Summary
Her beskriver vi en protokoll som beskriver hvordan du utfører sonodynamisk terapi i en in vivo musglioblastommodell ved hjelp av magnetisk resonansstyrt fokusert ultralyd.
Abstract
Sonodynamisk terapi (SDT) er en anvendelse av fokusert ultralyd (FUS) som gjør det mulig for et sonosensibiliserende middel å prime svulster for økt følsomhet under sonikering. Dessverre mangler nåværende kliniske behandlinger for glioblastom (GBM), noe som fører til lave langsiktige overlevelsesrater blant pasienter. SDT er en lovende metode for behandling av GBM på en effektiv, ikke-invasiv og tumorspesifikk måte. Sonosensibilisatorer går fortrinnsvis inn i tumorceller sammenlignet med det omkringliggende hjerneparenkymet. Anvendelsen av FUS i nærvær av et sonosensibiliserende middel genererer reaktive oksidative arter, noe som resulterer i apoptose. Selv om denne terapien tidligere har vist seg å være effektiv i prekliniske studier, mangler det etablerte standardiserte parametere. Standardiserte metoder er nødvendige for å optimalisere denne terapeutiske strategien for preklinisk og klinisk bruk. I dette papiret beskriver vi protokollen for å utføre SDT i en preklinisk GBM-gnagermodell ved bruk av magnetisk resonansstyrt FUS (MRgFUS). MRgFUS er en viktig funksjon i denne protokollen, da den muliggjør spesifikk målretting av hjernesvulst uten behov for invasive operasjoner (f.eks. kraniotomi). Den stasjonære enheten som brukes her, kan fokusere på et bestemt sted i tre dimensjoner ved å klikke på et mål på et MR-bilde, noe som gjør målvalg til en enkel prosess. Denne protokollen vil gi forskere en standardisert preklinisk metode for MRgFUS SDT, med ekstra fleksibilitet til å endre og optimalisere parametere for translasjonsforskning.
Introduction
Glioblastom (GBM) er en form for svært aggressiv hjernekreft som har en forekomst på 3,21 per 100 000 mennesker og er den vanligste ondartede hjernesvulsten1. Den nåværende standarden for omsorg inkluderer kirurgisk reseksjon, stråling og kjemoterapi2. På grunn av svulstens invasive og infiltrerende natur er fullstendig tumorreseksjon sjelden. Restvev ved tumormarginene gir høy grad av tumorresidiv og lav overlevelse på mindre enn 6 % etter 5 år1.
På grunn av denne prognosen undersøker forskere nye terapeutiske alternativer for å bekjempe denne dødelige sykdommen. Sonodynamisk terapi (SDT) er en ikke-invasiv behandling som kombinerer lavintensitetsfokusert ultralyd (FUS) og sonosensibiliserende midler for å produsere en cytotoksisk effekt i målrettede celler3. Som et eksempel blir porfyrinbaserte sonosensibilisatorer som 5-aminolevulinsyre (5-ALA) fortrinnsvis tatt opp av tumorceller og øker produksjonen av reaktive oksidative arter (ROS) til skadelige nivåer når de blir utsatt for fokusert ultralyd. Overuttrykte nivåer av ROS i celler kan skade cellulære strukturer og utløse apoptose. Siden 5-ALA fortrinnsvis tas opp av tumorceller, er friskt vev i behandlingsregionen uskadd 3,4. Foreløpige in vitro-studier har vist at mange kreftceller lyseres av SDT-behandling, selv om frekvensen av celledød er avhengig av cellelinjen. Foreløpige in vivo-studier gir lignende resultater, og bekrefter at SDT kan utløse apoptose5.
Denne protokollen tar sikte på å beskrive effektive teknikker og parametere for SDT-behandling av gnagermodeller med intrakranielt implanterte GBM-celler ved hjelp av en stasjonær FUS-forskningsplattform. Forskere kan bruke denne protokollen til å utføre og optimalisere SDT for translasjonell FUS-forskning.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent og utført i samsvar med Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Athymiske nakne hunnmus (alder: 10 uker) ble hentet fra kommersielle kilder (se materialfortegnelse). Alle forskrifter for biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) ble fulgt, inkludert bruk av masker, hansker og kjoler.
1. Tumorimplantasjoner og bioluminescensavbildning
- I den innledende fasen av studien utføres intrakranial tumorimplantasjon, etter en tidligere publisert rapport6.
MERK: I denne studien ble 100 000 M59 humane GBM xenograftceller i 4 μL cellesuspensjon brukt til implantasjon på 3,0 mm dybde i skallen. - Før behandling, kvantifiser tumorstørrelsen i hver mus ikke-invasivt ved hjelp av et in vivo luminescensavbildningssystem (se materialfortegnelse) etter en tidligere publisert rapport7.
MERK: Dette ble gjort på behandlingsdatoen, 7 dager etter innledende tumorimplantasjoner. - Ved hjelp av bildekvantifisering, del musene i sammenlignbare undergrupper for behandling.
MERK: I denne studien ble to undergrupper inkludert: (1) ubehandlede tumorbærende mus (n = 4) og (2) tumorbærende mus som gjennomgikk SDT (n = 4). Det ble ikke observert statistisk signifikant forskjell i tumorstørrelse før behandling mellom de to gruppene (p > 0,05).
2. Oppsett av behandlingsdag
- Ta ut 5-ALA-hydroklorid (se materialfortegnelse) fra fryseren og vei ut 200 mg/kg musevekt på 5-ALA (f.eks. for en 25 g mus, vei ut 5 mg.). Gjør det kun under omgivelseslys.
MERK: Steril alt utstyret før bruk. - Løs opp den totale mengden 5-ALA i fosfatbufret saltvann (PBS), slik at hvert dyr administreres en 60 mg / ml oppløsning av 5-ALA med riktig vektdose (f.eks. For en 25 g mus, oppløs 5 mg 5-ALA i 83,33 μL PBS).
- For hvert dyr i SDT-testgruppen, injiser riktig mengde oppløsning av 5-ALA i dyret intraperitonealt (beregnet i trinn 2.1 og 2.2).
- La dyrene ligge i burene i 3 timer for å metabolisere 5-ALA.
3. Utarbeidelse av forutsetninger for eksperimenter
- Fyll et reservoar med avionisert (DI) vann.
MERK: Mengden vann som trengs er basert på antall mus som brukes i studien. - Fest Flow in og Flow out-rørene til ultralydavgasseren (se materialfortegnelse) og koble avgasseren til strømmen (1 = ON, 0 = OFF).
- Plasser den andre enden av Flow in og Flow out-rørene i DI-vannbeholderen.
- Slå på luftegasseren og løp i 45 minutter.
- Fyll det nylig avgassede vannet til toppen av en lufttett, forseglet beholder som skal brukes under studien.
- Hell ultralydgel (se materialfortegnelse) i et konisk rør, og legg deretter i en sentrifuge og spinn ved 160 x g i 5 minutter for å fjerne luft fra gelen.
MERK: Nok gel er nødvendig for å danne en klatt gel på hodet til hvert dyr.
4. Oppsett av MRgFUS-system
- Koble MRgFUS-systemet (se Materialfortegnelse) ved hjelp av koblingsskjemaet som vist i figur 1 (nederste panel).
- Koble alle nødvendige komponenter (stasjonær datamaskin, skjerm, MRgFUS-plattform, oscilloskop, forsterker) til strøm.
- Koble alle kabler til de riktige stedene.
- Koble ønsket svinger til MRgFUS-plattformen via BNC- og koaksialkablene, og koble deretter den tilsvarende impedansmatchingsboksen til de riktige ledningene.
MERK: En 515 kHz svinger ble brukt til denne studien.
- Slå på alle enheter.
- Åpne AUREUS-applikasjonen på den stasjonære datamaskinen, som allerede er integrert i FUS-systemprogramvaren.
- Velg Koble til all maskinvare for å koble maskinvaren til systemet og kontrollere at komponentene kommuniserer med programvaren.
- Velg svingeren som brukes ved å velge rullegardinmenyen og velge ønsket svinger.
5. Initialisering
- Skru løs bunnskruen fra fantomet og fyll hulrommet med avionisert og avgasset vann til det renner over, og sett deretter skruen på igjen.
- Sett inn fantomet i den tilsvarende MR-sengeplasseringen (se figur 2), og plasser deretter MR-sengen i MR-holderen i det tilsvarende sporet.
- Plasser MR-holderen på tilsvarende plassering i MR-skanneren (se Materialfortegnelse). Juster holderen slik at fantom-MR-sengen kan gli inn i MR-boringen uten hindringer for å få et høykvalitetsbilde av fantomet. Merk denne plasseringen slik at den lett kan replikeres i fremtiden.
MERK: Når denne plasseringen er funnet, vil plasseringen ikke bli endret for resten av behandlingen. Sørg derfor for at det er et tilstrekkelig sted for MR-plassering av dyr, ellers må hele registreringen gjentas. - Ta en MR-skanning av fantomet ved hjelp av innstillingene i tabell 1.
- Fjern holderen fra magnetboringen, men hold den på skanneren. Fjern MR-sengen som inneholder fantomet fra holderen, og legg deretter sengen med fantomet på MRgFUS-systemet ved å skyve pinnen på bunnen inn i riktig spor.
- Sett registreringsspissen på magnetsporene på svingerarmen slik at den peker nedover mot fantomet (se figur 2).
- Velg Velg en ny startposisjon i programvaren, og velg deretter Jog Mode On for å starte veiledet fokusert søk. Når joggemodus er vekslet, bruker du venstre, høyre, opp, ned, side opp og side ned-tastene for å flytte svingerarmen manuelt rundt i henholdsvis venstre, høyre, fremover, bakover, opp og ned.
- Juster pekeren manuelt i alle tre dimensjoner til spissen av pekeren berører midten av kryssmønsteret som ligger på toppen av fantomet (se figur 2).
- Last ned fantom-MR-bildene til datamaskinen og plasser dem i en mappe i den valgte katalogen, og last deretter MR-bildene inn i programvaren ved å velge Last inn fantombilder. De aksiale fantomskivene vil deretter fylle skjermen på høyre side. Bla gjennom disse skivene via musens rullefelt. Juster lysstyrken ved å klikke og holde på bildet og deretter flytte musen opp eller ned.
MERK: Hvis noen av filene i mappen ikke er ukomprimerte DICOM-filer, vil ikke programvaren kunne lese og importere dem, så fjern eventuelle andre filer fra den mappen. - Bla til et hvilket som helst bilde av fantomet der det er en klar sirkel med tre mørke hull i hver. Klikk på midten av fantomet, og en rød sirkel vil dukke opp. Klikk og dra på sirkelen til den har samme diameter og på linje med omkretsen av fantomet (se figur 2).
- Koordinatene for denne stillingen omtales som «hjemmeposisjon»; Lagre dette ved å klikke Angi L/R, A/P og S/I.
- Klikk Jaggemodus av, fjern registreringstipset fra svingsarmen, og velg deretter Avslutt fokussøk. Bekreft hjemposisjonen for å fullføre initialiseringssekvensen.
6. Dyr forberedelse for SDT
- Bedøv musen ved hjelp av en isofluran-O2-gassblanding i et induksjonskammer. Sett gasstrømningshastigheten til 1,0 ml / min og fordamperen til 2,0% for anestesiinduksjon, som vanligvis krever 3-5 minutter i kammeret (se materialfortegnelse).
- Vurder dyret for tilstrekkelig sedasjon ved å klemme tåen. Påfør en oftalmisk salve i øynene for å unngå tørrhet i hornhinnen.
MERK: Overvåk anestesidybden gjennom hele prosedyren. - Injiser musen med 40 mikrol gadoliniumkontrastmiddel gjennom halevenen (se materialfortegnelse).
- Fjern hår som hindrer hodebunnen over skallen ved hjelp av en hårfjerningskrem og en elektronisk barbermaskin.
- Fest dyret til MR-sengen ved hjelp av følgende trinn (se figur 3).
- Koble innløpsrøret til MR-sengen (figur 3A) til en isoflurankilde for anestesi, og sett gasstrømningshastigheten til 1,0 ml / min og fordamperen til 2,0% for anestesiinduksjon. Koble utløpsrøret til en kullfilterbeholder for absorpsjon av anestesi.
- Plasser nesekjeglestykket i sporet, som vist i figur 3B. Skyv bitebjelken gjennom bittbarhullene både i nesekjeglen og i enden av sengen, som vist, med bitebeskyttelsesenden svevende over den åpne brønnen i MR-sengen.
- Plasser dyret på MR-sengen med ørene på linje med de stereotaktiske ørestanghullene og lås tennene gjennom bittbeskyttelsen for å holde den på plass. Skyv nesekeglen fremover slik at den er over toppen av dyrets snute for å gi en jevn strøm av anestesi.
- Skyv ørestengene gjennom hullene på begge sider av MR-sengen og løft dyrets hode til begge ørestengene kan passe inn i musens ørekanaler.
NOTAT: Ikke skyv for langt, da dette kan skade dyrets trommehinner. - Sørg for at dyret er i en komfortabel stilling. Deretter bruker du en flatskrutrekker til å skru inn de MR-kompatible skruene for å låse inn begge ørestengene, nesekjeglen og bittstangen. Dette vil låse dyret på plass og forhindre hodebevegelse til dyret er fjernet fra sengen.
MERK: Forsikre deg om at det ikke er noen forstyrrelse av dyrets plassering på MR-sengen etter dette trinnet. Hvis dyret beveger seg, må hele oppsettet (trinn 6.5) gjentas, uavhengig av hvor langt protokollen er. - Mens dyret venter, legg MR-sengen på en varm varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen.
MERK: Overvåk og oppretthold kroppstemperaturen gjennom hele prosedyren.
- Isofluran tilføres dyret kontinuerlig via rør festet til nesekjeglene gjennom hele behandlingen når dyresengen er festet på FUS-systemet, ved hjelp av armaturene på plattformen.
7. MR-prosedyrer
- Ta MR-sengen med dyret stereotaktisk festet og legg det i MR-vuggen som tidligere var koblet til MR-skanneren (se materialtabell), ved å plassere MR-sengehullet i enden til pinnen på MR-vuggen, som vist i figur 3. Fest innløps- og utløpsanestesirørene til de tilsvarende rørene i MR-maskinen.
- Skyv MR-vuggen som inneholder dyret inn i MR-boringen, og sørg for å holde samme posisjonering som der fantomet ble plassert.
- Utfør en lokalisator for å se plasseringen av dyrehjernen og deretter en post-kontrast T1-vektet MR-skanning som dekker hele hjernen ved hjelp av MR-innstillingene fra tabell 2.
- Eksporter MR-skanningen som et sett med ukomprimerte DICOM-filer, én for hvert stykke.
8. Fokusert ultralydbehandling (figur 4)
- Fjern dyret fra MR-vuggen etter fullført skanning og plasser det på plattformen ved å plassere forsiden av sengen i den tilsvarende pinnen på baksiden av plattformen, og spalte baksiden av sengen i den tilsvarende pinnen.
- Koble innløpsrøret til MR-sengen til en kilde for isofluran for anestesi og sett gasstrømningshastigheten til 1,0 ml / min og fordamperen til 2,0% for vedlikehold av anestesi. Koble utløpsrøret til en kullfilterbeholder for absorpsjon av anestesi.
- Overfør settet med DICOM-filer til datamaskinen og plasser dem i en mappe i hovedarbeidskatalogen til den gjeldende studien.
MERK: Se trinn 5.9 for filkrav. - I programvaren, gå til hovedinitialiseringssiden og slå på Jog Mode ved å klikke på Guided Focus Finding og klikk deretter på Jog Mode On.
- Legg en skvett sentrifugert ultralydgel på dyrets hode, med nok gel til å dekke hele hodebunnen over skallen.
- Hell DI og avgasset vann i vannbadet opp til 80%, og spor deretter vannbadet på de tilsvarende kolonnene på plattformen.
- Senk vannbadet fylt med DI-vann til bunnmembranen berører ultralydgelen på dyrets hode, og danner en koblingsflate mellom vannet og gelen. Pass på at ultralydgelen dekker hele dyrets hode til vannbadet, og at det ikke er luftbobler i ultralydgelen mellom vannbadet og musens hodebunn.
- Senk ultralydtransduseren ned i vannbadet, slik at det ikke dannes luftbobler på transduseroverflaten.
- Senk svingerarmen ved hjelp av Jog Mode Down mot den delvis nedsenkede svingeren, og par den til svingeren ved å justere de magnetiske sporene med hverandre mens transduseroverflaten forblir nedsenket.
- Deaktiver joggemodus og deretter Avslutt fokusert søk, som gjort under initialiseringstrinnet. Sørg for å bekrefte hjemmeposisjonen som gjort før.
- Gå til behandlingsfanen, og last deretter opp de T1-vektede MR-filene etter kontrast ved å klikke på mappeikonet øverst til midten av skjermen. Velg mappen som inneholder DICOM-filene som ble lastet opp til datamaskinen tidligere, og åpne dem. Dette trinnet skal automatisk laste inn alle DICOM-filer i panelet øverst til høyre.
- Deretter velger du riktig behandlingsmodus i kategorien Sonikeringsmodus ved å velge enten Burst eller Continuous Wave. Hvis du er i burst-modus, skriver du inn bruddlengden, burstperioden og antall perioder i kategorien Sonikeringsinnstillinger . Disse parametrene vil tilsvare hvert sonikeringssted. Hvis du er i kontinuerlig bølgemodus, må du bare angi sonikeringsvarigheten.
MERK: I denne studien ble kontinuerlig bølgemodus brukt i en varighet på 120 s. - Klikk på målikonet øverst i midten av siden og velg de riktige stedene på riktig MR-skive der FUS-fokusområdet skal rettes. En lys rød firkant med en rød sirkel vil være til stede der du klikker. Mer enn ett valg kan velges.
- Til venstre for MR-bildet er en tabell som fylles ut med 3D-koordinatene til de valgte fokusområdene. I den siste kolonnen i tabellen angir du effektnivået som skal sonikeres på hvert brennpunkt, som kan beregnes separat for hver transduser som brukes til å oppnå ønsket trykk- eller intensitetsnivå. Klikk på hvert fokuspunkt i tabellen for å bekrefte, noe som vil resultere i at koordinatene blir uthevet, og det tilsvarende fokusområdet på bildet blir blått.
MERK: Se dataarket for svingeren for å finne ut hvordan du oversetter effektnivået som er angitt i tabellen til trykk eller intensitet, da disse verdiene er transduserspesifikke. - Når du er fornøyd med alle fokusområder, velger du Bevegelsestest. Dette vil be programvaren om å flytte transduseren til alle fokuspunktene for å sikre at bevegelsene er mulige. Etter bekreftelse vil programvaren indikere Motion Test Complete. Hvis det oppstår en feil, justerer du fokalområdene slik at de får plass innenfor 3D-aksene til svingermotorene.
- Når du er klar, velg Start Sonication for å starte sonikeringsprotokollen, flytte transduseren og bruke de riktige FUS-parametrene ved hvert valgt fokusområde.
- Når sonikeringsprotokollen er ferdig, kobler du transduseren fra transduserarmen, fjerner vannbadet fra plattformen og tørker ultralydgelen fra dyrets hodebunn.
- Skru av bitt og ørestenger, fjern dyret fra MR-sengen, og legg deretter dyret på en varm pute til dyret våkner opp fra anestesi. På dette tidspunktet returnerer dyret til buret.
- For etterfølgende dyr, gjenta samme protokoll, fra og med avsnitt 6.
- Når de ønskede dyrene er behandlet, rengjør alle overflater berørt av dyr med 70% etanol (se materialfortegnelse).
- Avslutt programvaren, og slå deretter av og slå av hvert utstyr.
9. Trinn etter behandling
- Gjenta in vivo imaging system (IVIS)-protokollen fra avsnitt 1 for bioluminescens som måler 24 timer etter behandling. For å analysere behandlingseffektiviteten, sammenlign bioluminescensregistreringene før og etter behandling for å bestemme vekstraten for både behandlede og ubehandlede grupper.
- Utfør oppfølgende MR-skanninger med de samme innstillingene fra trinn 6.4. Ved hjelp av kontrastforsterkede skanninger, sammenlign den gjennomsnittlige gråtoneintensiteten i tumorområdet eller beregne totalvolumet som dekkes av kontrastmiddelet for å bestemme forskjeller i tumorvolum før og etter behandling.
Representative Results
Tumorstørrelsen avtar hos dyr behandlet med SDT 24 timer etter behandling.
På dagen for SDT-behandling var det opprinnelige gjennomsnittlige bioluminescenssignalet for kontroll- og behandlingsgruppene (N = 4 hver) henholdsvis 2,0 x 10 6 ± 3,1 x 10 6 og 2,3 x 10 6± 1,3 x 10 6 p/s/cm2/sr. Gjennomsnittlige bioluminescensverdier tilsvarende tumorstørrelse før behandling mellom de to gruppene var ikke statistisk signifikante (p = 0,89). Det gjennomsnittlige bioluminescenssignalet fra behandlingsgruppen var 3,57 x 10 6 ± 2,3 x 10 6 24 timer etter SDT, mens det bioluminescerende signalet fra kontrollgruppen ble økt til 5,5 x 10 6± 8,2 x 10 6 p/s/cm2/sr. Som vist i figur 5 tilsvarer dette en vekstrate på henholdsvis 83,4 % ± 78 % og 172 % ± 34 %, forutsatt eksponentiell vekst (p = 0,08). Av de fire behandlede dyrene hadde tre lavere vekstrater etter behandling sammenlignet med kontrollene. Det var en outlier i behandlingsgruppen som viste sammenlignbar vekst med kontroller, og skjev avvikene.
I tillegg gjennomgikk dyrene påfølgende kontrastforsterket MR-avbildning dagen etter behandling for sammenligning av svulsten før og etter behandling. Den gjennomsnittlige gråtoneintensiteten av kontrastmiddel i svulster ble utført over hver MR-skive for hvert dyr for å måle hvor mye kontrastmiddel som kom inn i svulster etter behandling, som et estimat av tumorstørrelse. Før behandling var gjennomsnittlig tumorgråtoneintensitet mellom kontroll- og behandlede grupper lik. I gjennomsnitt økte denne gråskalaintensiteten i kontrollgruppen til en større størrelse enn i behandlede grupper, selv om denne ikke var signifikant (p = 0,47). Disse dataene fremgår av tabell 2. Den høye variabiliteten av disse resultatene skyldes potensielt at MRI ble tatt bare 24 timer etter behandling, da det terapeutiske potensialet for SDT bare begynner å forekomme. Likevel viser figur 6 et eksempel på lesjonene skapt av SDT.
Figur 1: Oppsett av FUS-system. (Øverst) MRgFUS System med merkede komponenter. (Foran) 1. Plattform. 2. Akse motorisert svinger arm. 3. FUS svinger. 4. Vannbad. 5. MR-seng. 6. Skjerm. 7. Samsvarende boks for svingerimpedans. 8. Strømforsterkerboks. 9. Funksjon generator. 10. Funksjon generator kanal 1 BNC port. 11. Stasjonær datamaskin. (Nederst) MRgFUS-system med fargekodede ledninger skjematisk med følgende tilkoblinger. (Tilbake) 1. Strømledninger. 2. Overvåk HDMI til skrivebordet HDMI. 3. Port B USB B til stasjonær USB A. 4. Oscilloskop LAN ethernet til stasjonær Ethernet. 5. Bevegelsesgrensesnitt ethernet til skrivebordet ethernet. 6. Oscilloskop aux inn / ut BNC til AWG inngang BNC. 7. Oscilloskop kanal 1 (Front) BNC til SYNC BNC. 8. Matchende boksutgang BNC til RF-inngangskoaksial. 9. RF-utgang koaksial til matchende bokskoaksial. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fantomregistrering. (A) Systemoppsett og programvare under fantomregistrering. (B) Skjermbilde av skjermbildet for fantomregistrering, der den røde sirkelen er den valgte omkretsen av det aksiale tverrsnittet. (C) Fantomet plassert på MR-sengen, sett ovenfra. (D) Sidebilde av fantomet, der den røde linjen er i aksialstykket som tilsvarer sirkelen i C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dyreplassering. (A) MR-seng og vugge, med ulike deler merket: 1. MR-vugge. 2. Stereotaktisk MR-seng. 3. Ørestenger. 4. Bite bar. 5. Nesekjegle. 6. MR seng pinne hull. 7. Isofluran anestesi rør. (B) Illustrasjon som representerer plasseringen av musen på MR-sengen og plassering på holderen, med RF-spolen (oransje) (illustrasjon modifisert med Biorender 2022-malen). (C) Illustrasjon som representerer plasseringen av musen på MR-sengen under en FUS-behandling (illustrasjon modifisert med Biorender 2022-mal). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Valg av knutepunkt. Eksempel på et sonikeringspunktvalg i et enkelt dyr. Hver søyle representerer et T1-vektet MR-stykke etter kontrast der hvert stykke er 0,5 mm i proksimal (skive 1) til distal (skive 5) retning. Tumorgrensen ble manuelt segmentert og er skissert i rødt (rad 1), og de tilsvarende sonikeringsstedene (rad 2) er representert av en lysegrønn firkant (fokal maks senter) og blå sirkel (halv maks fokalomkrets). Hvert sted ble sonikert i 2 min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Vekstrate etter SDT. Veksthastigheten til GBM-svulster fra pre- til 24 timer etter SDT-behandling hos behandlede og ubehandlede (kontroll) dyr med intrakranielle M59-svulster basert på målt luminescens. Feilfelt angir standardavvik. En T-test med to utvalg ble utført for å bestemme signifikans. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: SDT-generert lesjon. Pre- og post-kontrast forsterke T1-vektede MR-skanninger fra en dyremodell med et representativt aksialt stykke som viser en lesjon i svulsten skapt av SDT. (Venstre) MR-skanning tatt før SDT-behandling, med svulsten skissert i rødt. (Midten) FUS brennpunktvalg der maksimumstrykket er representert av lyseblå sirkler og halvmaksimumstrykkområdene er representert av blå sirkler. (Høyre) Post-SDT MR-skanning, hvor svulsten er skissert i rødt. SDT-skapte lesjoner og sprøytehullet for implantasjon er vist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Sekvens | T1 |
| Repetisjonstid | 3000 ms |
| Ekko tid | 30 ms |
| Stykketykkelse | 0,5 mm |
| Antall stykker | 25 |
| Pikselavstand | 0,187 mm x 0,187 mm |
| Oppkjøp matrise | 133 x 133 |
| Gjennomsnitt | 4 |
Tabell 1: MR-innstillinger.
| Kontroll | SDT-gruppen | P-verdi | |
| Forbehandling | 7,49 x 10 3 ± 2,2 x 103 | 7,48 x 10 3 ± 1 x 103 | 0.99 |
| Etterbehandling | 8,79 x 103 ± 7,7 x 102 | 7,95 x 10 3 ± 1,1 x 103 | 0.33 |
| Prosent forskjell | 16% ± 16% | 7% ± 12% | 0.47 |
Tabell 2: Forsterket T1-vektet MR-gråtoner etter kontrast.
Discussion
Nye terapeutiske og effektive behandlingsalternativer er nødvendige for pasienter med GBM. Denne protokollen har skissert en preklinisk FUS-mediert behandling for GBM som for tiden gjennomgår omfattende undersøkelser for klinisk oversettelse. Selv om SDT har spennende potensial, er det fortsatt mye å forstå og optimalisere i den prekliniske settingen.
En av de viktigste komponentene i denne protokollen er å bruke MR-veiledet FUS for å målrette svulsten for maksimal effekt. Ved hjelp av et fantomrom kan et 3D-koordinatområde opprettes, der hver piksel med aksiale MR-stykker kan tilordnes en koordinat. Deretter informerer en enkel prosedyre for å velge sonikeringsstedet på MR-bildet transduseren hvor den skal sikte. Det prekliniske FUS-systemet som brukes er svært allsidig og anvendelig når det er behov for å målrette steder av spesifikk patologi som en svulst, inkludert dypere sittende svulster som ville være vanskelig å målrette uten bildebekreftelse. Ved å bruke gadolinium som kontrastmiddel, er det klar visualisering av svulsten, slik at brukeren kan ta informerte beslutninger når han velger mål. Fordelen som SDT har over mange andre behandlinger er at det er en tumorspesifikk terapi. Lavintensitets FUS bør bare målrette tumorvevet, mens det sunne hjerneparenkymet forblir relativt uberørt 3,8.
Resultatene av dette eksperimentet fremhever hvordan fordelene med denne protokollen kan føre til terapeutiske resultater som ligner på andre funn i litteraturen for SDT. Figur 5 viser at innen så lite som 24 timer etter behandlingsdagen var det en nedgang i tumorveksten i den behandlede kohorten. Selv om det er ubetydelig ved bruk av denne lille prøvestørrelsen, kan signifikans resultere med et større antall dyr. Denne forsinkelsen i tumorvekst ligner det som ble vist i det banebrytende papiret om dette emnet av Wu et al. (2019), som viste redusert tumorvekst over tid hos behandlede dyr, samt økte overlevelsestider9.
Overveielser som ble gjort ved utformingen av denne protokollen inkluderte dyrestamme, tumortype og sonosensibiliserende middelvalg. Athymiske nakne mus ble valgt for denne protokollen av flere grunner. For det første er den nakne musen lettere å sonikere ettersom mangel på hår forhindrer demping. Mangelen på et immunsystem tillater også implantasjon av pasientavledede xenotransplantater (PDX) slik at tumormodellen ligner mer på den kliniske situasjonen. Ulempen med å bruke en atlymisk modell er at immunforsvaret ikke kan karakteriseres, så noen SDT-generert immunrespons vil ikke bli målt i disse studiene10. Den valgte svulstlinjen er en aggressiv og raskt voksende PDX-linje. Behandlingstiden er svært viktig fordi etableringen av svulsten må verifiseres, men tumorbyrden bør ikke fylle kranialhalvkule. Ulike cellelinjer krever forskjellige inkubasjonstider for å oppnå en optimal størrelse tumor for preklinisk eksperimentering. I denne protokollen ble 5-ALA brukt som sonosensibilisator på grunn av dets foretrukne opptak i GBM-svulster, som har blitt bekreftet in vitro for denne cellelinjen i tidligere eksperimenter (upubliserte data). Andre sonosensibilisatorer kan erstattes og testes for å bestemme forbindelsen som er mest egnet for effekt og sikkerhet. Til slutt ble behandlingen påbegynt 3 timer etter 5-ALA-injeksjon, da tidligere litteratur har vist at dette er det optimale tidspunktet med den injeksjonsdosen5.
FUS-parametrene som ble valgt i denne protokollen (10 W/cm 2 i2 minutter ved 515 kHz på hvert målsted) ble bestemt basert på en gjennomgang av tidligere litteratur og innledende eksperimenter 4,9. Et rutenett av sonikeringspunkter som dekker hele svulsten ble valgt for å generere ROS-effekten gjennom hele svulsten. Intensiteten som brukes her er høyere enn i andre publikasjoner, men på kort tid forventes dette ikke å føre til noen uheldige temperaturrelaterte effekter, da intensiteter opp til 25 W/cm2 har blitt brukt med hell i en musemodell uten signifikante bivirkninger11. Det er viktig at det ikke er publisert noe standardisert eller optimalisert sett med FUS-parametere i litteraturen. Derfor kan de spesifikke verdiene som er rapportert her, justeres for å bestemme det optimale settet av parametere, noe som fører til maksimal reduksjon av tumorvev samtidig som sikkerheten opprettholdes. I tillegg, da forskjellige cellelinjer har varierende nivåer av vaskularisering og hypoksi, kan det hende at denne behandlingen må justeres. Vi har vist generell redusert tumorvekst (figur 5) innen 24 timer etter SDT-behandling, selv om parametrene må optimaliseres og flere dyr må testes for å bestemme maksimal effekt av denne behandlingen. MR-undersøkelse etter behandling viser ingen lesjoner skapt ved FUS-behandling i friskt vev, med lokalisert til tumorvev (figur 6). Det er også mulighet til å kombinere SDT med andre FUS-teknikker, for eksempel forbigående permeabilisering av blod-hjernebarrieren, for å maksimere 5-ALA-opptak i svulsten12. Denne protokollen kan suppleres ytterligere ved å utføre ulike histologiteknikker for å kontrollere sikkerhet og effekt på strukturnivå. En hematoksylin og eosin (H &E) flekk kan utføres for å sjekke for strukturell eller tumorskade13, mens en terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) flekk kan utføres for å sjekke for cellulær apoptose14. Uansett presenterer denne protokollen en sikker og tumorspesifikk behandling der endringer er merkbare selv 24 timer etter behandling, noe som fremgår ved å sammenligne veksthastigheten til svulster behandlet med SDT og ubehandlede svulster, samt sammenligne tumorskiver før og etter sonikering.
Med hvilken som helst protokoll er det alltid ulemper eller begrensninger som må veies. Hovedbegrensningen i gjeldende protokoll er tid og utgifter. I mellomtiden er en av fordelene med denne protokollen dens automatiserte fokuserte mål. For å oppnå denne fokuserte prosedyren, må MR-skanninger tas for hvert enkelt dyr for å sikre at målrettingen av svulsten er riktig, en prosess som kan være både tidkrevende og kostbar. I tillegg, avhengig av antall fokuspunkter ønsket, kan tiden for å utføre denne protokollen være timer for selv bare noen få dyr, noe som resulterer i lave eksperimentelle dyretall. Til tross for disse ulempene, er denne målrettede ikke-invasive protokollen fortsatt en mulig preferanse sammenlignet med åpne kirurgiske alternativer.
Avslutningsvis viste denne protokollen evnen til SDT-behandling for å redusere tumorvekst i hjernen innen 24 timer etter behandling samtidig som det opprettholdt sunt nevralt vev i en preklinisk musemodell. Studier av effektiviteten av SDT og optimalisering av de ulike parametrene for å øke ROS-produksjonen er nødvendig for å gjøre denne behandlingen klinisk egnet. Nye veier bør utforskes for bruk av SDT som en ikke-invasiv terapeutisk modell.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt. Amir Manbachi underviser og konsulterer for BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical, og er oppfinner på en rekke patentsøkte FUS-teknologier. Betty Tyler har forskningsfinansiering fra NIH og er medeier i Accelerating Combination Therapies*. Ashvattha Therapeutics Inc. har også lisensiert en av hennes patenter, og hun er aksjonær for Peabody Pharmaceuticals (* inkluderer egenkapital eller opsjoner).
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner finansieringsstøtte fra National Science Foundation (NSF) STTR Phase 1 Award (#: 1938939), av ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Award (#: N660012024075), og Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR) Clinical Research Scholars Program (KL2), administrert av National Institutes of Health (NIH) National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). Cellene ble kjøpt fra og levert av Mayo Foundation for Medical Education and Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
- Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (4), 299-312 (2020).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- McHale, A. P., Callan, J. F., Nomikou, N., Fowley, C., Callan, B. Sonodynamic therapy: concept, mechanism and application to cancer treatment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 880, 429-450 (2016).
- Ohmura, T., et al. Sonodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid and focused ultrasound for deep-seated intracranial glioma in rat. Anticancer Research. 31 (7), 2527-2533 (2011).
- Shono, K., et al. Elevated cellular PpIX potentiates sonodynamic therapy in a mouse glioma stem cell-bearing glioma model by downregulating the Akt/NF-κB/MDR1 pathway. Scientific Reports. 11 (1), 15105 (2021).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Borah, B. M., et al. Sonodynamic therapy in combination with photodynamic therapy shows enhanced long-term cure of brain tumor. Scientific Reports. 10 (1), 21791 (2020).
- Wu, S. -K., Santos, M. A., Marcus, S. L., Hynynen, K. MR-guided focused ultrasound facilitates sonodynamic therapy with 5-Aminolevulinic acid in a rat glioma model. Scientific Reports. 9 (1), 10465 (2019).
- Zhang, Q., et al. Sonodynamic therapy-assisted immunotherapy: A novel modality for cancer treatment. Cancer Science. 109 (5), 1330-1345 (2018).
- Nonaka, M., et al. Sonodynamic therapy consisting of focused ultrasound and a photosensitizer causes a selective antitumor effect in a rat intracranial glioma model. Anticancer Research. 29 (3), 943-950 (2009).
- Pi, Z., et al. Sonodynamic therapy on intracranial glioblastoma xenografts using sinoporphyrin sodium delivered by ultrasound with microbubbles. Annals of Biomedical Engineering. 47 (2), 549-562 (2019).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 1: Data acquisition, anatomical feature segmentation, tracking global volume and density changes. Journal of Neuroscience Methods. 364, 109354 (2021).
- Chimata, A. V., Deshpande, P., Mehta, A. S., Singh, A. Protocol to study cell death using TUNEL assay in Drosophila imaginal discs. STAR Protocols. 3 (1), 101140 (2022).
