprettholde måltemperaturen, er de økonomiske kostnadene ved å montere oppsettet høye.

Derfor tar dette arbeidet sikte på å utvikle en alternativ måte å generere en stabil, lineær temperaturgradient med kommersielt tilgjengelige deler. Et slikt produkt må ha et lite fotavtrykk og skal lett kunne brukes til akutte termiske stresseksponeringseksperimenter for planktoniske organismer. Denne protokollen er utviklet med dyreplankton som er <1 mm i størrelse som målorganismer, og dermed ble den optimalisert for bruk av et 1,5 eller 2 ml mikrosentrifugerør. Større studieorganismer vil kreve beholdere større enn de 1,5 ml mikrosentrifugerørene som brukes og forstørrede hull i aluminiumblokkene.

I tillegg til å gjøre forsøksapparatet mer tilgjengelig, har dette arbeidet som mål å forenkle databehandlingspipelinen. Mens kommersiell statistisk programvare gir rutiner for å beregne LT50 ved hjelp av logistisk eller probit regresjon, er lisenskostnaden ikke triviell. Derfor vil et brukervennlig skript som er avhengig av det statistiske programmet R22 med åpen kildekode gjøre dataanalyse mer tilgjengelig.

Denne protokollen viser hvordan en kompakt varmeblokk kan fremstilles med kommersielt tilgjengelige deler og brukes til å utsette dyreplankton (larver av sanddollaren Dendraster excentricus) for akutt varmestress for å bestemme deres øvre termiske grense.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabrikasjon av varmeblokken

  1. Koble 120 V, 100 W stripevarmeren til reostat (se Materialtabell).
  2. Forbered aluminiumblokken på 20,3 cm x 15,2 x 5 cm (8 tommer x 5 tommer x 2 tommer) ved å bore 60 hull i et rutenett på 6 x 10 (se materialtabell). Sørg for at hullene er fordelt 2 cm fra senter til senter i begge retninger. Hver skal være 1,1 cm i diameter og 4,2 cm dyp (figur 1).
    MERK: Utfør boringen på en fresemaskin eller borepresse med høyhastighets stålborkroner. Både varmeelementet og kjøleelementet ble valgt for å dekke så mye av kontaktflaten på overflatene på 15,2 cm x 5 cm som mulig.
  3. Bor ytterligere to hull på en av overflatene på 20,3 cm x 5 cm mellom 1. og 2. kolonne og 9. og 10. kolonne, som samsvarer med størrelsen på temperaturregulatorprobene (se materialtabell).
  4. Konstruer et etui fra 1,2 cm (0,5 tommer) klare akrylplater (se materialtabell) for både å holde elementene på plass og isolere den ferdige varmeblokken. Bruk to lag akryl for å isolere baksiden av varmeelementet (figur 1).
  5. I sluttmonteringen bruker du termisk pasta (se materialtabell) for å maksimere varmeledningsevnen fra varmeelementet inn i blokken og fra blokken til kjøleelementet.

2. Bestemmelse av termiske gradientinnstillinger

  1. Koble vannbadet / akvariekjøleren med Tygon-slangen (se materialtabell). Isoler slangen med skumrørisolasjon etter behov.
  2. Sett termostatsonden inn i hullene på siden av aluminiumsblokken. Forsikre deg om at sonde 1 er plassert i nærheten av varmeelementet.
  3. Plasser mikrosentrifugerør fylt til randen (1,5 ml) med vann fra springen i alle fresede hull (totalt 60 rør).
  4. Slå på temperaturregulatoren og still inn stopptemperaturen på sonden 1 til 35-37 °C og sonden 2 til 21,5-22,5 °C.
    MERK: Den foreslåtte termostaten har to uttak som opererer uavhengig av hverandre; Bare sonde 1 brukes til å regulere varm temperatur i dette spesielle brukstilfellet. Sett derfor temperaturen på sonde 2 til temperaturen i den lave enden.
  5. Drei reostat for å slå på varmeelementet og sett det til medium.
  6. Slå på vannbadet/akvariekjøleren og sett kjøletemperaturen til 15 °C.
  7. Kontroller at blokken er varm i den ene enden og avkjølt i den andre etter 10 min.
    FORSIKTIG: De eksponerte endene av varmeelementet kan være varme; Ikke rør dem.
  8. Kontroller temperaturen inne i hvert mikrosentrifugerør ved hjelp av et termoelement med en K-type elektrode (se materialtabell) hvert 10. minutt etterpå. Temperaturen vil stabilisere seg etter ~ 60 min og virke lineær (figur 2).
  9. Juster verdiene til endepunktene ved å endre innstillingene til temperaturregulatoren og vannbadet etter behov.

3. Termisk eksponering og levende: død oppregning

MERK: Trinn 2 kan utelates når de ønskede innstillingene for temperaturgradienten er bestemt.

  1. Slå på resirkulerende vannbad og varmeapparat og sett dem til henholdsvis 15 °C og 37 °C for å generere en temperaturgradient fra 19,5 °C til 37 °C.
  2. For å sikre at den termiske gradienten er lineær, plasser mikrosentrifugerør fylt til randen (1,5 ml) med vann fra springen i alle fresede hull (totalt 60 rør).
  3. La varmeblokken nå den innstilte temperaturen ved å vente 45-60 min. Kontroller temperaturen inne i hvert mikrosentrifugerør ved hjelp av et termoelement med en K-type elektrode for å se om den har nådd forventet temperatur. Legg merke til disse temperaturene.
  4. Hvis studieorganismene er >500 μm store og lett kan overføres fra en beholder til en annen (f.eks. En hoppekreps), fyll et 1,5 ml mikrosentrifugerør med 750 μL 0,45 μm filtrert sjøvann. Alternativt, hvis studieorganismene er små, fyll et 1,5 ml mikrosentrifugerør med 250 μL 0,45 μm filtrert sjøvann.
    MERK: For de representative dataene ble larver av sanddollaren Dendraster excentrics , som er 2, 4 og 6 dager etter befruktning, brukt (se Materialtabell). Gjennomsnittlig (± S.D., n = 15 for hver alder) størrelsen på disse individene var henholdsvis 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm og 292 ± 14 μm. Gitt at disse larvene lett kan konsentreres (trinn 3.5), ble mikrosentrifugerørene fylt med 750 μL filtrert sjøvann.
  5. Konsentrer studieorganismenes kultur med omvendt filtrering (dvs. plasser masken i beholderen som holder studieorganismene og fjern vann gjennom toppen av nettet), slik at studieorganismene forblir i bunnen av begeret11.
    MERK: Et 30 μm nylonnett ble brukt til larvesanddollarene som ble studert (se materialtabell).
  6. Skyll den konsentrerte dyreprøven med filtrert sjøvann (f.eks. ved dyrking med algematvarer eller andre kjemikalier). Gjenta omvendt filtrering en gang til for å konsentrere dyreprøven.
  7. Plasser et kjent antall individuelle organismer i de halvfylte mikrosentrifugerørene. Tell de små planktoniske organismene under et dissekeringsmikroskop (se materialtabell) og overfør dem med glasspasteurpipetter.
    MERK: Antall organismer som skal plasseres er størrelsesavhengig; For larvesanddollar som var ~200 μm i størrelse, var 20 individer per mikrosentrifugerør passende.
    FORSIKTIG: Glasspipetter er mer ønskelige enn plastpipetter, da noen planktoniske organismer er hydrofobe og vil feste seg til plastoverflater.
  8. Tilsett 0,45 μm filtrert sjøvann til mikrosentrifugerørene som inneholder dyr til det endelige volumet er 1 ml.
  9. For å la organismene gradvis varme opp til ønsket eksperimentell temperatur, plasser mikrosentrifugerørene med dyr, fremstilt i trinn 3.7, inn i varmeblokken fra den kalde enden. Plasser par mikrosentrifugerør på hver rad (12 rør totalt).
  10. Vent 10 min.
  11. Flytt parene med mikrosentrifugerør satt inn i trinn 3.9 til de tilstøtende borede hullene med varmere temperaturer. Plasser flere par mikrosentrifugerør i hver rad i den kalde enden. Hver rad vil nå ha fire rør. Vent ytterligere 10 min.
  12. Fortsett å legge til mikrosentrifugerrør med dyr ved å skifte posisjoner fra den kaldere enden til den varmere enden i par. Vent 10 min mellom hvert skift til varmeblokken er helt fylt.
    MERK: Trinn 3.9-3.12 regnes som en opptrappingsfase for å øke temperaturen som oppleves av studieorganismene gradvis.
  13. La dyrene inkubere ved den angitte temperaturen i 2 timer. Dette trinnet er eksperimentets konstante temperatureksponeringsfase.
    1. Kontroller temperaturen på mikrosentrifugerørene med et termoelement hver time hvis inkubasjonsperioden overstiger 2 timer.
      MERK: Juster inkubasjonstiden basert på eksperimentelle behov. Hvis inkubasjonen er lengre enn 2 timer, må du kontrollere temperaturen på rørene med jevne mellomrom med et termoelement i tilfelle uforutsett utstyrssvikt. For å minimere forstyrrelser i studieorganismene, plasser tilfeldig seks eller flere mikrosentrifugerør fylt bare med filtrert sjøvann i blokken for temperaturovervåking.
  14. På slutten av inkubasjonsperioden måler du temperaturen inne i hvert mikrocentrifugerør ved hjelp av et termoelement med en K-type elektrode. Legg merke til disse temperaturene.
  15. Fjern alle 60 mikrosentrifugerør med dyr og legg dem i forhåndsmerkede holdere.
  16. Inkuber rørene (trinn 3.14) ved den forhåndsbestemte temperaturen, for eksempel oppdrettstemperaturen, i 1 time, som er gjenopprettingsperioden.
    MERK: Gjenopprettingsperioden kan være artsspesifikk. For larvesanddollaren var oppdrettstemperaturen 18 °C, og dermed ble prøven plassert i et miljøkammer. Rådfør deg med relevant litteratur og/eller gjennomfør et forsøkseksperiment for å sikre at antallet levende:døde ikke ble påvirket av lengden på restitusjonsperioden. I de representative dataene var antall dyr i live etter 1 time det samme som etter 12 eller 24 timers utvinning.
  17. For å oppregne andelen av studieorganismen som er i live etter termisk eksponering, overfør innholdet i et individuelt mikrosentrifugerrør til en 35 mm petriskål ved hjelp av en glasspipette.
  18. Observer og legg merke til det relative antallet individer som fortsatt er aktive (i live) og de som har beslaglagt svømming eller oppløst (død) under et dissekeringsmikroskop. Forsikre deg om at det totale antallet individer som er observert, tilsvarer antall individer som er plassert i rørene i trinn 3.7. Kontroller siden av mikrosentrifugerørene og petriskålen for enkeltpersoner hvis tallene ikke stemmer overens.

4. Beregning av LT50

  1. Generer en datatabell i CSV-format med minst følgende overskrifter: grupperingsvariabel av interesse, temperatur på røret i ° C, antall individer i live og antall individer døde.
    MERK: For de representative dataene er grupperingsvariabelen av interesse erstattet av alder siden målet er å sammenligne mellom aldersgrupper.
  2. For å tilpasse dataene med logistisk regresjon, bruk en generalisert lineær modell med en binomisk fordeling. Supplementary Coding File 1 viser et eksempelskript ved hjelp av åpen kildekode-programvaren R22.
  3. For å bestemme median øvre termisk grense (LT 50), beregne prediktorverdien (dvs. temperaturen) der50% av individene overlevde. Supplerende kodingsfil 2 viser et eksempelskript ved hjelp av funksjonen dose.p fra MASS23 i R22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med denne protokollen er å bestemme den øvre termiske grensen for dyreplankton. For å gjøre dette er det nødvendig med en stabil og lineær termisk gradient. Det foreslåtte oppsettet var i stand til å generere en termisk gradient fra 14 ° C til 40 ° C ved å sette vannbadtemperaturen til 8 ° C og varmeren til 39 ° C (figur 2A). Temperaturgradienten kan innsnevres og forskyves ved å endre endepunktverdiene. En termisk gradient med et smalere område (19 °C til 37 °C) ble også generert ved å sette ovnen til 37 °C og vannbadet til 15 °C. Temperaturen i blokken stabiliserer seg innen 45 minutter til 1 time etter oppsett (figur 2B).

For å illustrere anvendelsen av denne protokollen på dyreplankton, ble endringen i den øvre termiske grensen, angitt av LT50, gjennom ontogeni i larver av sanddollarene (Dendraster excentricus) undersøkt. Gravid sand dollar ble oppnådd kommersielt (se Tabell over materialer). Utgivelsen av gameter ble indusert ved injeksjon av 0,5-1 ml 0,35 M kaliumklorid. Eggene som ble samlet inn ble skyllet gjennom 63 μm nylonnett med 0,45 μm filtrert sjøvann. Sæden ble samlet tørr og holdt på is. Eggene ble befruktet med ~104 spermier per ml. Vanlige hagekulturer ble skapt med kjønnsceller fra tre hanner og tre hunner med fem individer per ml. Disse larvekulturene ble holdt i filtrert sjøvann med en saltholdighet på 32 psu ved 18 °C under en 12:12 lys:mørk syklus med fullstendig vannforandring annenhver dag.

Etter hvert som larvesanddollar utviklet seg, økte den øvre termiske grensen fra 28,6 °C (± 0,02 °CS.E) 2 dager etter befruktning til 28,8 °C (± 0,02 °C S.E) 4 dager etter befruktning og 29,3 °C (± 0,02 °C S.E) 6 dager etter befruktning (figur 3). Disse øvre termiske grensene antyder at sanddollar lever innenfor sin termiske grense under den gjennomsnittlige sommersjøoverflatetemperaturen på ~ 20 ° C eller lavere langs Stillehavskysten. Men med økende frekvens og intensitet av marine varmebølger, fortsetter maksimumstemperaturen å stige. En topptemperatur på 26,4 °C ble registrert i Sør-California Bight i august 2018 (Fumo et al.24). Gitt at denne arten reproduserer om våren og sommeren, vil overlevelsen av deres tidlige livsstadium sannsynligvis avta under disse ekstreme hendelsene. Den forventede overlevelsen vil reduseres med 10% når temperaturen når 26,5 ° C.

Parvise sammenligninger ved hjelp av ratio-testen utviklet av Wheeler et al.25 antyder at median dødelig temperatur var signifikant forskjellig mellom de tre aldersgruppene (p < 0,001). Tidligere stadier (gastrula og tidlige prismer som var 2 dager gamle) var mer følsomme for termisk stress enn eldre larver. Denne observasjonen antyder at den termiske grensen utledet fra et enkelt utviklingspunkt ikke er representativ for den arten gjennom hele sin livshistorie.

Figure 1
Figur 1: Merket diagram over varmeblokken. (A) Toppvisning av oppsettet med alle komponenter tilkoblet. (B,D) Plassering og tilkoblinger for varmeterminalene. (C,E) Plassering av varmeveksleren (kjøle elemenet) og tilhørende slanger til vannbadet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Temperaturendringer i varmeblokken over 1 time med endepunkter satt til 15 og 37 °C . (A) En lineær gradient ble oppnådd innen 1 time. Endring i endepunktinnstillingene varierer temperaturområdet, og det største området var fra 14 °C til 40 °C. (B) Temperaturforskjellen mellom replikasjonsrader var ubetydelig (<0,8 °C); data fra to replikasjonsrader ble tegnet inn for hver innstilling i (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Overlevelse av larvesanddollar (Dendraster excentricus) over et temperaturområde på 19 til 37 °C gjennom ontogeni (2, 4 og 6 dager etter befruktning [dpf]). Hvert datum representerer andelen larver som overlevde en 2 timers inkubasjon ved den spesifikke temperaturen etterfulgt av en 1 times gjenopprettingsperiode. Logistisk regresjon ble utført med generalisert lineær modell med binomisk fordeling i statistikkprogrammet R. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggskodingsfil 1: Et R-skript for å generere logistiske kurver for datasettet med et trinnvis eksempel. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggskodingsfil 2: Et R-skript for å generere LT50-estimater . Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen gir en tilgjengelig og tilpassbar tilnærming for å bestemme de termiske grensene for små planktonorganismer gjennom akutt termisk eksponering. 10-hulls design og fleksible temperaturendepunkter, styrt av vannbadet i den nedre enden og varmeren i den øvre enden, gjør det mulig å bestemme LT50 med presisjon. Ved hjelp av denne tilnærmingen kunne det påvises en forskjell i den termiske grensen som er <1 °C (figur 3). Denne tilnærmingen gir en rask bestemmelse av termiske grenser (i timer) for en rekke arter, og de resulterende verdiene har blitt brukt på flere artsfordelingsmodeller 2,21. Det er imidlertid viktig å merke seg at akutt eksponering sannsynligvis gir et annet termisk toleranseestimat sammenlignet med kronisk eksponering 8,26.

En stor fordel med dagens design er at 10 temperaturbehandlinger og seks replikasjoner er inkludert i et lite fotavtrykk (20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm). Tidligere publikasjoner som brukte en lignende termisk gradienttilnærming for å bestemme termiske grenser, brukte aluminiumsstenger som var større (180 cm x 10 cm x 6 cm i 27, 91 cm × 25 cm × 15 cm i 10 og 60 cm x20 cm i 17). Mens tørre bad som holder en enkelt temperatur er mindre (f.eks. 18,5 cm x 18,5 cm x 2,5 cm) og tilbyr flere replikasjoner, er det nødvendig med flere enheter (mer enn fire) for å generere en ytelseskurve som inkluderer flere temperaturer, eller eksperimentene må gjentas over tid som kan introdusere forstyrrende faktorer. Varmeblokkdesignet reduserer både fabrikasjonskostnadene og plassbehovet. Fabrikasjonen kan fullføres med en borepresse, eller forskere uten umiddelbar tilgang til en fresemaskin kan velge kommersielle CNC-maskineringstjenester. Bruken av kommersielt tilgjengelige deler kontrollerer ytterligere fabrikasjonskostnadene. Hvis man kan bruke et eksisterende oppvarming / kjølevannsbad eller akvariumkjølere, utgjør den gjenværende kostnaden for delene mindre enn $ 350. Ellers kan akvariekjølere for en 10 gallon (~ 35 L) akvarium kjøpes for < $ 150.

Den nåværende utformingen kan endres for å passe forskerens behov. Hvis målorganismene er større i størrelse, er scintillasjonsflasker gode alternative beholdere, og større hull vil være nødvendig. Når det er sagt, er aluminiumsblokken avtagbar i dagens design, slik at flere blokker kan lages og byttes ut for å passe til de eksperimentelle behovene. Hvis målet med forsøket er å bestemme en nedre termisk grense eller fokusere på polare organismer, er det mer hensiktsmessig å plassere kjølevannsblokker i begge ender av hovedaluminiumblokken.

I likhet med andre studier på dyreplankton, inneholder ikke dagens protokoll en gradvis nedkjølingsfase20,27. Forskere kan vurdere å fjerne mikrosentrifugerørene i par og skifte dem ned temperaturgradienten (dvs. reversere trinn 3,9-3,12) for å oppnå gradvis avkjøling hvis deres studieorganismer er følsomme for en plutselig temperaturreduksjon.

Nytten av dette oppsettet kan reduseres av flere faktorer, nemlig valget av (1) endepunktets temperaturinnstillinger, (2) eksponerings- og gjenopprettingsvarigheten, og 3) beregningen som brukes til å bestemme binomisk tilstand (levende vs. død; utviklet vs. ikke-utviklet). For å løse disse potensielle begrensningene, anbefales foreløpig testing.

Siden den logistiske regresjonen antar en binomisk fordeling, foretrekkes endepunkter med 100 % overlevelse og dødelighet. For marine organismer vil et rimelig startområde være den gjennomsnittlige årlige sjøoverflatetemperaturen på oppsamlingsstedet pluss 10-15 °C. Man kan da begrense temperaturområdet som undersøkes etter en slik innledende prøve, da jo mindre temperaturforskjellen mellom hullene er, jo mer finjustert LT50-estimatet .

Varigheten av eksponering og utvinning er artsspesifikk. For eksempel tillot Kuo et al.27 juvenile whelks (Nucella canaliculata) å komme seg i 24 timer, mens Hammond et al.28 tillot larvelilla kråkeboller (Stronglylocentrotus purprtaus) 1 time for utvinning. Man kan utføre et kort eksperiment for å avgjøre om live:dead-tellingen varierer mellom restitusjonsperioder. Avhengig av definisjonen av den valgte binomiske tilstanden (f.eks. levende vs. død), kan det hende at gjenopprettingstid ikke er nødvendig. Hvis målet med eksperimentet er å teste om utviklingsprosesser, som spaltning og gastrulering, forekommer over en rekke temperaturer. Med andre ord, den binomiske tilstanden som brukes i modellen vil bli utviklet mot ikke utviklet 8,19,21. Fikseringsmidler som 4% paraformaldehyd må tilsettes prøvene ved termisk eksponeringsperiode uten restitusjonstid.

For å sikre nøyaktig telling og bestemmelse av binomisk tilstand (levende vs. død, utviklet vs. ikke-utviklet), anbefales det å telle prøvene etter gjenopprettingstiden tilfeldig for å unngå potensielle observatørforstyrrelser . Hvis det er tilstrekkelig personell, kan forskjellige forskere telle replikasjonsrader og sammenligne resultatene. Alternativt kan enkeltpersoner gjentatte ganger telle en liten delmengde av prøvene og sjekke om tallene er konsistente.

En annen potensiell begrensning er mangelen på feilestimering av LT50 fra uavhengige utvalg29. Den nåværende dataanalysemetoden gir et 95 % konfidensintervall langs den tilpassede logistiske kurven (Supplementary Coding File 1) og en standardfeil på LT50 (Supplementary Coding File 2). Disse feilgrensene genereres fra kurvetilpasningsprosessen, ikke gjennom flere målinger av individer fra utvalgspopulasjonen. Gitt at den nåværende varmeblokkdesignen har seks rader, kan man passe data fra hver rad for å generere seks LT50-estimater og få de observasjonsbaserte feilestimatene.

Oppsummert presenteres en tilgjengelig tilnærming til å bestemme akutte termiske grenser som kan brukes på et bredt spekter av dyreplankton. Dette oppsettet kan brukes til å bestemme de termiske grensene for ulike organismer og for å finne utviklingsstadier som er sårbare. Denne informasjonen kan bidra til å forbedre prediksjonen av organismenes ytelse og potensielle samfunnsinteraksjoner i møte med globale klimaendringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt å erklære.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av fakultetets forskningsfond ved Swarthmore College [KC] og Robert Reynolds og Lucinda Lewis '70 Summer Research Fellowship for BJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm membrane filter VWR 74300-042
½” Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266 Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe VWR 76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger Omega Engineering HH506A Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette  Ranin 
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater
with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W		 McMaster-Carr 3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix Pentair CM2B Use to make aritifical seawater 
Denraster excentricus M-Rep  Sand dollars from California 
Dissecting microscope  Nikon  SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) Amazon Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"  McMaster-Carr 86825K953 Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation McMaster-Carr 4530K121 Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature 
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller Amazon Can be used in place of the lab-grade water bath 
Example with larval sand dollar 
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling Amazon Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) Amazon Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators VWR 89202-386 Can be replaced with an aquarium chiller 
Microcentrifuge Tubes VWR 76019-014 If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative 
Nitex mesh filter  Self made Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing 
Pasteur pipette VWR 14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)  Millpore-Sigma P3911-500G
R statistical software.  The R Project for Statistical Computing
Syringe needle VWR 89219-346 Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing  McMaster-Carr 5233K65 Adjust to match the chiller and block used 
Zoo Med Repti Temp Rheostat Chewy.com Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
  3. Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
  4. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  5. Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
  6. Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
  7. Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
  8. Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
  9. Wang, W., Ding, M. -w, Li, X. -x, Wang, J., Dong, Y. -w Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
  10. Mak, K. K. -Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
  11. Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , Humana Press. Totowa, NJ. 1-25 (2014).
  12. Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
  13. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
  14. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
  15. Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
  16. Rivera, H. E., Chen, C. -Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
  17. Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
  18. Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
  19. Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
  20. Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
  21. Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
  22. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2021).
  23. Venables, W. N., Ripley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , Springer. (2002).
  24. Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
  25. Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
  26. Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
  27. Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
  28. Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
  29. Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).

Tags

Biologi utgave 189 dødelig temperatur kritisk termisk maksimum øvre termiske grenser global oppvarming varmestress marine virvelløse larver
Bestemmelse av termiske grenser for dyreplankton ved bruk av varmeblokk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K.,… More

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K., Scoma, S. Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block. J. Vis. Exp. (189), e64762, doi:10.3791/64762 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter