Summary
Här beskriver vi ett protokoll som beskriver hur man utför sonodynamisk terapi i en in vivo musglioblastommodell med hjälp av magnetiskt resonansstyrt fokuserat ultraljud.
Abstract
Sonodynamisk terapi (SDT) är en tillämpning av fokuserat ultraljud (FUS) som gör det möjligt för ett sonosensibiliserande medel att prima tumörer för ökad känslighet under ultraljudsbehandling. Dessvärre saknas nuvarande kliniska behandlingar för glioblastom (GBM), vilket leder till låg långtidsöverlevnad bland patienterna. SDT är en lovande metod för att behandla GBM på ett effektivt, icke-invasivt och tumörspecifikt sätt. Sonosensibilisatorer går företrädesvis in i tumörceller jämfört med det omgivande hjärnparenkymet. Appliceringen av FUS i närvaro av ett sonosensibiliserande medel genererar reaktiva oxidativa arter som resulterar i apoptos. Även om denna behandling tidigare har visat sig vara effektiv i prekliniska studier saknas etablerade standardiserade parametrar. Standardiserade metoder är nödvändiga för att optimera denna terapeutiska strategi för preklinisk och klinisk användning. I den här artikeln beskriver vi protokollet för att utföra SDT i en preklinisk GBM-gnagarmodell med hjälp av magnetisk resonansstyrd FUS (MRgFUS). MRgFUS är en viktig funktion i detta protokoll, eftersom det möjliggör specifik inriktning av en hjärntumör utan behov av invasiva operationer (t.ex. kraniotomi). Den bänkenhet som används här kan fokusera på en specifik plats i tre dimensioner genom att klicka på ett mål på en MR-bild, vilket gör valet av mål till en enkel process. Detta protokoll kommer att ge forskare en standardiserad preklinisk metod för MRgFUS SDT, med den ökade flexibiliteten att ändra och optimera parametrar för translationell forskning.
Introduction
Glioblastom (GBM) är en form av mycket aggressiv hjärncancer som har en incidens på 3,21 per 100 000 personer och är den vanligaste elakartade hjärntumören1. Den nuvarande standardbehandlingen inkluderar kirurgisk resektion, strålning och kemoterapi2. På grund av tumörens invasiva och infiltrativa natur är fullständig tumörresektion sällsynt. Kvarvarande vävnad vid tumörkanterna resulterar i en hög frekvens av tumöråterfall och en låg överlevnadsgrad på mindre än 6 % efter 5 år1.
På grund av denna prognos utforskar forskare nya behandlingsalternativ för att bekämpa denna dödliga sjukdom. Sonodynamisk terapi (SDT) är en icke-invasiv behandling som kombinerar lågintensivt fokuserat ultraljud (FUS) och sonosensibiliserande medel för att ge en cytotoxisk effekt i riktade celler3. Som ett exempel tas porfyrinbaserade sonosensibilisatorer såsom 5-aminolevulinsyra (5-ALA) företrädesvis upp av tumörceller och ökar produktionen av reaktiva oxidativa arter (ROS) till skadliga nivåer när de utsätts för fokuserat ultraljud. Överuttryckta nivåer av ROS i celler kan skada cellulära strukturer och utlösa apoptos. Eftersom 5-ALA företrädesvis tas upp av tumörceller är frisk vävnad inom behandlingsområdet oskadd 3,4. Preliminära in vitro-studier har visat att många cancerceller lyseras av SDT-behandling, även om celldödhastigheten är beroende av cellinjen. Preliminära in vivo-studier ger liknande resultat, vilket bekräftar att SDT kan utlösa apoptos5.
Detta protokoll syftar till att beskriva effektiva tekniker och parametrar för SDT-behandling av gnagarmodeller med intrakraniellt implanterade GBM-celler med hjälp av en bänkforskningsplattform för FUS. Forskare kan använda detta protokoll för att utföra och optimera SDT för translationell FUS-forskning.
Protocol
Alla djurstudier har godkänts och utförts i enlighet med Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Atymiska nakna honmöss (ålder: 10 veckor) erhölls från kommersiella källor (se materialförteckning). Alla föreskrifter för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) följdes, inklusive användning av masker, handskar och rockar.
1. Tumörimplantationer och bioluminiscensavbildning
- Under den inledande fasen av studien utföra intrakraniell tumörimplantation, enligt en tidigare publicerad rapport6.
OBS: I denna studie användes 100 000 M59 humana GBM-xenograftceller i 4 μL cellsuspension för implantation på 3,0 mm djup i skallen. - Före behandling kvantifieras tumörstorleken i varje mus icke-invasivt med hjälp av ett in vivo luminiscensavbildningssystem (se Materialtabell) enligt en tidigare publicerad rapport7.
OBS: Detta gjordes på behandlingsdatumet, 7 dagar efter de första tumörimplantationerna. - Med hjälp av bildkvantifiering kan du dela in mössen i jämförbara undergrupper för behandling.
OBS: I denna studie inkluderades två subgrupper: (1) obehandlade tumörbärande möss (n = 4) och (2) tumörbärande möss som genomgick SDT (n = 4). Ingen statistiskt signifikant skillnad i tumörstorlek före behandling observerades mellan de två grupperna (p > 0,05).
2. Upplägg av behandlingsdag
- Ta ut 5-ALA-hydroklorid (se materialförteckning) ur frysen och väg upp 200 mg/kg musvikt 5-ALA (väg t.ex. 5 mg för en mus på 25 g). Gör det endast i omgivande ljus.
OBS: Sterilisera all utrustning före användning. - Lös upp den totala mängden 5-ALA i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) så att varje djur får en 60 mg/ml lösning av 5-ALA med rätt viktdos (t.ex. för en mus på 25 g, lös upp 5 mg 5-ALA i 83,33 μl PBS).
- För varje djur i SDT-testgruppen injiceras rätt mängd 5-ALA i djuret intraperitonealt (beräknat i steg 2.1 och 2.2).
- Lämna djuren i sina burar i 3 timmar för att metabolisera 5-ALA.
3. Utarbetande av förutsättningar för experiment
- Fyll en behållare med avjoniserat (DI) vatten.
OBS: Mängden vatten som behövs baseras på antalet möss som används i studien. - Fäst in- och utflödesrören till ultraljudsavgasaren (se materialtabell) och anslut avgasaren till strömmen (1 = PÅ, 0 = AV).
- Placera den andra änden av Flow in - och Flow out-rören i DI-vattenbehållaren.
- Slå på avgasaren och kör i 45 min.
- Fyll det nyligen avgasade vattnet till toppen av en lufttät, förseglad behållare som ska användas under studien.
- Häll ultraljudsgel (se materialförteckning) i ett koniskt rör och placera sedan i en centrifug och centrifugera med 160 x g i 5 minuter för att avlägsna eventuell luft från gelen.
OBS: Tillräckligt med gel behövs för att bilda en klick gel på huvudet på varje djur.
4. Inställning av MRgFUS-systemet
- Anslut MRgFUS-systemet (se materialförteckning) med hjälp av kopplingsschemat som visas i figur 1 (bottenpanelen).
- Anslut alla nödvändiga komponenter (stationär dator, bildskärm, MRgFUS-plattform, oscilloskop, amplivligare) till strömmen.
- Anslut alla kablar till rätt platser.
- Anslut önskad givare till MRgFUS-plattformen via BNC- och koaxialkablarna och anslut sedan motsvarande impedansmatchningsbox till rätt ledningar.
OBS: En 515 kHz-givare användes för den aktuella studien.
- Slå på alla enheter.
- Öppna AUREUS-applikationen på den stationära datorns operativsystem, som redan är integrerad i FUS-systemprogramvaran.
- Välj Anslut all maskinvara för att ansluta maskinvaran till systemet och se till att komponenterna kommunicerar med programvaran.
- Välj den givare som används genom att välja rullgardinsmenyn och välja önskad givare.
5. Initiering
- Skruva loss den nedre skruven från fantomen och fyll hålrummet med avjoniserat och avgasat vatten tills det svämmar över, och sätt sedan tillbaka skruven igen.
- Sätt in fantomen i motsvarande MR-sängplats (se figur 2) och placera sedan MR-sängen i MR-vaggan i motsvarande skåra.
- Placera MR-vaggan på motsvarande plats i MR-skannern (se materialtabell). Justera vaggan så att fantom-MR-sängen kan glida in i MR-hålet utan några hinder för att få en högkvalitativ bild av fantomen. Markera den här platsen så att den är lätt att replikera i framtiden.
OBS: När denna plats har hittats kommer platsen inte att ändras under resten av behandlingen. Se därför till att det är en lämplig plats för MRT-placering av djur, annars måste hela registreringen upprepas. - Gör en MR-undersökning av fantomen med hjälp av inställningarna i tabell 1.
- Ta bort vaggan från magnethålet men behåll den på skannern. Ta bort MRT-sängen som innehåller fantomen från vaggan och placera sedan sängen med fantomen på MRgFUS-systemet genom att skjuta pinnen på botten till dess rätta skåra.
- Sätt registreringsspetsen på de magnetiska skårorna på givararmen så att den pekar nedåt mot fantomen (se figur 2).
- I programvaran väljer du Välj en ny hemposition och sedan Jog-läge på för att påbörja guidad fokuserad sökning. När jogläget har växlat, använd knapparna vänster, höger, upp, ner, sida upp och sida ner för att manuellt flytta runt givararmen i vänster, höger, framåt, bakåt, upp respektive nedåt.
- Justera pekaren manuellt i alla tre måtten tills pekarens spets vidrör mitten av kryssmönstret som ligger ovanpå fantomen (se figur 2).
- Ladda ner fantom-MR-bilderna till datorn och placera dem i en mapp i den valda katalogen, och ladda sedan MR-bilderna i programvaran genom att välja Läs in fantombilder. De axiella fantomskivorna kommer sedan att fylla skärmen på höger sida. Bläddra igenom dessa segment via musens rullningslist. Justera ljusstyrkan genom att klicka och hålla på bilden och sedan flytta musen uppåt eller nedåt.
OBS: Om någon av filerna i mappen inte är okomprimerade DICOM-filer kommer programvaran inte att kunna läsa och importera dem, så ta bort alla andra filer från den mappen. - Bläddra till valfri bild av fantomen där det finns en tydlig cirkel med tre mörka hål i varje. Klicka på mitten av fantomen så dyker en röd cirkel upp. Klicka och dra på cirkeln tills den har samma diameter och är i linje med fantomens omkrets (se figur 2).
- Koordinaterna för denna position kallas "hemposition". spara detta genom att klicka på Ställ in L/R, A/P och S/I.
- Klicka på Jog Mode Off, ta bort registreringsspetsen från givararmen och välj sedan Avsluta fokussökning. Bekräfta hempositionen för att slutföra initieringssekvensen.
6. Förberedelse för SDT på djur
- Bedöva musen med en isofluran-O2-gasblandning i en induktionskammare. Ställ in gasflödet på 1,0 ml/min och förångaren på 2,0 % för anestesiinduktion, vilket vanligtvis kräver 3-5 minuter i kammaren (se materialtabell).
- Bedöm djurets förmåga till adekvat sedering genom att nypa ihop tån. Applicera en ögonsalva på ögonen för att undvika torrhet i hornhinnorna.
OBS: Övervaka anestesidjupet under hela proceduren. - Injicera musen med 40 μl gadoliniumkontrastmedel genom svansvenen (se materialförteckning).
- Ta bort allt hår som blockerar hårbotten ovanför skallen med hjälp av en hårborttagningskräm och en elektronisk rakapparat.
- Fäst djuret i MR-sängen med hjälp av följande steg (se figur 3).
- Anslut inloppsröret till MRT-bädden (Figur 3A) till en källa för isofluran för anestesi och ställ in gasflödet på 1.0 ml/min och förångaren på 2.0 % för anestesiinduktion. Anslut utloppsröret till en kolfilterbehållare för anestesiabsorption.
- Placera noskonstycket i dess skåra, som visas i figur 3B. Skjut bettstången genom bettstångshålen i både noskonen och vid sängens ände, som visas, med bettskyddsänden svävande över den öppna brunnen i MR-sängen.
- Placera djuret på MR-sängen med öronen i linje med de stereotaktiska hålen i öronen och lås tänderna genom bettskyddet för att hålla det på plats. Skjut noskonen framåt så att den är över djurets nos för att ge en stadig ström av bedövning.
- Skjut öronpinnarna genom hålen på båda sidor av MR-sängen och höj djurets huvud tills båda öronspärrarna får plats i musens hörselgångar.
OBS: Tryck inte för långt, eftersom det kan skada djurets trumhinnor. - Se till att djuret är i en bekväm position. Använd sedan en platt skruvmejsel och skruva i de MRT-kompatibla skruvarna för att låsa fast båda öronstängerna, näskonen och bettstången. Detta kommer att låsa djuret på plats och förhindra huvudrörelser tills djuret tas bort från sängen.
OBS: Se till att det inte finns någon störning av djurets positionering på MR-sängen efter detta steg. Om djuret rör sig måste hela uppställningen (steg 6.5) upprepas, oavsett hur långt protokollet har kommit. - Medan djuret väntar kan du placera MR-sängen på en varm värmekudde för att bibehålla kroppstemperaturen.
OBS: Övervaka och bibehåll kroppstemperaturen under hela proceduren.
- Isofluran tillförs kontinuerligt till djuret via slangar som är fästa vid noskonerna under hela behandlingen när djurbädden är fixerad på FUS-systemet, med hjälp av de fixturer som finns på plattformen.
7. MRT-procedurer
- Ta MRT-sängen med djuret stereotaktiskt fixerat och placera den i MR-vaggan som tidigare var ansluten till MR-skannern (se materialtabell) genom att sätta MRT-sänghålet i dess ände mot pinnen på MRT-vaggan, som visas i figur 3. Fäst inlopps- och utloppsanestesituber på motsvarande rör i MRT-maskinen.
- Skjut in MR-vaggan som innehåller djuret i MR-hålet och se till att behålla samma position som där fantomen placerades.
- Utför en lokalisering för att se var djurets hjärna finns och gör sedan en T1-viktad MR-undersökning efter kontrast som täcker hela hjärnan med hjälp av MRT-inställningarna i tabell 2.
- Exportera MRI-skanningen som en uppsättning okomprimerade DICOM-filer, en för varje sektor.
8. Fokuserad ultraljudsbehandling (figur 4)
- Ta bort djuret från MRT-vaggan efter avslutad skanning och placera det på plattformen genom att sätta in sängens framsida i motsvarande pinne på baksidan av plattformen och sätta in sängens baksida i motsvarande pinne.
- Anslut inloppsröret till MRT-bädden till en källa för isofluran för anestesi och ställ in gasflödet på 1.0 ml/min och förångaren på 2.0 % för underhåll av anestesi. Anslut utloppsröret till en kolfilterbehållare för anestesiabsorption.
- Överför uppsättningen DICOM-filer till datorn och placera dem i en mapp i huvudarbetskatalogen för den aktuella studien.
OBS: Se steg 5.9 för file krav. - I programvaran, gå till huvudinitieringssidan och aktivera Jog-läge genom att klicka på Guidad fokussökning och klicka sedan på Jog-läge På.
- Placera en klick centrifugerad ultraljudsgel på djurets huvud, med tillräckligt med gel för att täcka hela hårbotten ovanför skallen.
- Häll DI och avgasat vatten i vattenbadet upp till 80 % och sätt sedan in vattenbadet på motsvarande pelare på plattformen.
- Sänk vattenbadet fyllt med DI-vatten tills det nedre membranet vidrör ultraljudsgelen på djurets huvud och bildar en kopplingsyta mellan vattnet och gelen. Se till att ultraljudsgelen täcker hela djurets huvud till vattenbadet och att det inte finns några luftbubblor i ultraljudsgelen mellan vattenbadet och musens hårbotten.
- Sänk ner ultraljudsgivaren i vattenbadet och se till att inga luftbubblor bildas på givarens yta.
- Sänk givararmen med Jog Mode Down mot den delvis nedsänkta givaren och koppla den till givaren genom att rikta in de magnetiska slitsarna med varandra medan givarens yta förblir nedsänkt.
- Stäng av Jog-läget och avsluta sedan Fokuserad sökning, som du gjorde under initieringssteget. Se till att bekräfta hempositionen som gjort tidigare.
- Gå till fliken Behandling och ladda sedan upp T1-viktade MR-filer efter kontrast genom att klicka på mappikonen längst upp i mitten av skärmen. Välj mappen som innehåller DICOM-filerna som laddades upp till datorn tidigare och öppna dem. Det här steget bör automatiskt läsa in alla DICOM-filer i den övre högra panelen.
- Därefter, i fliken Ultraljudsbehandling , välj rätt behandlingsläge genom att välja antingen Burst eller Continuous Wave. Om du är i burst-läge, på fliken Ultraljudsbehandling , ange burstlängd, burst-period och antal perioder. Dessa parametrar kommer att motsvara varje ultraljudsbehandling. Om du är i kontinuerligt vågläge, ange bara ultraljudsbehandlingens varaktighet.
OBS: I denna studie användes kontinuerligt vågläge under en varaktighet på 120 s. - Klicka på målikonen längst upp i mitten av sidan och välj rätt platser på rätt MR-skiva där FUS-fokalområdet ska riktas. En ljusröd fyrkant med en röd cirkel kommer att finnas där du klickar på den. Mer än ett val kan väljas.
- Till vänster om MRT-bilden finns en tabell som fylls i med 3D-koordinaterna för de valda fokalområdena. I den sista kolumnen i tabellen anger du effektnivån som ska sonikeras vid varje brännpunkt, som kan beräknas separat för varje givare som används för att erhålla önskat tryck eller intensitetsnivåer. Klicka på varje fokuspunkt i tabellen för att bekräfta, vilket kommer att resultera i att koordinaterna markeras och motsvarande fokusområde på bilden blir blått.
OBS: Se givarens datablad för att avgöra hur effektnivån som anges i tabellen ska översättas till tryck eller intensitet, eftersom dessa värden är givarspecifika. - När du är nöjd med alla fokusområden väljer du Rörelsetest. Detta kommer att uppmana programvaran att flytta givaren till alla fokuspunkter för att säkerställa att rörelserna är möjliga. Efter bekräftelse kommer programvaran att indikera att rörelsetestet är slutfört. Om ett fel uppstår, justera fokalområdena så att de får plats i givarmotorernas 3D-axlar.
- När du är klar, välj Börja ultraljudsbehandling för att påbörja ultraljudsbehandling protokollet, flytta givaren och tillämpa rätt FUS parametrar vid varje fokal region valt.
- När ultraljudsbehandlingsprotokollet är klart, koppla bort givaren från givararmen, ta bort vattenbadet från plattformen och torka av ultraljudsgelen från djurets hårbotten.
- Skruva loss bettet och öronstängerna, ta bort djuret från MR-sängen och placera sedan djuret på en varm dyna tills djuret vaknar upp från narkosen. Vid denna tidpunkt ska du sätta tillbaka djuret i buren.
- För efterföljande djur upprepas samma protokoll med början i avsnitt 6.
- När de önskade djuren har behandlats, rengör alla ytor som vidrörs av djur med 70 % etanol (se materialtabell).
- Avsluta programvaran och stäng sedan av och stäng av varje utrustning.
9. Steg efter behandlingen
- Upprepa protokollet för in vivo imaging system (IVIS) från avsnitt 1 för bioluminiscensmätning 24 timmar efter behandling. För att analysera behandlingens effektivitet, jämför bioluminiscensregistreringarna före och efter behandling för att bestämma tillväxthastigheten för både behandlade och obehandlade grupper.
- Utför uppföljande MR-undersökningar med samma inställningar som i steg 6.4. Med hjälp av kontrastförstärkta skanningar kan du jämföra den genomsnittliga gråskaleintensiteten i tumörregionen eller beräkna den totala volymen som täcks av kontrastmedlet för att fastställa skillnader i tumörvolym före och efter behandling.
Representative Results
Tumörstorleken minskar hos djur som behandlas med SDT 24 timmar efter behandling.
På dagen för SDT-behandling var den ursprungliga genomsnittliga bioluminiscenssignalen för kontroll- och behandlingsgrupperna (N = 4 vardera) 2,0 x 10 6 ± 3,1 x 10 6 respektive 2,3 x 10 6 ± 1,3 x 10 6 p/s/cm2/sr. De genomsnittliga bioluminiscensvärdena som motsvarade tumörstorlek före behandling mellan de två grupperna var inte statistiskt signifikanta (p = 0,89). Den genomsnittliga bioluminiscenssignalen för behandlingsgruppen var 3,57 x 10 6± 2,3 x 10 6 24 timmar efter SDT, medan bioluminiscenssignalen för kontrollgruppen ökades till 5,5 x 10 6 ± 8,2 x 10 6 p/s/cm2/sr. Som framgår av figur 5 motsvarar detta en tillväxttakt på 83,4 % ± 78 % respektive 172 % ± 34 %, förutsatt en exponentiell tillväxt (p = 0,08). Av de fyra behandlade djuren hade tre lägre tillväxt efter behandling jämfört med kontrollerna. Det fanns en extremvärde i behandlingsgruppen som visade jämförbar tillväxt med kontrollerna, vilket snedvrider avvikelserna.
Dessutom genomgick djuren efterföljande kontrastförstärkt MR-avbildning dagen efter behandling för jämförelse av tumören före och efter behandlingen. Den genomsnittliga gråskaleintensiteten av kontrastmedel i tumörer utfördes över varje MRT-skiva för varje djur för att mäta hur mycket kontrastmedel som kom in i tumörer efter behandling, som en uppskattning av tumörstorleken. Före behandlingen var den genomsnittliga tumörgråskaleintensiteten mellan kontrollgruppen och den behandlade gruppen likartad. I genomsnitt ökade denna gråskaleintensitet i kontrollgruppen till en större magnitud än i de behandlade grupperna, även om den inte var signifikant (p = 0,47). Dessa uppgifter visas i tabell 2. Den höga variabiliteten i dessa resultat kan bero på det faktum att MRT togs först 24 timmar efter behandlingen, då den terapeutiska potentialen för SDT först har börjat uppstå. Trots detta visar figur 6 ett exempel på de lesioner som skapas av SDT.
Bild 1: Konfiguration av FUS-system. (Överst) MRgFUS System med märkta komponenter. (Framsida) 1. Plattform. 2. Axel motoriserad givararm. 3. FUS-givare. 4. Vattenbad. 5. MR-säng. 6. Övervaka. 7. Matchningsbox för givarimpedans. 8. Effektförstärkare. 9. Funktion generator. 10. Funktion generator kanal 1 BNC-port. 11. Stationär dator. (Nederst) MRgFUS-system med färgkodat kopplingsschema med följande anslutningar. (Tillbaka) 1. Nätsladdar. 2. Övervaka HDMI till stationär HDMI. 3. Port B USB B till skrivbordet USB A. 4. Oscilloskop LAN Ethernet till stationärt Ethernet. 5. Rörelsegränssnitt Ethernet till stationärt Ethernet. 6. Oscilloskop aux in/ut BNC till AWG-ingång BNC. 7. Oscilloskopkanal 1 (främre) BNC till SYNC BNC. 8. Matchande boxutgång BNC till RF-ingång koaxial. 9. RF-utgång koaxial till matchande box koaxial. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Fantomregistrering. (A) Systeminstallation och programvara under fantomregistrering. (B) Skärmdump av fantomregistreringsskärmen, där den röda cirkeln är den valda omkretsen av det axiella tvärsnittet. (C) Fantomen placerad på MRT-sängen, ovanifrån. (D) Sidovy av fantomen, där den röda linjen är i den axiella skivan som motsvarar cirkeln i C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Djurens placering. A) Säng och vagga för magnetkameraundersökning med olika delar märkta: 1. Vagga för magnetkameraundersökning. 2. Stereotaktisk MR-säng. 3. Öronstänger. 4. Bitstång. 5. Noskon. 6. Hål för MRT-sängpinne. 7. Isofluran anestesirör. (B) Illustration som visar placeringen av musen på MRT-bädden och placeringen på vaggan, med RF-spolen (orange) (illustrationen modifierad med Biorender 2022-mallen). (C) Illustration som visar placeringen av musen på MRT-bädden under en FUS-behandling (illustrationen modifierad med Biorender 2022-mallen). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Val av brännpunkt. Exempel på ett val av ultraljudsbehandling i ett enda djur. Varje kolumn representerar en T1-viktad MRT-skiva efter kontrast där varje skiva är 0,5 mm i proximal (skiva 1) till distal (skiva 5) riktning. Tumörgränsen segmenterades manuellt och är konturerad i rött (rad 1), och motsvarande ultraljudsbehandlingsplatser (rad 2) representeras av en ljusgrön fyrkant (fokal max centrum) och blå cirkel (halv max fokal omkrets). Varje plats sonikerades i 2 min. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Tillväxttakt efter SDT. Tillväxthastigheten för GBM-tumörer från pre- till 24 timmar efter SDT-behandling hos behandlade och obehandlade (kontroll)djur med intrakraniella M59-tumörer baserat på den uppmätta luminiscensen. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Ett T-test med två urval utfördes för att fastställa signifikans. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: SDT-genererad lesion. För- och efterkontrastförstärkande T1-viktade MRT-skanningar från en djurmodell med en representativ axiell skiva som visar en lesion i tumören skapad av SDT. (Vänster) MRT-skanning tagen före SDT-behandling, med tumören markerad i rött. (Mitten) Val av FUS-brännpunkt där det maximala trycket representeras av ljusblå cirklar och de halva maximala tryckområdena representeras av blå cirklar. (Höger) MRT-undersökningar efter SDT, där tumören är markerad i rött. SDT-skapade lesioner och spruthålet för implantation visas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Sekvens | T1 |
| Repetition tid | 3000 ms |
| Eko tid | 30 ms |
| Skivans tjocklek | mm 0,5 mm |
| Antal sektorer | 25 |
| Avstånd mellan pixlar | 0,187 mm x 0,187 mm |
| Matris för förvärv | 133 × 133 |
| Medelvärden | 4 |
Tabell 1: MRT-inställningar.
| Kontroll | SDT-koncernen | P-värde | |
| Förbehandling | 7,49 x 10 3 ± 2,2 x 103 | 7,48 x 10 3 ± 1 x 103 | 0.99 |
| Efterbehandling | 8,79 x 103 ± 7,7 x 102 | 7,95 x 10 3 ± 1,1 x 103 | 0.33 |
| Procentuell skillnad | 16% ± 16% | 7% ± 12% | 0.47 |
Tabell 2: Efterkontrastförstärkt T1-viktad MRT-gråskala.
Discussion
Nya terapeutiska och effektiva behandlingsalternativ är nödvändiga för patienter med GBM. Detta protokoll har beskrivit en preklinisk FUS-medierad behandling för GBM som för närvarande genomgår omfattande undersökning för klinisk translation. Även om SDT har en spännande potential finns det fortfarande mycket att förstå och optimera i den prekliniska miljön.
En av de viktigaste komponenterna i detta protokoll är att använda MR-styrd FUS för att rikta in sig på tumören för maximal effekt. Med hjälp av en fantom kan ett 3D-koordinatutrymme skapas, där varje pixel i axiella MR-skivor kan tilldelas en koordinat. Sedan, en enkel procedur för att välja ultraljudsbehandling plats på MR-bilden informerar givaren var man ska sikta. Det prekliniska FUS-systemet som används är mycket mångsidigt och tillämpligt när man behöver rikta in sig på platser för specifik patologi såsom en tumör, inklusive djupare liggande tumörer som skulle vara svåra att rikta in sig på utan bildbekräftelse. Genom att använda gadolinium som kontrastmedel finns det en tydlig visualisering av tumören, vilket gör det möjligt för användaren att fatta välgrundade beslut vid val av mål. Fördelen som SDT har jämfört med många andra behandlingar är att det är en tumörspecifik terapi. Lågintensiv FUS bör endast rikta in sig på tumörvävnaden, medan den friska hjärnparenkymen lämnas relativt orörd 3,8.
Resultaten av detta experiment belyser hur fördelarna med detta protokoll kan leda till terapeutiska resultat som liknar andra fynd i litteraturen för SDT. Figur 5 visar att inom så lite som 24 timmar efter behandlingsdagen skedde en avmattning av tumörtillväxten i den behandlade kohorten. Även om det är obetydligt med detta lilla urval kan signifikans resultera i ett större antal djur. Denna fördröjning av tumörtillväxt liknar vad som visades i den banbrytande artikeln om detta ämne av Wu et al. (2019), som uppvisade långsammare tumörtillväxt över tid hos behandlade djur, såväl som ökade överlevnadstider9.
Överväganden som gjordes vid utformningen av detta protokoll inkluderade djurstam, tumörtyp och val av sonosensibiliserande medel. Athymiska nakna möss valdes för detta protokoll av flera skäl. För det första är den nakna musen lättare att sonikera eftersom bristen på hår förhindrar dämpning. Avsaknaden av ett immunsystem gör det också möjligt att implantera patient-deriverade xenografter (PDX) så att tumörmodellen mer liknar den kliniska situationen. Nackdelen med att använda en atymisk modell är att immunsystemet inte kan karakteriseras, så något SDT-genererat immunsvar kommer inte att mätas i dessa studier10. Den tumörlinje som valts är en aggressiv och snabbväxande PDX-linje. Behandlingstiden är mycket viktig eftersom tumörens etablering måste verifieras, men tumörbördan bör inte fylla den kraniala halvklotet. Olika cellinjer kräver olika inkubationstider för att uppnå en tumör av optimal storlek för prekliniska experiment. I detta protokoll användes 5-ALA som sonosensibilisator på grund av dess föredragna upptag i GBM-tumörer, vilket har bekräftats in vitro för denna cellinje i tidigare experiment (opublicerade data). Andra sonosensibilisatorer kan ersättas och testas för att bestämma den förening som är mest lämplig för effektivitet och säkerhet. Slutligen påbörjades behandlingen 3 timmar efter 5-ALA injektion, eftersom tidigare litteratur har visat att detta är den optimala tidpunkten med den injektionsdosen5.
De FUS-parametrar som valts i detta protokoll (10 W/cm2 under 2 minuter vid 515 kHz vid varje målplats) bestämdes baserat på en genomgång av tidigare litteratur och inledande experiment 4,9. Ett rutnät av ultraljudsbehandling punkter som täcker hela tumören valdes för att generera ROS-effekten i hela tumören. Intensiteten som används här är högre än andra publikationer, men på kort tid förväntas detta inte leda till några negativa temperaturrelaterade effekter, eftersom intensiteter upp till 25 W/cm2 framgångsrikt har använts i en musmodell utan signifikanta biverkningar11. Det är viktigt att notera att ingen standardiserad eller optimerad uppsättning FUS-parametrar har publicerats i litteraturen. Därför kan de specifika värden som rapporteras här justeras för att bestämma den optimala uppsättningen parametrar, vilket leder till maximal minskning av tumörvävnad samtidigt som säkerheten bibehålls. Dessutom, eftersom olika cellinjer har olika nivåer av vaskularisering och hypoxi, kan denna behandling behöva justeras. Vi har visat totalt minskad tumörtillväxt (Figur 5) inom 24 timmar efter SDT-behandling, även om parametrarna behöver optimeras och fler djur behöver testas för att bestämma maximal effekt av denna behandling. MRT-undersökningar efter behandling visar inga lesioner som skapats av FUS-behandling i frisk vävnad, med effekten lokaliserad till tumörvävnad (Figur 6). Det finns också möjlighet att kombinera SDT med andra FUS-tekniker, såsom transient permeabilisering av blod-hjärnbarriären, för att maximera 5-ALA-upptaget i tumör12. Detta protokoll kan kompletteras ytterligare genom att utföra olika histologiska tekniker för att kontrollera säkerhet och effekt på strukturell nivå. En hematoxylin- och eosinfärgning (H&E) kan utföras för att kontrollera strukturell skada eller tumörskada13, medan en terminal deoxinukleotidyltransferas dUTP nick end labeling (TUNEL) färgning kan utföras för att kontrollera cellulär apoptos14. Oavsett, detta protokoll presenterar en säker och tumörspecifik behandling där förändringar är märkbara även 24 timmar efter behandling, vilket är uppenbart genom att jämföra tillväxthastigheten för tumörer behandlade med SDT och obehandlade tumörer, samt jämföra tumörskivor före och efter ultraljudsbehandling.
Med alla protokoll finns det alltid nackdelar eller begränsningar som måste vägas mot varandra. Den största begränsningen i det nuvarande protokollet är tid och kostnader. Samtidigt är en av fördelarna med detta protokoll dess automatiserade fokuserade mål. För att åstadkomma denna fokuserade procedur måste MR-skanningar göras för varje enskilt djur för att säkerställa att tumören är korrekt, en process som kan vara både tidskrävande och dyr. Dessutom, beroende på hur många fokuspunkter som önskas, kan tiden för att utföra detta protokoll vara timmar för även ett fåtal djur, vilket resulterar i ett lågt antal försöksdjur. Trots dessa nackdelar är detta riktade icke-invasiva protokoll fortfarande en genomförbar preferens jämfört med alternativ för öppen kirurgi.
Sammanfattningsvis visade detta protokoll förmågan hos SDT-behandling att minska tumörtillväxten i hjärnan inom 24 timmar efter behandling samtidigt som frisk neural vävnad bibehölls i en preklinisk musmodell. Studier av effekten av SDT och optimering av de olika parametrarna för att öka ROS-produktionen är nödvändiga för att göra denna behandling kliniskt lämplig. Nya vägar bör undersökas för användning av SDT som en icke-invasiv terapeutisk modell.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt. Amir Manbachi undervisar och konsulterar för BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical, och är uppfinnare av ett antal patentsökta FUS-teknologier. Betty Tyler har forskningsfinansiering från NIH och är delägare i Accelerating Combination Therapies*. Ashvattha Therapeutics Inc. har också licensierat ett av sina patent, och hon är aktieägare i Peabody Pharmaceuticals (*inkluderar aktier eller optioner).
Acknowledgments
Författarna erkänner finansieringsstöd från National Science Foundation (NSF) STTR Phase 1 Award (#: 1938939), av ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Award (#: N660012024075) och Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Researchs (ICTR:s) Clinical Research Scholars Program (KL2), som administreras av National Institutes of Health (NIH) National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). Cellerna köptes från och tillhandahölls av Mayo Foundation for Medical Education and Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
- Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (4), 299-312 (2020).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- McHale, A. P., Callan, J. F., Nomikou, N., Fowley, C., Callan, B. Sonodynamic therapy: concept, mechanism and application to cancer treatment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 880, 429-450 (2016).
- Ohmura, T., et al. Sonodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid and focused ultrasound for deep-seated intracranial glioma in rat. Anticancer Research. 31 (7), 2527-2533 (2011).
- Shono, K., et al. Elevated cellular PpIX potentiates sonodynamic therapy in a mouse glioma stem cell-bearing glioma model by downregulating the Akt/NF-κB/MDR1 pathway. Scientific Reports. 11 (1), 15105 (2021).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Borah, B. M., et al. Sonodynamic therapy in combination with photodynamic therapy shows enhanced long-term cure of brain tumor. Scientific Reports. 10 (1), 21791 (2020).
- Wu, S. -K., Santos, M. A., Marcus, S. L., Hynynen, K. MR-guided focused ultrasound facilitates sonodynamic therapy with 5-Aminolevulinic acid in a rat glioma model. Scientific Reports. 9 (1), 10465 (2019).
- Zhang, Q., et al. Sonodynamic therapy-assisted immunotherapy: A novel modality for cancer treatment. Cancer Science. 109 (5), 1330-1345 (2018).
- Nonaka, M., et al. Sonodynamic therapy consisting of focused ultrasound and a photosensitizer causes a selective antitumor effect in a rat intracranial glioma model. Anticancer Research. 29 (3), 943-950 (2009).
- Pi, Z., et al. Sonodynamic therapy on intracranial glioblastoma xenografts using sinoporphyrin sodium delivered by ultrasound with microbubbles. Annals of Biomedical Engineering. 47 (2), 549-562 (2019).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 1: Data acquisition, anatomical feature segmentation, tracking global volume and density changes. Journal of Neuroscience Methods. 364, 109354 (2021).
- Chimata, A. V., Deshpande, P., Mehta, A. S., Singh, A. Protocol to study cell death using TUNEL assay in Drosophila imaginal discs. STAR Protocols. 3 (1), 101140 (2022).
