Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול המפרט כיצד לבצע טיפול סונודינמי במודל גליובלסטומה עכבר in vivo באמצעות אולטרסאונד ממוקד מונחה תהודה מגנטית.
Abstract
טיפול סונודינמי (SDT) הוא יישום של אולטרסאונד ממוקד (FUS) המאפשר לסוכן סונוסנסיטיזציה לגידולים ראשוניים לרגישות מוגברת במהלך סוניקציה. למרבה הצער, הטיפולים הקליניים הנוכחיים לגליובלסטומה (GBM) לוקים בחסר, מה שמוביל לשיעורי הישרדות נמוכים לטווח ארוך בקרב חולים. SDT היא שיטה מבטיחה לטיפול בגליובלסטומה באופן יעיל, לא פולשני וספציפי לגידול. Sonosensitizers עדיף להיכנס תאים סרטניים לעומת parenchyma המוח שמסביב. היישום של FUS בנוכחות סוכן sonosensitizing מייצר מינים חמצון תגובתי וכתוצאה מכך אפופטוזיס. למרות שטיפול זה הוכח בעבר כיעיל במחקרים פרה-קליניים, חסרים פרמטרים סטנדרטיים מבוססים. שיטות סטנדרטיות נחוצות כדי לייעל אסטרטגיה טיפולית זו לשימוש פרה-קליני וקליני. במאמר זה, אנו מפרטים את הפרוטוקול לביצוע SDT במודל מכרסם GBM פרה-קליני באמצעות FUS מונחה תהודה מגנטית (MRgFUS). MRgFUS הוא תכונה חשובה של פרוטוקול זה, מכיוון שהוא מאפשר מיקוד ספציפי של גידול במוח ללא צורך בניתוחים פולשניים (למשל, קרניוטומיה). מכשיר הספסל המשמש כאן יכול להתמקד במיקום ספציפי בתלת מימד על ידי לחיצה על מטרה בתמונת MRI, מה שהופך את בחירת המטרה לתהליך פשוט. פרוטוקול זה יספק לחוקרים שיטה פרה-קלינית מתוקננת עבור MRgFUS SDT, עם גמישות נוספת לשנות ולמטב פרמטרים למחקר תרגומי.
Introduction
גליובלסטומה (GBM) הוא סוג של סרטן מוח אגרסיבי ביותר בעל שכיחות של 3.21 לכל 100,000 אנשים והוא הגידול הממאיר הנפוץ ביותר במוח1. סטנדרט הטיפול הנוכחי כולל כריתה כירורגית, הקרנות וכימותרפיה2. בשל אופיו החודרני והחודרני של הגידול, כריתה מלאה של הגידול היא נדירה. רקמה שיורית בשולי הגידול גורמת לשיעור גבוה של הישנות הגידול ולשיעור הישרדות נמוך של פחות מ-6% לאחר 5 שנים1.
בשל פרוגנוזה זו, חוקרים בוחנים אפשרויות טיפוליות חדשות כדי להילחם במחלה קטלנית זו. טיפול סונודינמי (SDT) הוא טיפול לא פולשני המשלב אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה (FUS) וחומרים sonosensitizing כדי לייצר אפקט ציטוטוקסי בתאים ממוקדים3. לדוגמה, sonosensitizers מבוססי פורפירין כגון חומצה 5-aminolevulinic (5-ALA) נלקחים באופן מועדף על ידי תאים סרטניים ולהגדיל את הייצור חמצון תגובתי (ROS) לרמות מזיקות כאשר נחשפים אולטרסאונד ממוקד. רמות יתר של ROS בתאים עלולות לפגוע במבנים תאיים ולעורר אפופטוזיס. מכיוון ש- 5-ALA נקלט באופן מועדף על ידי תאי הגידול, רקמה בריאה באזור הטיפול אינה נפגעת 3,4. מחקרים ראשוניים במבחנה גילו כי תאים סרטניים רבים עוברים ליזה על ידי טיפול SDT, אם כי שיעור המוות התאי תלוי בקו התא. מחקרים ראשוניים in vivo מניבים תוצאות דומות, המאשרות כי SDT יכול לגרום לאפופטוזיס5.
פרוטוקול זה נועד לתאר טכניקות ופרמטרים יעילים לטיפול SDT במודלים של מכרסמים עם תאי GBM מושתלים תוך גולגולתית באמצעות פלטפורמת מחקר FUS benchtop. חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבצע ולמטב SDT עבור מחקר FUS תרגומי.
Protocol
כל המחקרים בבעלי חיים אושרו ונערכו בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס (IACUC). נקבות עכברים עירומות אתימיות (גיל: 10 שבועות) התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים). כל תקנות הבטיחות הביולוגית רמה 2 (BSL-2) בוצעו, כולל שימוש במסכות, כפפות וחלוקים.
1. השתלות גידולים והדמיית ביולומינסנציה
- בשלב הראשוני של המחקר, יש לבצע השתלת גידול תוך גולגולתי, בעקבות דו"ח6 שפורסם בעבר.
הערה: במחקר זה, 100,000 תאי קסנוגרפט GBM אנושיים מסוג M59 ב-4 מיקרוליטר של תרחיף תאים שימשו להשתלה בעומק 3.0 מ"מ לתוך הגולגולת. - לפני הטיפול, כמת את גודל הגידול בכל עכבר באופן לא פולשני באמצעות מערכת הדמיה in vivo luminescence (ראה טבלת חומרים) בעקבות דו"חשפורסם בעבר 7.
הערה: זה נעשה במועד הטיפול, 7 ימים לאחר השתלת הגידול הראשונית. - באמצעות כימות הדמיה, חלקו את העכברים לתת-קבוצות דומות לטיפול.
הערה: במחקר זה נכללו שתי תת-קבוצות: (1) עכברים נושאי גידול לא מטופלים (n = 4) ו-(2) עכברים נושאי גידול שעברו SDT (n = 4). לא נצפה הבדל מובהק סטטיסטית בגודל הגידול לפני הטיפול בין שתי הקבוצות (p > 0.05).
2. מערך יום טיפול
- הוציאו הידרוכלוריד 5-ALA (ראו טבלת חומרים) מהמקפיא ושקלו 200 מ"ג/ק"ג משקל עכבר של 5-ALA (למשל, עבור עכבר של 25 גרם, שקלו 5 מ"ג). עשו זאת תחת תאורת סביבה בלבד.
הערה: יש לסטריל את כל הציוד לפני השימוש. - יש להמיס את הכמות הכוללת של 5-ALA במי מלח חוצצי פוספט (PBS), כך שכל בעל חיים יקבל תמיסה של 60 מ"ג/מ"ל של 5-ALA עם מינון המשקל הנכון (לדוגמה, עבור עכבר של 25 גרם, יש להמיס 5 מ"ג של 5-ALA לתוך 83.33 מיקרוליטר של PBS).
- עבור כל בעל חיים בקבוצת הניסוי SDT, הזריקו את הכמות המתאימה של תמיסה של 5-ALA לבעל החיים באופן תוך-צפקי (מחושב בשלבים 2.1 ו-2.2).
- השאירו את בעלי החיים בכלובים שלהם במשך 3 שעות כדי לעכל את 5-ALA.
3. הכנת דרישות לניסויים
- מלאו מאגר מים שעברו דה-יוניזציה (DI).
הערה: כמות המים הדרושה מבוססת על מספר העכברים ששימשו במחקר. - חבר את צינורות הזרימה פנימה והזרימה החוצה לדגאסר העל-קולי (ראה טבלת חומרים) וחבר את ה-degasser לחשמל (1 = מופעל, 0 = כבוי).
- מניחים את הקצה השני של הזרימה פנימה וזורמים החוצה צינורות לתוך מאגר המים DI.
- הפעל את degaser ולרוץ במשך 45 דקות.
- מלאו את המים שזה עתה ירדו מהגז לחלק העליון של מיכל אטום ואטום לשימוש במהלך המחקר.
- יוצקים ג'ל אולטרסאונד (ראו טבלת חומרים) לתוך צינור חרוט, ולאחר מכן מניחים בצנטריפוגה ומסתובבים ב 160 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר אוויר מהג'ל.
הערה: יש צורך בג'ל מספיק כדי ליצור בובה של ג'ל על ראשה של כל חיה.
4. הגדרת מערכת MRgFUS
- חברו את מערכת MRgFUS (ראו טבלת חומרים) באמצעות דיאגרמת החיווט כפי שניתן לראות באיור 1 (לוח תחתון).
- חבר את כל הרכיבים הדרושים (מחשב שולחני, צג, פלטפורמת MRgFUS, אוסצילוסקופ, מגבר) לחשמל.
- חבר את כל הכבלים למיקומים הנכונים.
- חבר את המתמר הרצוי לפלטפורמת MRgFUS באמצעות BNC וכבלים קואקסיאליים, ולאחר מכן חבר את תיבת התאמת העכבה המתאימה לחוטים הנכונים.
הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש במתמר 515 קילוהרץ.
- הפעל את כל המכשירים.
- במערכת ההפעלה של המחשב השולחני, פתח את יישום AUREUS, שכבר משולב בתוכנת מערכת FUS.
- בחר חבר את כל רכיבי החומרה כדי לחבר את החומרה למערכת ולוודא שהרכיבים מתקשרים עם התוכנה.
- בחר את המתמר המשמש על ידי בחירת התפריט הנפתח ובחירת המתמר הרצוי.
5. אתחול
- שחררו את הבורג התחתון מהפנטום ומלאו את החלל במים שעברו דה-יוניזציה ופליטת גזים עד שהוא עולה על גדותיו, ולאחר מכן החליפו שוב את הבורג.
- הכנס את הפנטום למיקום מיטת ה-MRI המתאים לו (ראה איור 2), ולאחר מכן מקם את מיטת ה-MRI בעריסה של ה-MRI בחריץ המתאים לה.
- מקם את עריסת ה-MRI במיקום המתאים בסורק ה-MRI (ראה טבלת חומרים). כוונן את העריסה כך שמיטת MRI הפנטום תוכל להחליק לתוך בור ה- MRI ללא כל הפרעה כדי לקבל תמונה באיכות גבוהה של הפנטום. סמן מיקום זה כך שיהיה ניתן לשכפל אותו בקלות בעתיד.
הערה: לאחר מציאת מיקום זה, המיקום לא ישתנה למשך שארית הטיפול. לכן, ודא כי זהו מיקום מתאים עבור מיקום MRI בעלי חיים, או הרישום כולו יהיה צורך לחזור על כל הרישום. - בצע סריקת MRI של הפנטום באמצעות ההגדרות בטבלה 1.
- הסר את העריסה מבור המגנט אך שמור אותה על הסורק. הסר את מיטת ה- MRI המכילה את הפנטום מהעריסה ולאחר מכן הנח את המיטה עם הפנטום על מערכת MRgFUS על ידי החלקת היתד בתחתית לחריץ הנכון שלה.
- חריץ את קצה הרישום על החריצים המגנטיים בזרוע המתמר כך שהוא יצביע כלפי מטה לכיוון הפנטום (ראה איור 2).
- בתוכנה, בחר בחר מיקום בית חדש ולאחר מכן בחר מצב ריצה מופעל כדי להתחיל בחיפוש ממוקד מונחה. לאחר החלפת מצב ריצה, השתמש במקשים שמאל, ימין, למעלה, למטה, עמוד למעלה ועמוד למטה כדי להזיז ידנית את זרוע המתמר בכיוון שמאל, ימין, קדימה, אחורה, למעלה ולמטה, בהתאמה.
- התאימו את המצביע ידנית בכל שלושת הממדים עד שקצה המצביע ייגע במרכז דוגמת הצלב שנמצאת בחלק העליון של הפנטום (ראו איור 2).
- הורד את תמונות MRI הפנטום למחשב ומקם אותן בתיקיה בספרייה שנבחרה, ולאחר מכן טען את תמונות ה- MRI לתוכנה על ידי בחירה באפשרות טען תמונות פנטום. פרוסות הפנטום הציריות יאכלסו את המסך בצד ימין. גלול בין פרוסות אלה באמצעות פס הגלילה של העכבר. התאם את הבהירות על-ידי לחיצה ממושכת על התמונה ולאחר מכן הזזת העכבר למעלה או למטה.
הערה: אם אחד מהקבצים בתיקייה אינו קובצי DICOM לא דחוסים, התוכנה לא תוכל לקרוא ולייבא אותם, לכן הסר קבצים אחרים מתיקיה זו. - גלול לכל תמונה של הפנטום שבה יש עיגול ברור עם שלושה חורים כהים בכל אחד. לחץ על אמצע הפאנטום, ועיגול אדום יופיע. לחצו וגררו על העיגול עד שהוא מגיע לאותו קוטר ומתיישר עם היקף הפנטום (ראו איור 2).
- הקואורדינטות של עמדה זו נקראות 'עמדת בית'; שמור זאת על-ידי לחיצה על הגדר L/R, A/P ו- S/I.
- לחץ על Jog Mode Off, הסר את תיאור הרישום מזרוע המתמר ולאחר מכן בחר Exit Focus Finding. אשר את מיקום הבית כדי להשלים את רצף האתחול.
6. הכנת בעלי חיים ל-SDT
- מרדימים את העכבר באמצעות תערובת גז isoflurane-O2 בתא אינדוקציה. הגדר את קצב זרימת הגז ל- 1.0 מ"ל לדקה ואת הוופורייזר ל- 2.0% להשראת הרדמה, בדרך כלל תוך 3-5 דקות בתא (ראה טבלת חומרים).
- להעריך את בעל החיים עבור הרגעה נאותה על ידי צביטת הבוהן. החל משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע יובש של הקרניות.
הערה: עקוב אחר עומק ההרדמה לאורך כל ההליך. - הזריקו לעכבר 40 מיקרוליטר של חומר ניגוד גדוליניום דרך וריד הזנב (ראו טבלת חומרים).
- הסירו כל שיער שחוסם את הקרקפת מעל הגולגולת באמצעות קרם להסרת שיער ומכונת גילוח אלקטרונית.
- הצמידו את החיה למיטת ה-MRI באמצעות השלבים הבאים (ראו איור 3).
- חברו את צינור הכניסה של מיטת ה-MRI (איור 3A) למקור איזופלורן להרדמה, והגדירו את קצב זרימת הגז ל-1.0 מ"ל/דקה ואת הוופורייזר ל-2.0% להשראת הרדמה. חבר את צינור היציאה למכל מסנן פחם לספיגת הרדמה.
- הכניסו את חתיכת חרוט האף לחריץ שלו, כפי שמוצג באיור 3B. החליקו את מוט הנשיכה דרך חורי מוט הנשיכה הן בקונוס האף והן בקצה המיטה, כפי שמוצג, כאשר קצה מגן הנשיכה מרחף מעל הבאר הפתוחה במיטת MRI.
- הניחו את בעל החיים על מיטת ה-MRI כשאוזניו מסודרות עם חורי מוטות האוזן הסטריאוטקטיים והצמידו את שיניו דרך מגן הנשיכה כדי לשמור אותו במקומו. החלק את חרוט האף קדימה כך שיהיה מעל חוטמו של בעל החיים כדי לספק זרם יציב של הרדמה.
- החליקו את מוטות האוזניים דרך החורים משני צידי מיטת ה-MRI והרימו את ראשו של בעל החיים עד ששני מוטות האוזניים יוכלו להיכנס לתעלות האוזן של העכבר.
הערה: אל תדחפו רחוק מדי, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בעור התוף של החיה. - ודא כי החיה נמצאת במצב נוח. לאחר מכן, באמצעות מברג שטוח, הבריגו את הברגים תואמי MRI כדי לנעול את שני מוטות האוזניים, את חרוט האף ואת מוט הנשיכה. פעולה זו תנעל את בעל החיים במקומו ותמנע כל תזוזת ראש עד להוצאת בעל החיים מהמיטה.
הערה: יש לוודא כי אין הפרעה למיקום בעל החיים על מיטת ה-MRI לאחר שלב זה. אם החיה זזה, יהיה צורך לחזור על כל ההתקנה (שלב 6.5), ללא קשר למרחק לאורך הפרוטוקול. - בזמן שהחיה ממתינה, הניחו את מיטת ה-MRI על כרית חום חמה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
הערה: נטר ושמור על טמפרטורת הגוף לאורך כל ההליך.
- איזופלורן מסופק באופן רציף לבעל החיים באמצעות צינורות המחוברים לקונוסים באף לאורך כל הטיפול כאשר מיטת בעלי החיים קבועה במערכת FUS, באמצעות גופי התאורה המסופקים על הרציף.
7. הליכי MRI
- קחו את מיטת ה-MRI כאשר בעל החיים קבוע באופן סטריאוטקטי והניחו אותה בעריסה של ה-MRI שהייתה מחוברת קודם לכן לסורק ה-MRI (ראו טבלת חומרים), על-ידי חריץ חור מיטת ה-MRI בקצה שלה ליתד שעל עריסת ה-MRI, כפי שמוצג באיור 3. חבר את צינורות ההרדמה של הכניסה והיציאה לצינורות המתאימים במכשיר ה- MRI.
- החליקו את עריסת ה-MRI המכילה את בעל החיים לתוך משעמם ה-MRI, והקפידו לשמור על אותו מיקום כמו המקום שבו הונח הפנטום.
- בצע לוקלייזר כדי לראות את המיקום של מוח החיה ולאחר מכן סריקת MRI משוקללת T1 לאחר ניגודיות המכסה את המוח כולו באמצעות הגדרות MRI מטבלה 2.
- יצא את סריקת MRI כערכה של קובצי DICOM לא דחוסים, אחד לכל פרוסה.
8. טיפול אולטרסאונד ממוקד (איור 4)
- הסר את בעל החיים מעריסת ה- MRI לאחר השלמת הסריקה והנח אותו על הפלטפורמה על ידי חריץ החלק הקדמי של המיטה ליתד המתאימה בחלק האחורי של הרציף, וחריץ גב המיטה ליתד המתאימה לו.
- חבר את צינור הכניסה של מיטת ה- MRI למקור איזופלורן להרדמה והגדר את קצב זרימת הגז ל- 1.0 מ"ל לדקה ואת הוופורייזר ל- 2.0% לתחזוקת ההרדמה. חבר את צינור היציאה למכל מסנן פחם לספיגת הרדמה.
- העבר את קבוצת קובצי DICOM למחשב ומקם אותם בתיקייה בספריית העבודה הראשית של המחקר הנוכחי.
הערה: עיין בשלב 5.9 לקבלת דרישות קובץ. - בתוכנה, עבור לדף האתחול הראשי והפעל את מצב ריצה על ידי לחיצה על מציאת מיקוד מודרך ולאחר מכן לחץ על מצב ריצה מופעל.
- הניחו טפיחה של ג'ל אולטרסאונד צנטריפוגי על ראשו של בעל החיים, עם מספיק ג'ל כדי לכסות את כל הקרקפת מעל הגולגולת.
- יוצקים DI ומים degassed לתוך אמבט המים עד 80%, ולאחר מכן חריץ את אמבט המים על העמודים המתאימים על הרציף.
- מנמיכים את אמבט המים המלא במי DI עד שהקרום התחתון נוגע בג'ל האולטרסאונד שעל ראשו של בעל החיים, ויוצר משטח צימוד בין המים לג'ל. ודא כי ג'ל אולטרסאונד מכסה את כל הראש של החיה לאמבט המים וכי אין בועות אוויר בג'ל האולטרסאונד בין אמבט המים לקרקפת של העכבר.
- השקיעו את מתמר האולטרסאונד באמבט המים, וודאו שלא נוצרות בועות אוויר על משטח המתמר.
- הנמיכו את זרוע המתמר באמצעות Jog Mode Down לכיוון המתמר השקוע חלקית, וחברו אותה למתמר על ידי יישור החריצים המגנטיים זה עם זה בזמן שמשטח המתמר נשאר שקוע.
- כבה את מצב ריצה ולאחר מכן צא מחיפוש ממוקד, כפי שנעשה במהלך שלב האתחול. הקפד לאשר את המיקום הביתי כפי שנעשה בעבר.
- עבור אל כרטיסיית הטיפול ולאחר מכן העלה את קבצי ה- MRI המשוקללים לאחר ניגודיות T1 על ידי לחיצה על סמל התיקיה באמצע העליון של המסך. בחר בתיקייה הכוללת את קובצי DICOM שהועלו למחשב בעבר ופתח אותם. שלב זה אמור לטעון אוטומטית את כל קובצי DICOM בחלונית הימנית העליונה.
- לאחר מכן, בכרטיסייה מצב סוניקציה , בחר את מצב הטיפול המתאים על-ידי בחירה באפשרות Burst או Continuous Wave. במצב רצף מהיר, בכרטיסיה הגדרות סוניקציה , הזן את אורך רצף המשחקים, תקופת רצף הרצף ומספר התקופות. פרמטרים אלה יתאימו לכל מיקום סוניקציה. אם אתה במצב גל רציף, הזן רק את משך הסוניקציה.
הערה: במחקר זה, נעשה שימוש במצב גל רציף למשך 120 שניות. - לחץ על סמל היעד באמצע העליון של הדף ובחר את המיקומים המתאימים על פרוסת MRI הנכונה שבה יש לכוון את אזור מוקד FUS. ריבוע אדום בהיר עם עיגול אדום יהיה נוכח במקום שבו לוחצים עליו. ניתן לבחור יותר מבחירה אחת.
- משמאל לתמונת ה-MRI מופיעה טבלה, שתאוכלס בקואורדינטות התלת-ממדיות של אזורי המוקד שנבחרו. בעמודה האחרונה של הטבלה, הזן את רמת ההספק שיש להפעיל בכל נקודת מוקד, אותה ניתן לחשב בנפרד עבור כל מתמר המשמש להשגת רמות הלחץ או העוצמה הרצויות. לחץ על כל נקודת מוקד בטבלה כדי לאשר, מה שיגרום לקואורדינטות להיות מודגשות, ואזור המוקד המתאים בתמונה יהפוך כחול.
הערה: עיין בגליון הנתונים של המתמר כדי לקבוע כיצד לתרגם את רמת ההספק שהוזנה בטבלה ללחץ או עוצמה, מכיוון שערכים אלה ספציפיים למתמר. - לאחר שתהיו מרוצים מכל אזורי המוקד, בחרו ' מבחן תנועה'. פעולה זו תנחה את התוכנה להעביר את המתמר לכל נקודות המוקד כדי להבטיח שהתנועות אפשריות. לאחר האישור, התוכנה תציין שמבחן התנועה הושלם. אם מתרחשת שגיאה, התאם את אזורי המוקד כך שיוכלו להתאים לצירים התלת-ממדיים של מנועי המתמרים.
- לאחר המוכן, בחר Begin Sonication כדי להתחיל את פרוטוקול הסוניקציה, להזיז את המתמר ולהחיל את פרמטרי FUS הנכונים בכל אזור מוקד שנבחר.
- לאחר סיום פרוטוקול הסוניקציה, נתקו את המתמר מזרוע המתמר, הסירו את אמבט המים מהפלטפורמה ונגבו את ג'ל האולטרסאונד מהקרקפת של החיה.
- שחררו את הברגת הנשיכה ומוטות האוזניים, הוציאו את בעל החיים ממיטת ה-MRI, ולאחר מכן הניחו את בעל החיים על כרית חמה עד שבעל החיים יתעורר מההרדמה. בשלב זה, להחזיר את החיה לכלוב שלה.
- עבור בעלי חיים עוקבים, חזור על אותו פרוטוקול, החל מסעיף 6.
- לאחר הטיפול בבעלי החיים הרצויים, נקו את כל המשטחים בהם נגעו בעלי חיים עם 70% אתנול (ראו טבלת חומרים).
- צא מהתוכנה ולאחר מכן כבה וכבה כל פריט ציוד.
9. שלבים לאחר הטיפול
- חזור על פרוטוקול מערכת הדמיה in vivo (IVIS) מסעיף 1 עבור bioluminescence מדידה 24 שעות לאחר הטיפול. כדי לנתח את יעילות הטיפול, השווה את רישומי הביולומינסנציה לפני ואחרי הטיפול כדי לקבוע את קצב הצמיחה הן עבור קבוצות מטופלות והן עבור קבוצות שלא טופלו.
- בצע סריקות MRI מעקב באמצעות אותן הגדרות משלב 6.4. באמצעות סריקות משופרות ניגודיות, השווה את עוצמת גווני האפור הממוצעת של אזור הגידול או חשב את הנפח הכולל המכוסה על ידי סוכן הניגוד כדי לקבוע הבדלים בנפח הגידול לפני ואחרי הטיפול.
Representative Results
ירידה בגודל הגידול בבעלי חיים שטופלו ב-SDT 24 שעות לאחר הטיפול.
ביום הטיפול ב-SDT, האות הביולומינסנציה הממוצע המקורי עבור קבוצות הבקרה והטיפול (N = 4 כל אחת) היה 2.0 x 10 6 ± 3.1 x 10 6 ו- 2.3 x 10 6 ± 1.3 x 10 6 p/s/cm2/sr, בהתאמה. ערכי הביולומינסנציה הממוצעים המתאימים לגודל הגידול לפני הטיפול בין שתי הקבוצות לא היו מובהקים סטטיסטית (p = 0.89). האות הביולומינסננטי הממוצע של קבוצת הטיפול היה 3.57 x 10 6 ± 2.3 x 10 6 24 שעות לאחר SDT, בעוד שהאות הביולומינסנטי של קבוצת הביקורת הוגדל ל 5.5 x 10 6 ± 8.2 x 10 6 p/s/cm2/sr. כפי שניתן לראות בתרשים 5, נתון זה תואם לשיעור צמיחה של 83.4% ± 78% ו-172% ±-34%, בהתאמה, בהנחה של צמיחה אקספוננציאלית (p = 0.08). מבין ארבעת בעלי החיים שטופלו, לשלושה היו שיעורי גדילה נמוכים יותר לאחר הטיפול בהשוואה לקבוצת הביקורת. היה חריג אחד בקבוצת הטיפול שהראה צמיחה דומה לקבוצת הביקורת, והטה את הסטיות.
בנוסף, בעלי החיים עברו הדמיית MR משופרת בניגודיות למחרת הטיפול להשוואה לפני ואחרי הטיפול של הגידול. העוצמה הממוצעת בגווני אפור של חומר ניגוד בגידולים בוצעה על פני כל פרוסת MRI עבור כל בעל חיים כדי למדוד כמה חומר ניגוד נכנס לגידולים לאחר הטיפול, כהערכה של גודל הגידול. לפני הטיפול, עוצמת האפור הממוצעת של הגידול בין קבוצת הביקורת לקבוצות המטופלות הייתה דומה. בממוצע, עוצמת גווני אפור זו עלתה בקבוצת הביקורת לסדר גודל גדול יותר מאשר בקבוצות שטופלו, אם כי זה לא היה מובהק (p = 0.47). ניתן לראות נתונים אלה בטבלה 2. השונות הגבוהה של תוצאות אלה עשויה לנבוע מהעובדה כי MRI נלקחו רק 24 שעות לאחר הטיפול, אז הפוטנציאל הטיפולי של SDT רק מתחיל להתרחש. אף על פי כן, איור 6 מציג דוגמה לנגעים שנוצרו על-ידי SDT.
איור 1: הגדרת מערכת FUS. (למעלה) מערכת MRgFUS עם רכיבים מסומנים. (חזית) 1. פלטפורמה. 2. זרוע מתמר ממונעת ציר. 3. מתמר FUS. 4. אמבט מים. 5. מיטת MRI. 6. צג. 7. קופסת התאמת עכבת מתמר. 8. קופסת מגבר כוח. 9. מחולל פונקציות. 10. גנרטור פונקציות ערוץ 1 יציאת BNC. 11. מחשב שולחני. (למטה) מערכת MRgFUS עם סכימת חיווט מקודדת בצבע עם החיבורים הבאים. (חזרה) 1. כבלי חשמל. 2. צג HDMI ל- HDMI שולחני. 3. יציאה B USB B ל- USB A שולחני. 4. Oscilloscope LAN Ethernet ל- Desktop Ethernet. 5. ממשק תנועה Ethernet לשולחן העבודה Ethernet. 6. Oscilloscope aux in/out BNC to AWG input BNC. 7. אוסצילוסקופ ערוץ 1 (קדמי) BNC לסנכרון BNC. 8. פלט קופסה תואם BNC לקלט RF קואקסיאלי. 9. פלט RF קואקסיאלי לתיבה תואמת קואקסיאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: רישום פנטום. (A) הגדרת המערכת והתוכנה במהלך רישום פנטום. (B) צילום מסך של מסך רישום הפנטום, כאשר העיגול האדום הוא ההיקף שנבחר של חתך הציר. (C) פנטום מונח על מיטת MRI, מבט מלמעלה. (D) מבט צדדי על הפנטום, כאשר הקו האדום נמצא בפרוסה הצירית המתאימה לעיגול ב-C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיקום בעלי חיים. (A) מיטת MRI ועריסה, עם חלקים שונים מסומנים: 1. עריסת MRI. 2. מיטת MRI סטריאוטקטית. 3. אוזניות. 4. חטיף ביס. 5. חרוט האף. 6. חור יתד במיטת MRI. 7. צינורות הרדמה איזופלורן. (B) איור המייצג את מיקום העכבר על מיטת ה-MRI ואת מיקומו על העריסה, עם סליל RF (כתום) (איור שונה באמצעות תבנית Biorender 2022). (C) איור המייצג את מיקום העכבר על מיטת ה-MRI במהלך טיפול FUS (איור שונה באמצעות תבנית Biorender 2022). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בחירת נקודת מוקד. דוגמה לבחירת נקודת סוניקציה בחיה בודדת. כל עמודה מייצגת פרוסת MRI לאחר ניגודיות משוקללת T1, כאשר כל פרוסה היא 0.5 מ"מ בכיוון הפרוקסימלי (פרוסה 1) עד דיסטלי (פרוסה 5). גבול הגידול חולק ידנית ומשורטט באדום (שורה 1), ומיקומי הסוניקציה המתאימים (שורה 2) מיוצגים על ידי ריבוע ירוק בהיר (מרכז מוקד מקסימלי) ועיגול כחול (היקף מוקד חצי מקסימלי). כל מיקום היה sonicated במשך 2 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים 5: קצב הצמיחה בעקבות SDT. קצב הגדילה של גידולי GBM מטיפול לפני עד 24 שעות לאחר SDT בבעלי חיים מטופלים ולא מטופלים (בקרה) עם גידולי M59 תוך גולגולתיים בהתבסס על עוצמת האור שנמדדה. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. מבחן T של תלמיד בן שני מדגמים בוצע כדי לקבוע את המובהקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: נגע שנוצר על ידי SDT. סריקות MRI משוקללות T1 לפני ואחרי ממודל של בעלי חיים הכוללות פרוסה צירית מייצגת המראה נגע בגידול שנוצר על ידי SDT. (משמאל) בדיקת MRI שנלקחה לפני טיפול SDT, כאשר הגידול מסומן באדום. (באמצע) בחירת נקודת מוקד FUS שבה הלחץ המרבי מיוצג על ידי עיגולים בצבע כחול בהיר ואזורי הלחץ המרבי למחצה מיוצגים על ידי עיגולים כחולים. (ימין) סריקות MRI לאחר SDT, כאשר הגידול מסומן באדום. נגעים שנוצרו על ידי SDT וחור המזרק להשתלה מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| רצף | T1 |
| זמן חזרה | 3000 מטר/שניה |
| זמן הד | 30 מטר/שניה |
| עובי פרוסה | 0.5 מ"מ |
| מספר פרוסות | 25 |
| מרווח פיקסלים | 0.187 מ"מ x 0.187 מ"מ |
| מטריצת רכישה | 133 x 133 |
| ממוצעים | 4 |
טבלה 1: הגדרות MRI.
| לשלוט | קבוצת SDT | ערך P | |
| טיפול מקדים | 7.49 x 10 3 ± 2.2 x 103 | 7.48 x 10 3 ± 1 x 103 | 0.99 |
| לאחר הטיפול | 8.79 x 103 ± 7.7 x 102 | 7.95 x 10 3 ± 1.1 x 103 | 0.33 |
| הבדל באחוזים | 16% ± 16% | 7% ± 12% | 0.47 |
טבלה 2: גווני אפור של MRI משוקלל T1 משופר לאחר ניגודיות.
Discussion
אפשרויות טיפול חדשות ויעילות נחוצות לחולים עם GBM. פרוטוקול זה התווה טיפול פרה-קליני בתיווך FUS עבור GBM שנמצא כעת בחקירה מקיפה לתרגום קליני. למרות של-SDT יש פוטנציאל מרגש, יש עדיין הרבה מה להבין ולייעל במסגרת הפרה-קלינית.
אחד המרכיבים החשובים ביותר של פרוטוקול זה הוא שימוש ב- FUS מונחה MR כדי למקד את הגידול ליעילות מרבית. באמצעות פאנטום ניתן ליצור מרחב קואורדינטות תלת-ממדי, שבו ניתן להקצות לכל פיקסל של פרוסות MRI ציריות קואורדינטה. לאחר מכן, הליך פשוט של בחירת מיקום הסוניקציה בתמונת MR מודיע למתמר לאן לכוון. מערכת FUS הפרה-קלינית המשמשת היא רב-תכליתית ביותר וישימה כאשר יש צורך להתמקד במיקומים של פתולוגיה ספציפית כגון גידול, כולל גידולים עמוקים יותר שיהיה קשה להתמקד בהם ללא אישור הדמיה. באמצעות גדוליניום כסוכן ניגוד, יש הדמיה ברורה של הגידול, המאפשר למשתמש לקבל החלטות מושכלות בעת בחירת מטרות. היתרון שיש ל-SDT על פני טיפולים רבים אחרים הוא שמדובר בטיפול ספציפי לגידול. FUS בעוצמה נמוכה צריך להתמקד רק ברקמת הגידול, תוך השארת פרנכימה בריאה במוח יחסית ללא נגיעה 3,8.
תוצאות ניסוי זה מדגישות כיצד היתרונות של פרוטוקול זה יכולים להוביל לתוצאות טיפוליות הדומות לממצאים אחרים בספרות עבור SDT. איור 5 מראה שבתוך 24 שעות בלבד לאחר יום הטיפול, חלה האטה בצמיחת הגידול בקבוצה שטופלה. למרות שאין משמעות בשימוש בגודל מדגם קטן זה, משמעות עשויה לגרום למספר גדול יותר של בעלי חיים. עיכוב זה בצמיחת הגידול דומה למה שהוצג במאמר החלוצי בנושא זה על ידי Wu et al. (2019), אשר הציג האטה בצמיחת הגידול לאורך זמן בבעלי חיים מטופלים, כמו גם זמני הישרדות מוגברים9.
שיקולים שנעשו בעת תכנון פרוטוקול זה כללו זן בעלי חיים, סוג הגידול ובחירת סוכן sonosensitizing . עכברים עירומים אתימיים נבחרו לפרוטוקול זה מסיבות רבות. ראשית, העכבר העירום קל יותר לסוניקציה מכיוון שחוסר השיער מונע כל הנחתה. כמו כן, היעדר מערכת חיסונית מאפשר השתלה של xenografts נגזר המטופל (PDXs) כך מודל הגידול דומה יותר למצב הקליני. החיסרון בשימוש במודל אתימי הוא שלא ניתן לאפיין את מערכת החיסון, ולכן כל תגובה חיסונית הנוצרת על ידי SDT לא תימדד במחקרים אלה10. קו הגידול שנבחר הוא קו PDX אגרסיבי וצומח במהירות. זמן הטיפול חשוב מאוד מכיוון שיש לאמת את הקמת הגידול, אך נטל הגידול לא צריך למלא את חצי כדור הגולגולת. קווי תאים שונים דורשים זמני דגירה שונים כדי להשיג גידול בגודל אופטימלי לניסויים פרה-קליניים. בפרוטוקול זה, 5-ALA שימש כסונוסנסיטיזר בגלל ספיגתו המועדפת בגידולי GBM, אשר אושרה במבחנה עבור קו תאים זה בניסויים קודמים (נתונים שלא פורסמו). ניתן להחליף ולבדוק sonosensitizers אחרים כדי לקבוע את התרכובת המתאימה ביותר ליעילות ובטיחות. לבסוף, הטיפול החל 3 שעות לאחר הזרקת 5-ALA, שכן ספרות קודמת הראתה כי זהו הזמן האופטימלי עם מינוןהזרקה 5.
פרמטרי FUS שנבחרו בפרוטוקול זה (10 ואט/ס"מ 2 למשך2 דקות ב-515 קילוהרץ בכל מיקום מטרה) נקבעו על סמך סקירת ספרות קודמת וניסויים ראשוניים 4,9. רשת של נקודות סוניקציה המכסה את הגידול כולו נבחרה על מנת ליצור את אפקט ROS לאורך הגידול כולו. האינטנסיביות בה נעשה שימוש כאן גבוהה יותר מפרסומים אחרים, אך בטווח זמן קצר, הדבר אינו צפוי להוביל להשפעות שליליות הקשורות לטמפרטורה, שכן עוצמות של עד 25 ואט/ס"מ2 שימשו בהצלחה במודל עכבר ללא תופעות לוואי משמעותיות11. חשוב לציין, לא פורסמה בספרות קבוצה סטנדרטית או ממוטבת של פרמטרים של FUS. לכן, ניתן להתאים את הערכים הספציפיים המדווחים כאן כדי לקבוע את מערכת הפרמטרים האופטימלית, מה שמוביל להפחתה מקסימלית של רקמת הגידול תוך שמירה על בטיחות. בנוסף, מכיוון שלקווי תאים שונים יש רמות שונות של כלי דם והיפוקסיה, ייתכן שיהיה צורך להתאים טיפול זה. הראינו ירידה כללית בצמיחת הגידול (איור 5) תוך 24 שעות מהטיפול ב-SDT, אף על פי שהפרמטרים צריכים להיות אופטימליים ולחיות נוספות צריכות להיבדק כדי לקבוע את ההשפעה המרבית של הטיפול הזה. סריקות MRI לאחר הטיפול לא מראות שום הופעה של נגעים שנוצרו על-ידי טיפול FUS ברקמה בריאה, עם השפעה מקומית לרקמת הגידול (איור 6). יש גם הזדמנות לשלב SDT עם טכניקות FUS אחרות, כגון חדירה זמנית של מחסום הדם-מוח, כדי למקסם את ספיגת 5-ALA בגידול12. פרוטוקול זה ניתן להשלים עוד יותר על ידי ביצוע טכניקות היסטולוגיה שונות כדי לבדוק בטיחות ויעילות ברמה המבנית. ניתן לבצע כתם המטוקסילין ואוזין (H&E) כדי לבדוק נזק מבני או גידולי13, ואילו כתם מסוף deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) ניתן לבצע כדי לבדוק אפופטוזיסתאי 14. בכל מקרה, פרוטוקול זה מציג טיפול בטוח וספציפי לגידול שבו השינויים מורגשים אפילו 24 שעות לאחר הטיפול, דבר שניתן לראות על ידי השוואת קצב הצמיחה של גידולים שטופלו ב- SDT וגידולים לא מטופלים, כמו גם השוואת פרוסות גידול לפני ואחרי סוניקציה.
בכל פרוטוקול, תמיד יש חסרונות או מגבלות שצריך לשקול. המגבלה העיקרית של הפרוטוקול הנוכחי היא זמן והוצאות. בינתיים, אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא המטרה הממוקדת האוטומטית שלו. כדי לבצע הליך ממוקד זה, יש לבצע סריקות MRI עבור כל בעל חיים בנפרד כדי להבטיח כי המיקוד של הגידול נכון, תהליך שיכול להיות גם זמן רב וגם יקר. בנוסף, בהתאם למספר המוקדים הרצוי, משך הזמן לביצוע פרוטוקול זה יכול להיות שעות אפילו עבור בעלי חיים בודדים, וכתוצאה מכך מספר נמוך של בעלי חיים ניסיוניים. למרות חסרונות אלה, פרוטוקול לא פולשני ממוקד זה נותר העדפה אפשרית בהשוואה לאפשרויות ניתוח פתוחות.
לסיכום, פרוטוקול זה הראה את היכולת של טיפול SDT להפחית את צמיחת הגידול במוח תוך 24 שעות מהטיפול תוך שמירה על רקמה עצבית בריאה במודל עכבר פרה-קליני. מחקרים על היעילות של SDT ואופטימיזציה של הפרמטרים השונים כדי להגדיל את ייצור ROS נחוצים כדי להפוך את הטיפול הזה מתאים קלינית. יש לבחון דרכים חדשות לשימוש ב-SDT כמודל טיפולי לא פולשני.
Disclosures
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי. אמיר מנבצ'י מלמד ומייעץ עבור BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical, והוא ממציא במספר טכנולוגיות FUS הממתינות לפטנט. בטי טיילר קיבלה מימון מחקר מה-NIH והיא בעלים שותפה של Accelerating Combination Therapies*. Ashvattha Therapeutics Inc. גם רשמה את אחד הפטנטים שלה, והיא בעלת מניות עבור Peabody Pharmaceuticals (*כולל מניות או אופציות).
Acknowledgments
המחברים מודים על תמיכת מימון מפרס STTR שלב 1 של הקרן הלאומית למדע (NSF) (#: 1938939), על ידי פרס ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (#: N660012024075), ותוכנית חוקרי המחקר הקליני של מכון ג'ונס הופקינס למחקר קליני ותרגומי (ICTR's) (KL2), המנוהלת על ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NCATS) של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). התאים נרכשו וסופקו על ידי קרן מאיו לחינוך רפואי ומחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
- Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (4), 299-312 (2020).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- McHale, A. P., Callan, J. F., Nomikou, N., Fowley, C., Callan, B. Sonodynamic therapy: concept, mechanism and application to cancer treatment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 880, 429-450 (2016).
- Ohmura, T., et al. Sonodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid and focused ultrasound for deep-seated intracranial glioma in rat. Anticancer Research. 31 (7), 2527-2533 (2011).
- Shono, K., et al. Elevated cellular PpIX potentiates sonodynamic therapy in a mouse glioma stem cell-bearing glioma model by downregulating the Akt/NF-κB/MDR1 pathway. Scientific Reports. 11 (1), 15105 (2021).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Borah, B. M., et al. Sonodynamic therapy in combination with photodynamic therapy shows enhanced long-term cure of brain tumor. Scientific Reports. 10 (1), 21791 (2020).
- Wu, S. -K., Santos, M. A., Marcus, S. L., Hynynen, K. MR-guided focused ultrasound facilitates sonodynamic therapy with 5-Aminolevulinic acid in a rat glioma model. Scientific Reports. 9 (1), 10465 (2019).
- Zhang, Q., et al. Sonodynamic therapy-assisted immunotherapy: A novel modality for cancer treatment. Cancer Science. 109 (5), 1330-1345 (2018).
- Nonaka, M., et al. Sonodynamic therapy consisting of focused ultrasound and a photosensitizer causes a selective antitumor effect in a rat intracranial glioma model. Anticancer Research. 29 (3), 943-950 (2009).
- Pi, Z., et al. Sonodynamic therapy on intracranial glioblastoma xenografts using sinoporphyrin sodium delivered by ultrasound with microbubbles. Annals of Biomedical Engineering. 47 (2), 549-562 (2019).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 1: Data acquisition, anatomical feature segmentation, tracking global volume and density changes. Journal of Neuroscience Methods. 364, 109354 (2021).
- Chimata, A. V., Deshpande, P., Mehta, A. S., Singh, A. Protocol to study cell death using TUNEL assay in Drosophila imaginal discs. STAR Protocols. 3 (1), 101140 (2022).
