Summary
Burada, manyetik rezonans kılavuzluğunda odaklanmış ultrason kullanılarak bir in vivo fare glioblastoma modelinde sonodinamik tedavinin nasıl gerçekleştirileceğini ayrıntılarıyla anlatan bir protokolü açıklıyoruz.
Abstract
Sonodinamik tedavi (SDT), sonikasyon sırasında artan hassasiyet için tümörleri hazırlamak için bir sonosensitize edici ajan sağlayan odaklanmış ultrason (FUS) uygulamasıdır. Ne yazık ki, glioblastoma (GBM) için mevcut klinik tedaviler eksiktir ve bu da hastalar arasında düşük uzun süreli sağkalım oranlarına yol açmaktadır. SDT, GBM'yi etkili, invaziv olmayan ve tümöre özgü bir şekilde tedavi etmek için umut verici bir yöntemdir. Sonosensitizatörler, çevredeki beyin parankimine kıyasla tercihen tümör hücrelerine girerler. Bir sonosensitize edici ajanın varlığında FUS uygulaması, apoptozla sonuçlanan reaktif oksidatif türler üretir. Bu tedavinin daha önce klinik öncesi çalışmalarda etkili olduğu gösterilmiş olsa da, belirlenmiş standart parametrelerin eksikliği vardır. Bu terapötik stratejiyi klinik öncesi ve klinik kullanım için optimize etmek için standartlaştırılmış yöntemler gereklidir. Bu yazıda, manyetik rezonans kılavuzluğunda FUS (MRgFUS) kullanarak klinik öncesi bir GBM kemirgen modelinde SDT gerçekleştirme protokolünü detaylandırıyoruz. MRgFUS, invaziv ameliyatlara (örneğin kraniotomi) gerek kalmadan bir beyin tümörünün spesifik olarak hedeflenmesine izin verdiği için bu protokolün önemli bir özelliğidir. Burada kullanılan tezgah üstü cihaz, bir MRI görüntüsündeki bir hedefe tıklayarak üç boyutlu olarak belirli bir konuma odaklanabilir ve bu da hedef seçimini basit bir süreç haline getirir. Bu protokol, araştırmacılara MRgFUS SDT için standartlaştırılmış bir klinik öncesi yöntem sağlayacak ve translasyonel araştırma için parametreleri değiştirme ve optimize etme esnekliği sağlayacaktır.
Introduction
Glioblastoma (GBM), 100.000 kişide 3.21 insidansı olan ve en sık görülen kötü huylu beyin tümörü olan oldukça agresif bir beyin kanseri türüdür1. Mevcut bakım standardı cerrahi rezeksiyon, radyasyon ve kemoterapiyi içerir2. Tümörün invaziv ve infiltratif doğası nedeniyle, tam tümör rezeksiyonu nadirdir. Tümör sınırlarında rezidüel doku, yüksek oranda tümör nüksü ve 5 yıl sonra %6'dan az düşük sağkalım oranı ile sonuçlanır1.
Bu prognoz nedeniyle, araştırmacılar bu ölümcül hastalıkla mücadele etmek için yeni terapötik seçenekleri araştırıyorlar. Sonodinamik tedavi (SDT), hedeflenen hücrelerde sitotoksik bir etki oluşturmak için düşük yoğunluklu odaklanmış ultrason (FUS) ve sonosensitize edici ajanları birleştiren noninvaziv bir tedavidir3. Örnek olarak, 5-aminolevulinik asit (5-ALA) gibi porfirin bazlı sonosensitizörler tercihen tümör hücreleri tarafından alınır ve odaklanmış ultrasona maruz kaldıklarında reaktif oksidatif türlerin (ROS) üretimini zarar verici seviyelere çıkarır. Hücrelerde aşırı eksprese edilen ROS seviyeleri, hücresel yapılara zarar verebilir ve apoptozu tetikleyebilir. 5-ALA tercihen tümör hücreleri tarafından alındığından, tedavi bölgesindeki sağlıklı doku zarar görmez 3,4. Ön in vitro çalışmalar, birçok kanser hücresinin SDT tedavisi ile parçalandığını, ancak hücre ölüm oranının hücre hattına bağlı olduğunu ortaya koymuştur. Ön in vivo çalışmalar, SDT'nin apoptozu tetikleyebileceğini doğrulayan benzer sonuçlar vermektedir5.
Bu protokol, bir tezgah üstü FUS araştırma platformu kullanarak intrakraniyal olarak implante edilmiş GBM hücreleri ile kemirgen modellerinin SDT tedavisi için etkili teknikleri ve parametreleri tanımlamayı amaçlamaktadır. Araştırmacılar, translasyonel FUS araştırması için SDT'yi gerçekleştirmek ve optimize etmek için bu protokolü kullanabilir.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları, Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak onaylanmış ve yürütülmüştür. Atimik çıplak dişi fareler (yaş: 10 hafta) ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bkz. Maske, eldiven ve önlük kullanımı da dahil olmak üzere tüm Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) düzenlemelerine uyulmuştur.
1. Tümör implantasyonları ve biyolüminesans görüntüleme
- Çalışmanın ilk aşamasında, daha önce yayınlanmış bir raporu takiben intrakraniyal tümör implantasyonu gerçekleştirin6.
NOT: Bu çalışmada, kafatasına 3.0 mm derinlikte implantasyon için 4 μL hücre süspansiyonunda 100.000 M59 insan GBM ksenogreft hücresi kullanıldı. - Tedaviden önce, daha önce yayınlanmış bir raporutakiben bir in vivo lüminesans görüntüleme sistemi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak her faredeki tümör boyutunu noninvaziv olarak ölçün 7.
NOT: Bu, ilk tümör implantasyonlarından 7 gün sonra, tedavi tarihinde yapıldı. - Görüntüleme nicelleştirmesini kullanarak, fareleri tedavi için karşılaştırılabilir alt gruplara ayırın.
NOT: Bu çalışmaya iki alt grup dahil edildi: (1) tedavi edilmemiş tümör taşıyan fareler (n = 4) ve (2) SDT uygulanan tümör taşıyan fareler (n = 4). İki grup arasında tedavi öncesi tümör boyutu açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmedi (p > 0.05).
2. Tedavi günü kurulumu
- 5-ALA hidroklorürü ( Malzeme Tablosuna bakın) dondurucudan çıkarın ve 200 mg/kg fare ağırlığı 5-ALA tartın (örneğin, 25 g'lık bir fare için 5 mg ağırlığında). Bunu yalnızca ortam ışığı altında yapın.
NOT: Kullanmadan önce tüm ekipmanı sterilize edin. - Toplam 5-ALA miktarını fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün, böylece her hayvana doğru ağırlık dozajı ile 60 mg / mL 5-ALA çözeltisi uygulanır (ör., 25 g'lık bir fare için 5 mg 5-ALA'yı 83.33 μL PBS'ye çözün).
- SDT test grubundaki her hayvan için, uygun miktarda 5-ALA çözeltisini intraperitoneal olarak hayvana enjekte edin (adım 2.1 ve 2.2'de hesaplanmıştır).
- 5-ALA'yı metabolize etmek için hayvanları 3 saat kafeslerinde bırakın.
3. Deneyler için gerekli şartların hazırlanması
- Bir rezervuarı deiyonize (DI) suyla doldurun.
NOT: İhtiyaç duyulan su miktarı, çalışmada kullanılan fare sayısına bağlıdır. - Akış giriş ve Çıkış tüplerini ultrasonik gaz gidericiye takın (Malzeme Tablosuna bakın) ve gaz gidericiyi güce takın (1 = AÇIK, 0 = KAPALI).
- Akış giriş ve çıkış borularının diğer ucunu DI su haznesine yerleştirin.
- Gaz gidericiyi açın ve 45 dakika çalıştırın.
- Yeni gazı alınmış suyu, çalışma sırasında kullanılmak üzere hava geçirmez, sızdırmaz bir kabın üstüne doldurun.
- Ultrason jelini (Malzeme Tablosuna bakınız) konik bir tüpe dökün ve ardından bir santrifüje koyun ve jeldeki havayı çıkarmak için 5 dakika boyunca 160 x g'da döndürün.
NOT: Her hayvanın kafasında bir parça jel oluşturmak için yeterli jel gereklidir.
4. MRgFUS sistem kurulumu
- Şekil 1'de (alt panel) görüldüğü gibi bağlantı şemasını kullanarak MRgFUS sistemini (Malzeme Tablosuna bakın) bağlayın.
- Gerekli tüm bileşenleri (masaüstü bilgisayar, monitör, MRgFUS platformu, osiloskop, amplifikatör) güce bağlayın.
- Tüm kabloları doğru konumlara bağlayın.
- İstenen dönüştürücüyü BNC ve koaksiyel kablolar aracılığıyla MRgFUS platformuna bağlayın ve ardından ilgili empedans eşleştirme kutusunu doğru kablolara bağlayın.
NOT: Bu çalışma için 515 kHz dönüştürücü kullanılmıştır.
- Tüm cihazları açın.
- Masaüstü bilgisayar işletim sisteminde, FUS sistem yazılımına zaten entegre edilmiş olan AUREUS uygulamasını açın.
- Donanımı sisteme bağlamak için Tüm Donanımı Bağla'yı seçin ve bileşenlerin yazılımla iletişim kurduğundan emin olun.
- Açılır menüyü seçerek ve istediğiniz dönüştürücüyü seçerek kullanılan dönüştürücüyü seçin.
5. Başlatma
- Alt vidayı fantomdan sökün ve boşluğu taşana kadar deiyonize ve gazı alınmış suyla doldurun ve ardından vidayı tekrar değiştirin.
- Fantomu karşılık gelen MRI yatağı konumuna yerleştirin (bkz. Şekil 2) ve ardından MRI yatağını ilgili yuvasındaki MRI yuvasına yerleştirin.
- MRI yuvasını MRI tarayıcısında ilgili konumuna yerleştirin (bkz. Fantomun yüksek kaliteli bir görüntüsünü elde etmek için kızağı, fantom MRI yatağı herhangi bir engel olmadan MRI deliğine kayabilecek şekilde ayarlayın. Gelecekte kolayca yinelenebilmesi için bu konumu işaretleyin.
NOT: Bu konum bulunduktan sonra, tedavinin geri kalanı için konum değiştirilmeyecektir. Bu nedenle, hayvan MRI yerleşimi için yeterli bir yer olduğundan emin olun, aksi takdirde tüm kaydın tekrarlanması gerekecektir. - Tablo 1'deki ayarları kullanarak fantomun MRI taramasını yapın.
- Kızağı mıknatıs deliğinden çıkarın, ancak tarayıcıda tutun. Fantomu içeren MRI yatağını yuvadan çıkarın ve ardından alttaki mandalı doğru yuvasına kaydırarak fantomlu yatağı MRgFUS sistemine yerleştirin.
- Kayıt ucunu, fantoma doğru aşağı bakacak şekilde dönüştürücü kolundaki manyetik yuvalara yerleştirin (bkz. Şekil 2).
- Yazılımda, Yeni Bir Ev Konumu Seç'i seçin ve ardından kılavuzlu odaklı bulmaya başlamak için Jog Modu Açık'ı seçin. Jog modu değiştirildikten sonra, dönüştürücü kolunu sırasıyla sol, sağ, ileri, geri, yukarı ve aşağı yönlerde manuel olarak hareket ettirmek için sol, sağ, yukarı, aşağı, sayfa yukarı ve sayfa aşağı tuşlarını kullanın.
- İşaretçinin ucu, hayaletin üstünde yer alan çarpı deseninin ortasına değene kadar işaretçiyi üç boyutta da manuel olarak ayarlayın (bkz. Şekil 2).
- Fantom MRI görüntülerini bilgisayara indirin ve seçilen dizindeki bir klasöre yerleştirin ve ardından Fantom Görüntüleri Yükle'yi seçerek MRI görüntülerini yazılıma yükleyin. Eksenel fantom dilimleri daha sonra ekranı sağ tarafta dolduracaktır. Fare kaydırma çubuğunu kullanarak bu dilimler arasında gezinin. Görüntüyü tıklayıp basılı tutarak ve ardından fareyi yukarı veya aşağı hareket ettirerek parlaklığı ayarlayın.
NOT: Klasördeki dosyalardan herhangi biri sıkıştırılmamış DICOM dosyaları değilse, yazılım bunları okuyamaz ve içe aktaramaz, bu nedenle bu klasördeki diğer dosyaları kaldırın. - Her birinde üç karanlık delik bulunan net bir dairenin bulunduğu herhangi bir hayalet görüntüsüne gidin. Hayaletin ortasına tıklayın, kırmızı bir daire açılacaktır. Daireyi tıklayın ve aynı çapa gelene ve hayaletin çevresiyle aynı hizaya gelene kadar sürükleyin (bkz. Şekil 2).
- Bu konumun koordinatları 'ana konum' olarak adlandırılır; Sol/Sağ, A/P ve S/I Ayarla'ya tıklayarak bunu kaydedin.
- Jog Mode Off (Jog Modu Kapalı) öğesine tıklayın, kayıt ucunu dönüştürücü kolundan çıkarın ve ardından Exit Focus Finding'i (Odak Bulmadan Çık) seçin. Başlatma sırasını tamamlamak için başlangıç konumunu onaylayın.
6. SDT için hayvan hazırlığı
- Bir indüksiyon odasında bir izofluran-O2 gaz karışımı kullanarak fareyi uyuşturun. Anestezi indüksiyonu için gaz akış hızını 1.0 mL/dk'ya ve buharlaştırıcıyı %2.0'a ayarlayın, tipik olarak haznede 3-5 dakika gerekir (bkz.
- Ayak parmağını sıkıştırarak hayvanı yeterli sedasyon açısından değerlendirin. Korneaların kurumasını önlemek için gözlere oftalmik bir merhem sürün.
NOT: İşlem boyunca anestezi derinliğini izleyin. - Fareye kuyruk damarından 40 μL gadolinyum kontrast madde enjekte edin (bkz.
- Tüy dökücü krem ve elektronik tıraş makinesi kullanarak kafatasının üzerindeki kafa derisini tıkayan tüyleri alın.
- Aşağıdaki adımları kullanarak hayvanı MRI yatağına sabitleyin (bkz. Şekil 3).
- MRI yatağının giriş tüpünü (Şekil 3A) anestezi için bir izofluran kaynağına bağlayın ve anestezi indüksiyonu için gaz akış hızını 1.0 mL/dk'ya ve buharlaştırıcıyı %2.0'a ayarlayın. Anestezi emilimi için çıkış tüpünü bir kömür filtresi kabına bağlayın.
- Burun konisi parçasını Şekil 3B'de gösterildiği gibi yuvasına yerleştirin. Isırma çubuğunu, ısırma koruyucusu MRI yatağındaki açık kuyunun üzerinde gezinirken, gösterildiği gibi hem burun konisindeki hem de yatağın ucundaki ısırma çubuğu deliklerinden kaydırın.
- Hayvanı, kulakları stereotaktik kulak çubuğu delikleriyle aynı hizada olacak şekilde MRI yatağına yerleştirin ve yerinde tutmak için dişlerini ısırma koruyucusundan geçirin. Sabit bir anestezi akışı sağlamak için burun konisini hayvanın burnunun üstünde olacak şekilde öne doğru kaydırın.
- Kulak çubuklarını MRI yatağının her iki yanındaki deliklerden kaydırın ve her iki kulak çubuğu da farenin kulak kanallarına sığana kadar hayvanın kafasını kaldırın.
NOT: Hayvanın kulak zarlarına zarar verebileceğinden çok fazla itmeyin. - Hayvanın rahat bir pozisyonda olduğundan emin olun. Ardından, düz uçlu bir tornavida kullanarak, her iki kulak çubuğunu, burun konisini ve ısırma çubuğunu kilitlemek için MRI uyumlu vidaları vidalayın. Bu, hayvanı yerine kilitleyecek ve hayvan yataktan çıkarılana kadar herhangi bir baş hareketini önleyecektir.
NOT: Bu adımdan sonra hayvanın MRI yatağındaki pozisyonunda herhangi bir rahatsızlık olmadığından emin olun. Hayvan hareket ederse, protokolün ne kadar uzakta olduğuna bakılmaksızın tüm kurulumun (adım 6.5) tekrarlanması gerekecektir. - Hayvan beklerken, vücut ısısını korumak için MRI yatağını ılık bir ısı yastığına yerleştirin.
NOT: İşlem boyunca vücut ısısını izleyin ve koruyun.
- İzofluran, hayvan yatağı FUS sistemine sabitlendiğinde, platformda sağlanan fikstürler kullanılarak tedavi boyunca burun konilerine takılan tüpler aracılığıyla hayvana sürekli olarak verilir.
7. MRG prosedürleri
- Hayvan stereotaktik olarak sabitlenmiş olarak MRI yatağını alın ve Şekil 3'te gösterildiği gibi, MRI yatağı deliğini ucundaki MRI kızağındaki çiviye yerleştirerek, daha önce MRI tarayıcısına bağlı olan MRI beşiğine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). Giriş ve çıkış anestezi tüplerini MRI makinesindeki ilgili tüplere takın.
- Hayvanı içeren MRI beşiğini MRI deliğine kaydırın ve hayaletin yerleştirildiği yerle aynı konumu koruduğunuzdan emin olun.
- Hayvan beyninin yerini görmek için bir lokalizatör ve ardından Tablo 2'deki MRI ayarlarını kullanarak tüm beyni kapsayan kontrast sonrası T1 ağırlıklı bir MRI taraması yapın.
- MRI taramasını, her dilim için bir tane olmak üzere sıkıştırılmamış DICOM dosyaları kümesi olarak dışa aktarın.
8. Fokuslu ultrason tedavisi (Şekil 4)
- Taramayı tamamladıktan sonra hayvanı MRI beşiğinden çıkarın ve yatağın önünü platformun arkasındaki karşılık gelen mandalına yerleştirerek ve yatağın arkasını karşılık gelen mandalına yerleştirerek platforma yerleştirin.
- MRI yatağının giriş tüpünü anestezi için bir izofluran kaynağına bağlayın ve anestezinin sürdürülmesi için gaz akış hızını 1.0 mL/dk'ya ve buharlaştırıcıyı %2.0'a ayarlayın. Anestezi emilimi için çıkış tüpünü bir kömür filtresi kabına bağlayın.
- DICOM dosyaları kümesini bilgisayara aktarın ve geçerli etüdün ana çalışma dizinindeki bir klasöre yerleştirin.
NOT: Dosya gereksinimleri için adım 5.9'a bakın. - Yazılımda, ana başlatma sayfasına gidin ve Kılavuzlu Odak Bulma'ya tıklayarak Jog Modu'nu açın ve ardından Jog Modu Açık'a tıklayın.
- Kafatasının üzerindeki tüm kafa derisini kaplayacak kadar jel ile hayvanın kafasına bir miktar santrifüjlenmiş ultrason jeli yerleştirin.
- DI ve gazı alınmış suyu su banyosuna %80'e kadar dökün ve ardından su banyosunu platformdaki ilgili sütunlarına yerleştirin.
- DI suyla dolu su banyosunu, alt zar hayvanın kafasındaki ultrason jeline temas edene kadar indirin ve su ile jel arasında bir bağlantı yüzeyi oluşturun. Ultrason jelinin hayvanın tüm kafasını su banyosuna kadar kapladığından ve ultrason jelinde su banyosu ile farenin kafa derisi arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- Ultrason dönüştürücüsünü su banyosuna daldırın ve dönüştürücü yüzeyinde hava kabarcığı oluşmadığından emin olun.
- Jog Mode Down'ı kullanarak dönüştürücü kolunu kısmen suya batırılmış dönüştürücüye doğru indirin ve dönüştürücü yüzeyi su altında kalırken manyetik yuvaları birbiriyle hizalayarak dönüştürücüye bağlayın.
- Jog Modu'nu kapatın ve ardından başlatma adımında yapıldığı gibi Odaklanmış Bulmadan Çık'ı kapatın. Daha önce yapıldığı gibi ana konumu onayladığınızdan emin olun.
- Tedavi sekmesine gidin ve ardından ekranın üst ortasındaki klasör simgesine tıklayarak kontrast sonrası T1 ağırlıklı MRI dosyalarını yükleyin. Daha önce bilgisayara yüklenen DICOM dosyalarını içeren klasörü seçin ve açın. Bu adım, sağ üst paneldeki tüm DICOM dosyalarını otomatik olarak yüklemelidir.
- Ardından, Sonication Mode sekmesinde, Burst veya Continuous Wave'i seçerek uygun tedavi modunu seçin. Seri çekim modundaysanız, Sonication Ayarları sekmesinde, seri çekim uzunluğunu, seri çekim süresini ve periyot sayısını girin. Bu parametreler her sonikasyon konumuna karşılık gelecektir. Sürekli dalga modundaysa, yalnızca sonikasyon süresini girin.
NOT: Bu çalışmada 120 sn süre boyunca sürekli dalga modu kullanılmıştır. - Sayfanın üst ortasındaki hedef simgesine tıklayın ve FUS odak bölgesinin hedefleneceği doğru MRI diliminde uygun yerleri seçin. Tıklandığı yerde kırmızı daire ile açık kırmızı bir kare bulunacaktır. Birden fazla seçim yapılabilir.
- MRI görüntüsünün solunda, seçilen odak bölgelerinin 3D koordinatlarıyla doldurulacak bir tablo bulunur. Tablonun son sütununda, istenen basınç veya yoğunluk seviyelerini elde etmek için kullanılan her dönüştürücü için ayrı ayrı hesaplanabilen, her odak noktasında sonikleştirilecek güç seviyesini girin. Onaylamak için tablodaki her bir odak noktasına tıklayın, bu koordinatların vurgulanmasına neden olur ve görüntüdeki ilgili odak bölgesi maviye döner.
NOT: Tabloya girilen güç seviyesinin basınca veya yoğunluğa nasıl çevrileceğini belirlemek için dönüştürücü veri sayfasına bakın, çünkü bu değerler dönüştürücüye özgüdür. - Tüm odak bölgelerinden memnun kaldığınızda, Hareket Testi'ni seçin. Bu, yazılımdan, hareketlerin mümkün olduğundan emin olmak için dönüştürücüyü tüm odak noktalarına hareket ettirmesini isteyecektir. Onaylandıktan sonra, yazılım Hareket Testi Tamamlandı gösterecektir. Bir hata oluşursa, odak bölgelerini dönüştürücü motorların 3D eksenlerine sığacak şekilde ayarlayın.
- Hazır olduktan sonra, sonication protokolünü başlatmak, dönüştürücüyü hareket ettirmek ve seçilen her odak bölgesinde doğru FUS parametrelerini uygulamak için Sonication'ı Başlat'ı seçin.
- Sonikasyon protokolü bittiğinde, dönüştürücüyü dönüştürücü kolundan ayırın, su banyosunu platformdan çıkarın ve ultrason jelini hayvanın kafa derisinden silin.
- Isırık ve kulak çubuklarını sökün, hayvanı MRI yatağından çıkarın ve ardından hayvan anesteziden uyanana kadar hayvanı ılık bir ped üzerine koyun. Bu noktada, hayvanı kafesine geri koyun.
- Sonraki hayvanlar için, bölüm 6'dan başlayarak aynı protokolü tekrarlayın.
- İstenilen hayvanlar tedavi edildikten sonra, hayvanların dokunduğu tüm yüzeyleri %70 etanol ile temizleyin (bkz.
- Yazılımdan çıkın ve ardından her bir ekipmanı kapatın ve kapatın.
9. Tedavi sonrası adımlar
- Tedaviden 24 saat sonra biyolüminesans ölçümü için bölüm 1'deki in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) protokolünü tekrarlayın. Tedavi etkinliğini analiz etmek için, hem tedavi edilen hem de tedavi edilmeyen gruplar için büyüme oranını belirlemek için tedaviden önce ve sonra biyolüminesans kayıtlarını karşılaştırın.
- Adım 6.4'teki aynı ayarları kullanarak takip MRI taramaları gerçekleştirin. Kontrastlı taramaları kullanarak, tedavi öncesi ve sonrası tümör hacmindeki farklılıkları belirlemek için tümör bölgesinin ortalama gri tonlama yoğunluğunu karşılaştırın veya kontrast madde tarafından kapsanan toplam hacmi hesaplayın.
Representative Results
SDT ile tedavi edilen hayvanlarda tedaviden 24 saat sonra tümör boyutu azalır.
SDT tedavisinin yapıldığı gün, kontrol ve tedavi grupları için orijinal ortalama biyolüminesans sinyali (her biri N = 4) sırasıyla 2.0 x 10 6 ± 3.1 x 10 6 ve 2.3 x 10 6 ± 1.3 x 10 6 p / s / cm2 / sr idi. İki grup arasında tedavi öncesi tümör boyutuna karşılık gelen ortalama biyolüminesans değerleri istatistiksel olarak anlamlı değildi (p=0.89). SDT'yi takiben tedavi grubunun ortalama biyolüminesans sinyali 3.57 x 10 6 ± 2.3 x 10 624 saat iken, kontrol grubunun biyolüminesan sinyali 5.5 x 10 6 ± 8.2 x 10 6 p/s/cm2/sr'ye yükseltildi. Şekil 5'te gösterildiği gibi, bu, üstel büyüme varsayıldığında sırasıyla %83,4 ± %78 ve %172 ± %34'lük bir büyüme oranına karşılık gelir (p = 0,08). Tedavi edilen dört hayvandan üçü, kontrollere kıyasla tedavi sonrası daha düşük büyüme oranlarına sahipti. Tedavi grubunda, sapmaları çarpıtan kontrollerle karşılaştırılabilir büyüme gösteren bir aykırı değer vardı.
Ek olarak, hayvanlara, tümörün tedavi öncesi ve sonrası karşılaştırması için tedaviden sonraki gün kontrastlı MR görüntüleme uygulandı. Tümörlerdeki kontrast maddenin ortalama gri tonlamalı yoğunluğu, tümör boyutunun bir tahmini olarak, tedaviyi takiben tümörlere ne kadar kontrast maddenin girdiğini ölçmek için her hayvan için her MRI dilimi boyunca gerçekleştirildi. Tedavi öncesi, kontrol ve tedavi edilen gruplar arasındaki ortalama tümör gri tonlama yoğunluğu benzerdi. Ortalama olarak, bu gri tonlama yoğunluğu kontrol grubunda tedavi edilen gruplara göre daha büyük bir büyüklüğe yükselmiştir, ancak bu anlamlı değildi (p = 0.47). Bu veriler Tablo 2'de görülebilir. Bu sonuçların yüksek değişkenliği, potansiyel olarak MRG'lerin tedaviden sadece 24 saat sonra alınmış olmasından kaynaklanmaktadır, bu sırada SDT'nin terapötik potansiyeli daha yeni ortaya çıkmaya başlamaktadır. Buna rağmen, Şekil 6 , SDT tarafından oluşturulan lezyonların bir örneğini göstermektedir.
Şekil 1: FUS sistem kurulumu. (Yukarıya git) Etiketli bileşenlere sahip MRgFUS Sistemi. (Ön) 1. Platform. 2. Eksen motorlu dönüştürücü kolu. 3. FUS dönüştürücü. 4. Su banyosu. 5. MRI yatağı. 6. Monitör. 7. Dönüştürücü empedans eşleştirme kutusu. 8. Güç amplifikatörü kutusu. 9. Fonksiyon üreteci. 10. Fonksiyon üreteci kanalı 1 BNC bağlantı noktası. 11. Masaüstü bilgisayar. (Altta) Aşağıdaki bağlantılara sahip renk kodlu kablolama şemasına sahip MRgFUS sistemi. (Geri) 1. Güç kabloları. 2. HDMI'yı masaüstü HDMI'ya izleyin. 3. Bağlantı Noktası B, USB B'den masaüstü USB A'ya. 4. Osiloskop LAN ethernet'ten masaüstü ethernet'e. 5. Masaüstü ethernet'e hareket arayüzü ethernet. 6. Osiloskop aux giriş / çıkış BNC'den AWG girişine BNC. 7. Osiloskop kanal 1 (Ön) BNC'den BNC'yi SYNC BNC'ye. 8. Eşleşen kutu çıkışı BNC'den RF girişine koaksiyel. 9. RF çıkışı koaksiyel eşleşen kutu koaksiyel. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hayali kayıt. (A) Fantom kayıt sırasında sistem kurulumu ve yazılımı. (B) Kırmızı dairenin eksenel kesitin seçilen çevresi olduğu hayali kayıt ekranının ekran görüntüsü. (C) MRI yatağına yerleştirilen fantom, üstten görünüm. (D) Kırmızı çizginin C'deki daireye karşılık gelen eksenel dilimde olduğu hayaletin yandan görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hayvan yerleşimi. (A) MRG yatağı ve beşiği, çeşitli parçaları etiketli: 1. MRI beşiği. 2. Stereotaktik MRI yatağı. 3. Kulak çubukları. 4. Isırık çubuğu. 5. Burun konisi. 6. MRI yatağı mandal deliği. 7. İzofluran anestezi tüpleri. (B) RF bobini (Turuncu) ile farenin MRI yatağına yerleştirilmesini ve kızağa yerleştirilmesini temsil eden çizim (çizim Biorender 2022 şablonu kullanılarak değiştirilmiştir). (C) Bir FUS tedavisi sırasında farenin MRI yatağına yerleştirilmesini temsil eden çizim (Biorender 2022 şablonu kullanılarak değiştirilen resim). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Odak noktası seçimi. Tek bir hayvanda sonikasyon noktası seçimi örneği. Her sütun, her dilimin proksimal (dilim 1) ila distal (dilim 5) yönünde 0,5 mm olduğu T1 ağırlıklı bir kontrast sonrası MRI dilimini temsil eder. Tümör sınırı manuel olarak bölümlere ayrıldı ve kırmızı (satır 1) ile özetlendi ve karşılık gelen sonikasyon konumları (satır 2) açık yeşil bir kare (odak maksimum merkez) ve mavi daire (yarım maksimum odak çevresi) ile temsil edildi. Her konum 2 dakika boyunca sonikleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: SDT'yi takiben büyüme oranı. Ölçülen lüminesansa dayalı olarak intrakraniyal M59 tümörleri olan tedavi edilmiş ve tedavi edilmemiş (kontrol) hayvanlarda SDT tedavisi öncesi ila 24 saat sonrası GBM tümörlerinin büyüme hızı. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Anlamlılığı belirlemek için iki örneklemli bir öğrenci t-testi uygulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: SDT tarafından oluşturulan lezyon. Kontrast öncesi ve sonrası, SDT tarafından oluşturulan tümörde bir lezyonu gösteren temsili bir eksenel dilim içeren bir hayvan modelinden T1 ağırlıklı MRI taramalarını geliştirir. (Solda) SDT tedavisinden önce çekilen MRI taraması, tümör kırmızı ile özetlenmiştir. (Ortada) Maksimum basıncın açık mavi dairelerle ve yarı maksimum basınç bölgelerinin mavi dairelerle temsil edildiği FUS odak noktası seçimi. (Sağda) Tümörün kırmızı ile özetlendiği SDT sonrası MRI taramaları. SDT ile oluşturulan lezyonlar ve implantasyon için şırınga deliği gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Sıra | T1 |
| Tekrarlama süresi | 3000 ms |
| Yankı süresi | 30 ms |
| Dilim kalınlığı | 0,5 mm |
| Dilim sayısı | 25 |
| Piksel aralığı | 0,187 mm x 0,187 mm |
| Edinme matrisi | 133 × 133 |
| Ortalamalar | 4 |
Tablo 1: MRG ayarları.
| Kontrol | SDT Grubu | P-Değeri | |
| Ön Arıtma | 7,49 x 10 3 ± 2,2 x 103 | 7,48 x 10 3 ± 1 x 103 | 0.99 |
| Tedavi Sonrası | 8,79 x 103 ± 7,7 x 102 | 7,95 x 10 3 ± 1,1 x 103 | 0.33 |
| Yüzde Farkı | %16 ± %16 | %7 ± %12 | 0.47 |
Tablo 2: Kontrast sonrası geliştirilmiş T1 ağırlıklı MRG gri tonlama.
Discussion
GBM'li hastalar için yeni terapötik ve etkili tedavi seçenekleri gereklidir. Bu protokol, şu anda klinik çeviri için kapsamlı araştırmalardan geçmekte olan GBM için klinik öncesi FUS aracılı bir tedavinin ana hatlarını çizmiştir. SDT heyecan verici bir potansiyele sahip olsa da, klinik öncesi ortamda anlaşılması ve optimize edilmesi gereken çok şey var.
Bu protokolün en önemli bileşenlerinden biri, maksimum etkinlik için tümörü hedeflemek için MR kılavuzluğunda FUS kullanmaktır. Bir fantom kullanılarak, eksenel MRI dilimlerinin her pikseline bir koordinat atanabilen bir 3D koordinat alanı oluşturulabilir. Daha sonra, MR görüntüsündeki sonikasyon konumunu seçmenin basit bir prosedürü, dönüştürücünün nereye hedefleneceğini bildirir. Kullanılan klinik öncesi FUS sistemi çok yönlüdür ve görüntüleme onayı olmadan hedeflenmesi zor olan daha derin yerleşimli tümörler de dahil olmak üzere tümör gibi spesifik patolojilerin yerlerini hedeflemeye ihtiyaç duyulduğunda uygulanabilir. Gadolinyumun kontrast madde olarak kullanılması, tümörün net bir şekilde görselleştirilmesi ve kullanıcının hedefleri seçerken bilinçli kararlar vermesine olanak tanır. SDT'nin diğer birçok tedaviye göre avantajı, tümöre özgü bir tedavi olmasıdır. Düşük yoğunluklu FUS sadece tümör dokusunu hedef almalı, sağlıklı beyin parankimini nispeten el değmeden bırakmalıdır 3,8.
Bu deneyin sonuçları, bu protokolün avantajlarının SDT için literatürdeki diğer bulgulara benzer terapötik sonuçlara nasıl yol açabileceğini vurgulamaktadır. Şekil 5 , tedavi gününü takip eden 24 saat gibi kısa bir süre içinde, tedavi edilen kohortta tümör büyümesinde bir yavaşlama olduğunu göstermektedir. Bu küçük örneklem büyüklüğü kullanılarak önemsiz olsa da, anlamlılık daha fazla sayıda hayvanla sonuçlanabilir. Tümör büyümesindeki bu gecikme, Wu ve ark. (2019), tedavi edilen hayvanlarda zaman içinde tümör büyümesinin yavaşladığını ve hayatta kalma sürelerinin arttığını göstermiştir9.
Bu protokol tasarlanırken göz önünde bulundurulması gereken hususlar arasında hayvan suşu, tümör tipi ve sonosensitize edici ajan seçimi yer alıyordu. Bu protokol için birçok nedenden dolayı atimik çıplak fareler seçildi. İlk olarak, çıplak farenin sonikasyonu daha kolaydır, çünkü saç eksikliği herhangi bir zayıflamayı önler. Ayrıca, bir bağışıklık sisteminin olmaması, hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX'ler) implantasyonuna izin verir, böylece tümör modeli klinik duruma daha çok benzer. Atimik bir model kullanmanın dezavantajı, bağışıklık sisteminin karakterize edilememesidir, bu nedenle bu çalışmalarda SDT tarafından üretilen herhangi bir bağışıklık tepkisi ölçülmeyecektir10. Seçilen tümör hattı agresif ve hızlı büyüyen bir PDX hattıdır. Tedavi zamanı çok önemlidir çünkü tümörün oluşumu doğrulanmalıdır, ancak tümör yükü kraniyal hemisferi doldurmamalıdır. Farklı hücre hatları, klinik öncesi deneyler için en uygun boyutta bir tümör elde etmek için farklı inkübasyon süreleri gerektirir. Bu protokolde, önceki deneylerde (yayınlanmamış veriler) bu hücre hattı için in vitro olarak doğrulanan GBM tümörlerinde tercihli alımı nedeniyle sonosensitizer olarak 5-ALA kullanılmıştır. Etkinlik ve güvenlik için en uygun bileşiği belirlemek için diğer sonosensitizörler ikame edilebilir ve test edilebilir. Son olarak, 5-ALA enjeksiyonundan 3 saat sonra tedaviye başlandı, çünkü önceki literatür bunun bu enjeksiyon dozu ile en uygun zamanolduğunu göstermiştir 5.
Bu protokolde seçilen FUS parametrelerine (her hedef konumda 515 kHz'de 2 dakika boyunca 10 W/cm2), önceki literatürün gözden geçirilmesine ve ilk deneylere(4,9) dayalı olarak karar verilmiştir. Tüm tümör boyunca ROS etkisini oluşturmak için tüm tümörü kapsayan bir sonikasyon noktaları ızgarası seçildi. Burada kullanılan yoğunluk diğer yayınlardan daha yüksektir, ancak kısa bir zaman aralığında, 25 W/cm2'ye kadar olan yoğunluklar bir fare modelinde önemli yan etkiler olmaksızın başarıyla kullanıldığından, bunun sıcaklıkla ilgili herhangi bir olumsuz etkiye yol açması beklenmemektedir11. Daha da önemlisi, literatürde standartlaştırılmış veya optimize edilmiş bir FUS parametresi seti yayınlanmamıştır. Bu nedenle, burada rapor edilen spesifik değerler, optimal parametre setini belirlemek için ayarlanabilir, bu da güvenliği korurken tümör dokusunun maksimum azalmasına yol açar. Ek olarak, farklı hücre hatları farklı seviyelerde vaskülarizasyon ve hipoksiye sahip olduğundan, bu tedavinin ayarlanması gerekebilir. SDT tedavisinden sonraki 24 saat içinde genel olarak tümör büyümesinin azaldığını gösterdik (Şekil 5), ancak parametrelerin optimize edilmesi ve bu tedavinin maksimum etkisini belirlemek için daha fazla hayvanın test edilmesi gerekiyor. Tedavi sonrası MRG taramaları, tümör dokusuna lokalize etki ile sağlıklı dokuda FUS tedavisi ile oluşturulan lezyonların görünümünü göstermez (Şekil 6). Tümörde 5-ALA alımını en üst düzeye çıkarmak için SDT'yi kan-beyin bariyerini geçici olarak geçirgen hale getirmek gibi diğer FUS teknikleriyle birleştirme fırsatı da vardır12. Bu protokol, yapısal düzeyde güvenlik ve etkinliği kontrol etmek için çeşitli histoloji teknikleri uygulanarak daha da desteklenebilir. Yapısal veya tümör hasarını kontrol etmek için bir hematoksilen ve eozin (H & E) boyası yapılabilir13, hücresel apoptozu kontrol etmek için bir terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick ucu etiketleme (TUNEL) boyasıyapılabilir 14. Ne olursa olsun, bu protokol, SDT ile tedavi edilen tümörlerin büyüme hızının ve tedavi edilmemiş tümörlerin büyüme hızının karşılaştırılmasının yanı sıra sonikasyondan önce ve sonra tümör dilimlerinin karşılaştırılmasıyla belirgin olan, tedaviden 24 saat sonra bile değişikliklerin fark edildiği güvenli ve tümöre özgü bir tedavi sunar.
Herhangi bir protokolde, her zaman tartılması gereken dezavantajlar veya sınırlamalar vardır. Mevcut protokolün ana sınırlaması zaman ve masraftır. Bu arada, bu protokolün avantajlarından biri de otomatik odaklı amacıdır. Bu odaklanmış prosedürü gerçekleştirmek için, tümörün hedeflenmesinin doğru olduğundan emin olmak için her bir hayvan için MRI taramalarının yapılması gerekir, bu hem zaman alıcı hem de pahalı olabilen bir süreçtir. Ek olarak, istenen odak noktalarının sayısına bağlı olarak, bu protokolü gerçekleştirmek için gereken süre sadece birkaç hayvan için bile saatler olabilir ve bu da deney hayvanı sayılarının düşük olmasına neden olabilir. Bu dezavantajlara rağmen, bu hedefe yönelik noninvaziv protokol, açık cerrahi seçeneklerle karşılaştırıldığında uygulanabilir bir tercih olmaya devam etmektedir.
Sonuç olarak, bu protokol, SDT tedavisinin tedaviden sonraki 24 saat içinde beyindeki tümör büyümesini azaltma yeteneğini gösterirken, klinik öncesi bir fare modelinde sağlıklı nöral dokuyu korudu. Bu tedaviyi klinik olarak uygun hale getirmek için SDT'nin etkinliği ve ROS üretimini artırmak için çeşitli parametrelerin optimize edilmesi üzerine çalışmalar gereklidir. SDT'nin noninvaziv bir terapötik model olarak kullanımı için yeni yollar araştırılmalıdır.
Disclosures
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan ederler. Amir Manbachi, BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical için ders veriyor ve danışmanlık yapıyor ve patent bekleyen bir dizi FUS teknolojisinin mucidi. Betty Tyler, NIH'den araştırma fonuna sahiptir ve Hızlandırılmış Kombinasyon Terapileri*'nin ortak sahibidir. Ashvattha Therapeutics Inc. ayrıca patentlerinden birini lisanslamıştır ve Peabody Pharmaceuticals'ın hissedarıdır (*öz sermaye veya opsiyonları içerir).
Acknowledgments
Yazarlar, Ulusal Bilim Vakfı (NSF) STTR Faz 1 Ödülü'nden (#: 1938939), ASME Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) Ödülü (#: N660012024075) ve Johns Hopkins Klinik ve Translasyonel Araştırma Enstitüsü'nün (ICTR) Klinik Araştırma Akademisyenleri Programı (KL2), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (NCATS) tarafından yönetilmektedir. Hücreler, Mayo Tıp Eğitimi ve Araştırma Vakfı'ndan satın alındı ve sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
- Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (4), 299-312 (2020).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- McHale, A. P., Callan, J. F., Nomikou, N., Fowley, C., Callan, B. Sonodynamic therapy: concept, mechanism and application to cancer treatment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 880, 429-450 (2016).
- Ohmura, T., et al. Sonodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid and focused ultrasound for deep-seated intracranial glioma in rat. Anticancer Research. 31 (7), 2527-2533 (2011).
- Shono, K., et al. Elevated cellular PpIX potentiates sonodynamic therapy in a mouse glioma stem cell-bearing glioma model by downregulating the Akt/NF-κB/MDR1 pathway. Scientific Reports. 11 (1), 15105 (2021).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Borah, B. M., et al. Sonodynamic therapy in combination with photodynamic therapy shows enhanced long-term cure of brain tumor. Scientific Reports. 10 (1), 21791 (2020).
- Wu, S. -K., Santos, M. A., Marcus, S. L., Hynynen, K. MR-guided focused ultrasound facilitates sonodynamic therapy with 5-Aminolevulinic acid in a rat glioma model. Scientific Reports. 9 (1), 10465 (2019).
- Zhang, Q., et al. Sonodynamic therapy-assisted immunotherapy: A novel modality for cancer treatment. Cancer Science. 109 (5), 1330-1345 (2018).
- Nonaka, M., et al. Sonodynamic therapy consisting of focused ultrasound and a photosensitizer causes a selective antitumor effect in a rat intracranial glioma model. Anticancer Research. 29 (3), 943-950 (2009).
- Pi, Z., et al. Sonodynamic therapy on intracranial glioblastoma xenografts using sinoporphyrin sodium delivered by ultrasound with microbubbles. Annals of Biomedical Engineering. 47 (2), 549-562 (2019).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 1: Data acquisition, anatomical feature segmentation, tracking global volume and density changes. Journal of Neuroscience Methods. 364, 109354 (2021).
- Chimata, A. V., Deshpande, P., Mehta, A. S., Singh, A. Protocol to study cell death using TUNEL assay in Drosophila imaginal discs. STAR Protocols. 3 (1), 101140 (2022).
