Summary
Ici, nous décrivons un protocole qui détaille comment effectuer une thérapie sonodynamique dans un modèle de glioblastome de souris in vivo à l’aide d’ultrasons focalisés guidés par résonance magnétique.
Abstract
La thérapie sonodynamique (SDT) est une application des ultrasons focalisés (FUS) qui permet à un agent sonosensibilisant d’amorcer les tumeurs pour une sensibilité accrue pendant la sonication. Malheureusement, les traitements cliniques actuels pour le glioblastome (GBM) font défaut, ce qui entraîne de faibles taux de survie à long terme chez les patients. Le SDT est une méthode prometteuse pour traiter le GBM de manière efficace, non invasive et spécifique à la tumeur. Les sonosensibilisants pénètrent préférentiellement dans les cellules tumorales par rapport au parenchyme cérébral environnant. L’application de FUS en présence d’un agent sonosensibilisant génère des espèces oxydatives réactives entraînant l’apoptose. Bien que cette thérapie se soit déjà avérée efficace dans des études précliniques, il n’existe pas de paramètres standardisés établis. Des méthodes standardisées sont nécessaires pour optimiser cette stratégie thérapeutique à des fins précliniques et cliniques. Dans cet article, nous détaillons le protocole permettant d’effectuer une TDS dans un modèle préclinique de rongeur GBM à l’aide de FUS guidés par résonance magnétique (MRgFUS). MRgFUS est une caractéristique importante de ce protocole, car il permet de cibler spécifiquement une tumeur cérébrale sans avoir besoin de chirurgies invasives (par exemple, craniotomie). L’appareil de paillasse utilisé ici peut se concentrer sur un emplacement spécifique en trois dimensions en cliquant sur une cible sur une image IRM, ce qui facilite le processus de sélection de la cible. Ce protocole fournira aux chercheurs une méthode préclinique normalisée pour MRgFUS SDT, avec la flexibilité supplémentaire nécessaire pour modifier et optimiser les paramètres de la recherche translationnelle.
Introduction
Le glioblastome (GBM) est une forme de cancer du cerveau très agressif dont l’incidence est de 3,21 pour 100 000 personnes et qui est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente1. La norme de soins actuelle comprend la résection chirurgicale, la radiothérapie et la chimiothérapie2. En raison de la nature invasive et infiltrante de la tumeur, la résection complète de la tumeur est rare. Le tissu résiduel aux marges tumorales entraîne un taux élevé de récidive tumorale et un faible taux de survie inférieur à 6 % après 5 ans1.
En raison de ce pronostic, les chercheurs explorent de nouvelles options thérapeutiques pour lutter contre cette maladie mortelle. La thérapie sonodynamique (TDS) est un traitement non invasif qui combine des ultrasons focalisés (FUS) de faible intensité et des agents sonosensibilisants pour produire un effet cytotoxique dans les cellules ciblées3. À titre d’exemple, les sonosensibilisants à base de porphyrines tels que l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA) sont préférentiellement absorbés par les cellules tumorales et augmentent la production d’espèces oxydatives réactives (ROS) à des niveaux nocifs lorsqu’elles sont exposées à des ultrasons focalisés. Des niveaux surexprimés de ROS dans les cellules peuvent endommager les structures cellulaires et déclencher l’apoptose. Étant donné que le 5-ALA est préférentiellement absorbé par les cellules tumorales, les tissus sains dans la région de traitement sont indemnes 3,4. Des études préliminaires in vitro ont révélé que de nombreuses cellules cancéreuses sont lysées par le traitement SDT, bien que le taux de mort cellulaire dépende de la lignée cellulaire. Des études préliminaires in vivo donnent des résultats similaires, confirmant que la SDT peut déclencher l’apoptose5.
Ce protocole vise à décrire des techniques et des paramètres efficaces pour le traitement SDT de modèles de rongeurs avec des cellules GBM implantées intracrânienne à l’aide d’une plate-forme de recherche FUS de paillasse. Les chercheurs peuvent utiliser ce protocole pour effectuer et optimiser la SDT pour la recherche translationnelle FUS.
Protocol
Toutes les études sur les animaux ont été approuvées et menées conformément au Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Johns Hopkins. Des souris femelles athymiques nues (âge : 10 semaines) ont été obtenues auprès de sources commerciales (voir le tableau des matériaux). Tous les règlements de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) ont été respectés, y compris l’utilisation de masques, de gants et de blouses.
1. Implantations tumorales et imagerie par bioluminescence
- Au cours de la phase initiale de l’étude, effectuer l’implantation d’une tumeur intracrânienne, à la suite d’un rapport précédemment publié6.
REMARQUE : Dans cette étude, 100 000 cellules de xénogreffe de GBM humain M59 dans 4 μL de suspension cellulaire ont été utilisées pour l’implantation à une profondeur de 3,0 mm dans le crâne. - Avant le traitement, quantifier la taille de la tumeur chez chaque souris de manière non invasive à l’aide d’un système d’imagerie par luminescence in vivo (voir le tableau des matériaux) à la suite d’un rapport précédemment publié7.
REMARQUE : Cela a été fait à la date du traitement, 7 jours après les implantations initiales de la tumeur. - À l’aide de la quantification par imagerie, divisez les souris en sous-groupes comparables pour le traitement.
NOTE : Dans cette étude, deux sous-groupes ont été inclus : (1) souris porteuses de tumeurs non traitées (n = 4) et (2) souris porteuses de tumeurs subissant une TDS (n = 4). Aucune différence statistiquement significative dans la taille de la tumeur avant traitement n’a été observée entre les deux groupes (p > 0,05).
2. Configuration du jour du traitement
- Retirer le chlorhydrate de 5-ALA (voir le tableau des matériaux) du congélateur et peser 200 mg/kg de poids de souris de 5-ALA (par exemple, pour une souris de 25 g, peser 5 mg). Faites-le uniquement sous la lumière ambiante.
REMARQUE : Stérilisez tout l’équipement avant utilisation. - Dissoudre la quantité totale de 5-ALA dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), de sorte que chaque animal reçoive une solution de 60 mg/mL de 5-ALA avec la dose pondérale correcte (p. ex., pour une souris de 25 g, dissoudre 5 mg de 5-ALA dans 83,33 μL de PBS).
- Pour chaque animal du groupe d’essai SDT, injecter la quantité appropriée de solution de 5-ALA dans l’animal par voie intrapéritonéale (calculée aux étapes 2.1 et 2.2).
- Laissez les animaux dans leurs cages pendant 3 h pour métaboliser le 5-ALA.
3. Préparation des conditions requises pour les expériences
- Remplissez un réservoir d’eau déminéralisée (DI).
REMARQUE : La quantité d’eau nécessaire est basée sur le nombre de souris utilisées dans l’étude. - Fixez les tubes d’écoulement d’entrée et de sortie au dégazeur à ultrasons (voir le tableau des matériaux) et branchez le dégazeur à l’alimentation (1 = ON, 0 = OFF).
- Placez l’autre extrémité des tubes d’écoulement et de sortie dans le réservoir d’eau DI.
- Allumez le dégazeur et faites-le fonctionner pendant 45 min.
- Remplissez l’eau nouvellement dégazée jusqu’au sommet d’un récipient hermétique et scellé à utiliser pendant l’étude.
- Versez le gel à ultrasons (voir le tableau des matériaux) dans un tube conique, puis placez-le dans une centrifugeuse et essorez-le à 160 x g pendant 5 min pour éliminer l’air du gel.
REMARQUE : Une quantité suffisante de gel est nécessaire pour former une cuillerée de gel sur la tête de chaque animal.
4. Configuration du système MRgFUS
- Connectez le système MRgFUS (voir le tableau des matériaux) à l’aide du schéma de câblage comme illustré à la figure 1 (panneau inférieur).
- Connectez tous les composants nécessaires (ordinateur de bureau, moniteur, plate-forme MRgFUS, oscilloscope, amplificateur) à l’alimentation.
- Connectez tous les câbles aux bons endroits.
- Connectez le transducteur souhaité à la plate-forme MRgFUS via les câbles BNC et coaxiaux, puis connectez le boîtier de correspondance d’impédance correspondant aux fils appropriés.
NOTE : Un transducteur de 515 kHz a été utilisé pour la présente étude.
- Allumez tous les appareils.
- Sur le système d’exploitation de l’ordinateur de bureau, ouvrez l’application AUREUS, qui est déjà intégrée dans le logiciel système FUS.
- Sélectionnez Connecter tout le matériel pour connecter le matériel au système et vous assurer que les composants communiquent avec le logiciel.
- Sélectionnez le transducteur utilisé en sélectionnant le menu déroulant et en choisissant le transducteur souhaité.
5. Initialisation
- Dévissez la vis inférieure du fantôme et remplissez la cavité avec de l’eau déminéralisée et dégazée jusqu’à ce qu’elle déborde, puis replacez la vis.
- Insérez le fantôme dans l’emplacement correspondant au lit d’IRM (voir Figure 2), puis placez le lit d’IRM dans le berceau d’IRM dans son emplacement correspondant.
- Placez le support d’IRM à l’emplacement correspondant dans le scanner IRM (voir le tableau des matériaux). Ajustez le berceau de manière à ce que le lit d’IRM fantôme puisse glisser dans l’alésage de l’IRM sans aucune obstruction pour obtenir une image de haute qualité du fantôme. Marquez cet emplacement afin qu’il soit facilement reproductible à l’avenir.
REMARQUE : Une fois cet emplacement trouvé, il ne sera pas modifié pour le reste du traitement. Par conséquent, assurez-vous qu’il s’agit d’un endroit adéquat pour le placement de l’animal par IRM, sinon l’enregistrement complet devra être répété. - Faites une IRM du fantôme en utilisant les paramètres du tableau 1.
- Retirez le support de l’alésage de l’aimant, mais conservez-le sur le scanner. Retirez le lit d’IRM contenant le fantôme du berceau, puis placez le lit avec le fantôme sur le système MRgFUS en faisant glisser la cheville sur le fond dans sa fente appropriée.
- Insérez la pointe d’enregistrement sur les fentes magnétiques du bras du transducteur de manière à ce qu’elle pointe vers le bas en direction du fantôme (voir Figure 2).
- Sur le logiciel, choisissez Sélectionner une nouvelle position d’origine, puis sélectionnez Mode Jog activé pour commencer la recherche ciblée guidée. Une fois le mode Jog activé, utilisez les touches gauche, droite, haut, bas, page précédente et page suivante pour déplacer manuellement le bras du transducteur dans les directions gauche, droite, avant, arrière, haut et bas, respectivement.
- Ajustez le pointeur manuellement dans les trois dimensions jusqu’à ce que la pointe du pointeur touche le milieu du motif en croix qui se trouve sur le dessus du fantôme (voir Figure 2).
- Téléchargez les images IRM fantômes sur l’ordinateur et placez-les dans un dossier dans le répertoire choisi, puis chargez les images IRM dans le logiciel en sélectionnant Charger les images fantômes. Les tranches fantômes axiales rempliront alors l’écran sur le côté droit. Faites défiler ces tranches à l’aide de la barre de défilement de la souris. Ajustez la luminosité en cliquant longuement sur l’image, puis en déplaçant la souris vers le haut ou vers le bas.
REMARQUE : Si l’un des fichiers du dossier n’est pas un fichier DICOM non compressé, le logiciel ne pourra pas les lire et les importer, alors supprimez tous les autres fichiers de ce dossier. - Faites défiler jusqu’à n’importe quelle image du fantôme où il y a un cercle clair avec trois trous sombres dans chacun. Cliquez sur le milieu du fantôme et un cercle rouge apparaîtra. Cliquez et faites glisser le cercle jusqu’à ce qu’il ait le même diamètre et qu’il s’aligne avec la circonférence du fantôme (voir Figure 2).
- Les coordonnées de cette position sont appelées « position d’origine » ; enregistrez-le en cliquant sur Définir L/R, A/P et S/I.
- Cliquez sur Désactivé le mode Jog, retirez l’embout d’enregistrement du bras du transducteur, puis sélectionnez Quitter la recherche de mise au point. Confirmez la position d’origine pour terminer la séquence d’initialisation.
6. Préparation des animaux pour le SDT
- Anesthésier la souris à l’aide d’un mélange gazeux d’isoflurane-O2 dans une chambre à induction. Réglez le débit de gaz à 1,0 mL/min et le vaporisateur à 2,0 % pour l’induction de l’anesthésie, nécessitant généralement 3 à 5 minutes dans la chambre (voir le tableau des matériaux).
- Évaluez la sédation adéquate de l’animal en pinçant l’orteil. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter la sécheresse des cornées.
REMARQUE : Surveillez la profondeur de l’anesthésie tout au long de la procédure. - Injecter à la souris 40 μL d’agent de contraste gadolinium par la veine caudale (voir le tableau des matériaux).
- Enlevez tous les poils qui obstruent le cuir chevelu au-dessus du crâne à l’aide d’une crème dépilatoire et d’un rasoir électronique.
- Fixez l’animal au lit d’IRM en suivant les étapes suivantes (voir la figure 3).
- Connectez le tube d’entrée du lit d’IRM (Figure 3A) à une source d’isoflurane pour l’anesthésie, et réglez le débit de gaz à 1,0 mL/min et le vaporisateur à 2,0 % pour l’induction de l’anesthésie. Connectez le tube de sortie à une cartouche filtrante à charbon pour l’absorption de l’anesthésie.
- Placez le cône de nez dans sa fente, comme illustré à la Figure 3B. Faites glisser la barre de morsure à travers les trous de la barre de morsure dans le cône de nez et à l’extrémité du lit, comme illustré, avec l’extrémité du protège-morsure planant au-dessus du puits ouvert dans le lit d’IRM.
- Placez l’animal sur le lit d’IRM avec ses oreilles alignées avec les trous de la barre d’oreille stéréotaxique et verrouillez ses dents à travers le protège-morsure pour le maintenir en place. Faites glisser le cône nasal vers l’avant de manière à ce qu’il soit au-dessus du museau de l’animal pour fournir un flux constant d’anesthésie.
- Faites glisser les barres auriculaires à travers les trous des deux côtés du lit d’IRM et soulevez la tête de l’animal jusqu’à ce que les deux barres auriculaires puissent s’insérer dans les conduits auditifs de la souris.
REMARQUE : Ne poussez pas trop loin, car cela pourrait endommager les tympans de l’animal. - Assurez-vous que l’animal est dans une position confortable. Ensuite, à l’aide d’un tournevis à tête plate, vissez les vis compatibles avec l’IRM pour verrouiller les deux barres auriculaires, le cône de nez et la barre de morsure. Cela verrouillera l’animal en place et empêchera tout mouvement de la tête jusqu’à ce que l’animal soit retiré du lit.
REMARQUE : Assurez-vous qu’il n’y a pas de perturbation dans le positionnement de l’animal sur le lit d’IRM après cette étape. Si l’animal se déplace, l’ensemble de la configuration (étape 6.5) devra être répété, quel que soit l’état d’avancement du protocole. - Pendant que l’animal attend, placez le lit d’IRM sur un coussin chauffant chaud pour maintenir la température corporelle.
REMARQUE : Surveillez et maintenez la température corporelle tout au long de la procédure.
- L’isoflurane est fourni en continu à l’animal par des tubes fixés aux cônes nasaux tout au long du traitement lorsque le lit de l’animal est fixé sur le système FUS, à l’aide des fixations fournies sur la plate-forme.
7. Procédures d’IRM
- Prenez le lit d’IRM avec l’animal fixé de manière stéréotaxique et placez-le dans le berceau d’IRM précédemment connecté au scanner d’IRM (voir Tableau des matériaux), en insérant le trou du lit d’IRM à son extrémité sur la cheville du berceau d’IRM, comme illustré à la figure 3. Fixez les tubes d’anesthésie d’entrée et de sortie aux tubes correspondants dans l’appareil d’IRM.
- Faites glisser le berceau d’IRM contenant l’animal dans l’alésage de l’IRM, en veillant à garder la même position que celle où le fantôme a été placé.
- Effectuez un radiophare d’alignement de piste pour voir l’emplacement du cerveau de l’animal, puis une IRM post-contraste pondérée en T1 couvrant l’ensemble du cerveau à l’aide des paramètres d’IRM du tableau 2.
- Exportez l’IRM sous la forme d’un ensemble de fichiers DICOM non compressés, un pour chaque tranche.
8. Traitement par ultrasons focalisés (Figure 4)
- Retirez l’animal du berceau d’IRM une fois l’examen terminé et placez-le sur la plate-forme en insérant l’avant du lit dans sa cheville correspondante à l’arrière de la plate-forme et en insérant l’arrière du lit dans sa cheville correspondante.
- Connectez le tube d’entrée du lit d’IRM à une source d’isoflurane pour l’anesthésie et réglez le débit de gaz à 1,0 mL/min et le vaporisateur à 2,0 % pour le maintien de l’anesthésie. Connectez le tube de sortie à une cartouche filtrante à charbon pour l’absorption de l’anesthésie.
- Transférez l’ensemble des fichiers DICOM sur l’ordinateur et placez-les dans un dossier du répertoire de travail principal de l’étude en cours.
REMARQUE : Reportez-vous à l’étape 5.9 pour connaître les exigences relatives aux fichiers. - Dans le logiciel, accédez à la page d’initialisation principale et activez le mode Jog en cliquant sur Recherche de mise au point guidée , puis cliquez sur Jog Mode On.
- Placez une noisette de gel à ultrasons centrifugé sur la tête de l’animal, avec suffisamment de gel pour couvrir tout le cuir chevelu au-dessus du crâne.
- Versez de l’eau DI et de l’eau dégazée dans le bain-marie jusqu’à 80%, puis insérez le bain-marie sur ses colonnes correspondantes sur la plate-forme.
- Abaissez le bain-marie rempli d’eau DI jusqu’à ce que la membrane inférieure touche le gel à ultrasons sur la tête de l’animal, formant une surface de couplage entre l’eau et le gel. Assurez-vous que le gel à ultrasons recouvre toute la tête de l’animal jusqu’au bain-marie et qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le gel à ultrasons entre le bain-marie et le cuir chevelu de la souris.
- Plongez le transducteur à ultrasons dans le bain-marie, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne se forme sur la surface du transducteur.
- Abaissez le bras du transducteur à l’aide du mode Jog Down vers le transducteur partiellement immergé et couplez-le au transducteur en alignant les fentes magnétiques les unes avec les autres pendant que la surface du transducteur reste immergée.
- Désactivez le mode Jog (Jogging), puis quittez la recherche ciblée, comme lors de l’étape d’initialisation. Assurez-vous de confirmer la position d’origine comme vous l’avez fait précédemment.
- Accédez à l’onglet Traitement, puis téléchargez les fichiers IRM pondérés en T1 post-contraste en cliquant sur l’icône de dossier en haut au milieu de l’écran. Sélectionnez le dossier contenant les fichiers DICOM qui ont été téléchargés précédemment sur l’ordinateur et ouvrez-les. Cette étape devrait charger automatiquement tous les fichiers DICOM dans le panneau supérieur droit.
- Ensuite, dans l’onglet Mode de sonication , sélectionnez le mode de traitement approprié en choisissant Rafale ou Onde continue. Si vous êtes en mode rafale, dans l’onglet Paramètres de sonication , entrez la durée de la rafale, la période de rafale et le nombre de périodes. Ces paramètres correspondront à chaque emplacement de sonication. Si vous êtes en mode onde continue, entrez uniquement la durée de la sonication.
REMARQUE : Dans cette étude, le mode onde continue a été utilisé pendant une durée de 120 s. - Cliquez sur l’icône de la cible en haut au milieu de la page et sélectionnez les emplacements appropriés sur la bonne tranche d’IRM où la région focale FUS doit être visée. Un carré rouge clair avec un cercle rouge sera présent à l’endroit où vous cliquerez dessus. Il est possible de choisir plus d’une sélection.
- À gauche de l’image IRM se trouve un tableau, qui se remplira avec les coordonnées 3D des régions focales sélectionnées. Dans la dernière colonne du tableau, entrez le niveau de puissance à soniser à chaque point focal, qui peut être calculé séparément pour chaque transducteur utilisé pour obtenir les niveaux de pression ou d’intensité souhaités. Cliquez sur chaque point focal du tableau pour confirmer, ce qui mettra les coordonnées en surbrillance et la région focale correspondante sur l’image deviendra bleue.
REMARQUE : Reportez-vous à la fiche technique du transducteur pour déterminer comment traduire le niveau de puissance entré dans le tableau en pression ou en intensité, car ces valeurs sont spécifiques au transducteur. - Une fois que vous êtes satisfait de toutes les régions focales, sélectionnez Test de mouvement. Cela invitera le logiciel à déplacer le transducteur vers tous les points focaux pour s’assurer que les mouvements sont possibles. Après confirmation, le logiciel indiquera Test de mouvement terminé. Si une erreur se produit, ajustez les régions focales afin qu’elles puissent s’adapter aux axes 3D des moteurs du transducteur.
- Une fois que vous êtes prêt, sélectionnez Begin Sonication (Commencer la sonication ) pour lancer le protocole de sonication, en déplaçant le transducteur et en appliquant les paramètres FUS corrects à chaque région focale sélectionnée.
- Une fois le protocole de sonication terminé, découplez le transducteur du bras du transducteur, retirez le bain-marie de la plate-forme et essuyez le gel à ultrasons du cuir chevelu de l’animal.
- Dévissez l’occlusion et les barres auriculaires, retirez l’animal du lit d’IRM, puis placez-le sur un coussin chaud jusqu’à ce qu’il se réveille de l’anesthésie. À ce stade, remettez l’animal dans sa cage.
- Pour les animaux suivants, répétez le même protocole, à partir de la section 6.
- Une fois que les animaux souhaités sont traités, nettoyez toutes les surfaces touchées par les animaux avec de l’éthanol à 70 % (voir le tableau des matériaux).
- Quittez le logiciel, puis éteignez et éteignez chaque pièce d’équipement.
9. Étapes post-traitement
- Répétez le protocole du système d’imagerie in vivo (IVIS) de la section 1 pour la bioluminescence mesurant 24 h après le traitement. Pour analyser l’efficacité du traitement, comparez les enregistrements de bioluminescence avant et après le traitement afin de déterminer le taux de croissance pour les groupes traités et non traités.
- Effectuez des IRM de suivi en utilisant les mêmes paramètres que ceux de l’étape 6.4. À l’aide de scintigraphies à contraste amélioré, comparez l’intensité moyenne en niveaux de gris de la région tumorale ou calculez le volume total couvert par l’agent de contraste pour déterminer les différences de volume tumoral avant et après le traitement.
Representative Results
La taille de la tumeur diminue chez les animaux traités par SDT 24 h après le traitement.
Le jour du traitement SDT, le signal de bioluminescence moyen initial pour les groupes témoin et traité (N = 4 chacun) était de 2,0 x 106 ± 3,1 x 106 et 2,3 x 10 6 ± 1,3 x 106 p/s/cm2/sr, respectivement. Les valeurs moyennes de bioluminescence correspondant à la taille de la tumeur avant traitement entre les deux groupes n’étaient pas statistiquement significatives (p = 0,89). Le signal de bioluminescence moyen du groupe de traitement était de 3,57 x 10 6 ± 2,3 x 10 6 24 h après SDT, tandis que le signal bioluminescent du groupe témoin a été augmenté à 5,5 x 106 ± 8,2 x 106 p/s/cm2/sr. Comme le montre la figure 5, cela correspond à un taux de croissance de 83,4 % ± 78 % et de 172 % ± 34 %, respectivement, en supposant une croissance exponentielle (p = 0,08). Sur les quatre animaux traités, trois avaient des taux de croissance post-traitement inférieurs à ceux des témoins. Il y avait une valeur aberrante dans le groupe de traitement qui a montré une croissance comparable à celle des témoins, ce qui a faussé les écarts.
De plus, les animaux ont subi une imagerie par résonance magnétique avec contraste le lendemain du traitement pour une comparaison pré et post-traitement de la tumeur. L’intensité moyenne en niveaux de gris de l’agent de contraste dans les tumeurs a été réalisée sur chaque tranche d’IRM pour chaque animal afin de mesurer la quantité d’agent de contraste entrant dans les tumeurs après le traitement, comme une estimation de la taille de la tumeur. Avant le traitement, l’intensité moyenne de la tumeur en niveaux de gris entre le groupe témoin et le groupe traité était similaire. En moyenne, cette intensité en niveaux de gris a augmenté dans le groupe témoin à une magnitude plus importante que dans les groupes traités, bien que cela n’ait pas été significatif (p = 0,47). Ces données sont présentées dans le tableau 2. La grande variabilité de ces résultats est potentiellement due au fait que les IRM n’ont été prises que 24 h après le traitement, moment où le potentiel thérapeutique de la TDS commence seulement à se manifester. Malgré tout, la figure 6 montre un exemple des lésions créées par le SDT.
Figure 1 : configuration du système FUS. (Haut) Système MRgFUS avec composants étiquetés. (Avant) 1. Plate-forme. 2. Bras de transducteur motorisé d’axe. 3. Transducteur FUS. 4. Bain-marie. 5. Lit d’IRM. 6. Surveiller. 7. Boîte de correspondance d’impédance de transducteur. 8. Boîtier d’amplificateur de puissance. 9. Générateur de fonctions. 10. Générateur de fonctions canal 1 port BNC. 11. Ordinateur de bureau. (En bas) Système MRgFUS avec schéma de câblage à code couleur avec les connexions suivantes. (Retour) 1. Cordons d’alimentation. 2. Surveillez HDMI vers HDMI de bureau. 3. Port B USB B vers USB de bureau A. 4. Oscilloscope LAN ethernet vers ethernet de bureau. 5. Interface de mouvement ethernet vers ethernet de bureau. 6. Entrée/sortie auxiliaire de l’oscilloscope BNC vers entrée AWG BNC. 7. Oscilloscope canal 1 (avant) BNC à SYNC BNC. 8. Sortie de boîte correspondante BNC à l’entrée coaxiale RF. 9. Sortie RF coaxiale à boîte coaxiale assortie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Enregistrement fantôme. (A) Configuration du système et logiciel lors de l’enregistrement fantôme. (B) Capture d’écran de l’écran d’enregistrement fantôme, où le cercle rouge est la circonférence sélectionnée de la section transversale axiale. (C) Fantôme placé sur le lit d’IRM, vue de dessus. (D) Vue latérale du fantôme, où la ligne rouge se trouve dans la coupe axiale correspondant au cercle en C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Placement de l’animal. (A) Lit et berceau d’IRM, avec diverses parties étiquetées : 1. Berceau d’IRM. 2. Lit d’IRM stéréotaxique. 3. Barres auriculaires. 4. Barre de morsure. 5. Cône de nez. 6. Trou de cheville de lit d’IRM. 7. Tubes d’anesthésie à l’isoflurane. (B) Illustration représentant le placement de la souris sur le lit d’IRM et le placement sur le berceau, avec la bobine RF (Orange) (illustration modifiée à l’aide du modèle Biorender 2022). (C) Illustration représentant le placement de la souris sur le lit d’IRM lors d’un traitement FUS (illustration modifiée à l’aide du modèle Biorender 2022). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Sélection du point focal. Exemple d’une sélection de points de sonication chez un seul animal. Chaque colonne représente une tranche d’IRM post-contraste pondérée en T1 où chaque tranche est de 0,5 mm dans la direction proximale (tranche 1) à distale (tranche 5). La limite de la tumeur a été segmentée manuellement et est délimitée en rouge (ligne 1), et les emplacements de sonication correspondants (ligne 2) sont représentés par un carré vert clair (centre focal maximum) et un cercle bleu (demi-circonférence focale maximale). Chaque emplacement a été sonisé pendant 2 minutes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Taux de croissance suivant le SDT. Le taux de croissance des tumeurs GBM de pré- à 24 h après le traitement SDT chez les animaux traités et non traités (témoins) atteints de tumeurs intracrâniennes M59 sur la base de la luminescence mesurée. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type. Un test T de l’élève à deux échantillons a été effectué pour déterminer la signification. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Lésion générée par le SDT. Les IRM pré et post-contraste améliorent les IRM pondérées en T1 à partir d’un modèle animal présentant une coupe axiale représentative montrant une lésion dans la tumeur créée par SDT. (À gauche) IRM prise avant le traitement par TDS, avec la tumeur délimitée en rouge. (Milieu) Sélection du point focal FUS où la pression maximale est représentée par des cercles bleu clair et les régions de pression demi-maximale sont représentées par des cercles bleus. (À droite) IRM post-SDT, où la tumeur est délimitée en rouge. Les lésions créées par le SDT et le trou de la seringue pour l’implantation sont représentés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Séquence | T1 |
| Temps de répétition | 3000 ms (en anglais) |
| Temps d’écho | 30 ms (en anglais) |
| Epaisseur de la tranche | 0,5 millimètre |
| Nombre de tranches | 25 |
| Espacement des pixels | 0,187 mm x 0,187 mm |
| Matrice d’acquisition | 133 × 133 |
| Moyennes | 4 |
Tableau 1 : Paramètres de l’IRM.
| Contrôle | Groupe SDT | Valeur P | |
| Pré-traitement | 7,49 x 10 3 ± 2,2 x 103 | 7,48 x 10 3 ± 1 x 103 | 0.99 |
| Post-traitement | 8,79 x 103 ± 7,7 x 102 | 7,95 x 10 3 ± 1,1 x 103 | 0.33 |
| Différence en pourcentage | 16 % ± 16 % | 7 % ± 12 % | 0.47 |
Tableau 2 : Niveaux de gris pondérés en T1 par IRM après contraste.
Discussion
De nouvelles options thérapeutiques et thérapeutiques efficaces sont nécessaires pour les patients atteints de GBM. Ce protocole a permis de définir un traitement préclinique médié par FUS pour le GBM qui fait actuellement l’objet d’une étude approfondie en vue d’une traduction clinique. Bien que la SDT ait un potentiel passionnant, il reste encore beaucoup à comprendre et à optimiser dans le cadre préclinique.
L’un des éléments les plus importants de ce protocole est l’utilisation de FUS guidés par IRM pour cibler la tumeur afin d’obtenir une efficacité maximale. À l’aide d’un fantôme, il est possible de créer un espace de coordonnées 3D, dans lequel chaque pixel des tranches d’IRM axiale peut se voir attribuer une coordonnée. Ensuite, une procédure simple de sélection de l’emplacement de la sonication sur l’image IRM indique au transducteur où viser. Le système FUS préclinique utilisé est très polyvalent et applicable lorsqu’il s’agit de cibler des emplacements de pathologie spécifique telle qu’une tumeur, y compris des tumeurs plus profondes qui seraient difficiles à cibler sans confirmation par imagerie. En utilisant le gadolinium comme agent de contraste, il y a une visualisation claire de la tumeur, ce qui permet à l’utilisateur de prendre des décisions éclairées lors du choix des cibles. L’avantage du SDT par rapport à de nombreux autres traitements est qu’il s’agit d’une thérapie spécifique à la tumeur. Les FUS de faible intensité ne devraient cibler que le tissu tumoral, tout en laissant le parenchyme cérébral sain relativement intact 3,8.
Les résultats de cette expérience mettent en évidence comment les avantages de ce protocole peuvent conduire à des résultats thérapeutiques similaires à d’autres résultats dans la littérature pour la TDS. La figure 5 montre que dans les 24 heures suivant le jour du traitement, il y a eu un ralentissement de la croissance tumorale dans la cohorte traitée. Bien qu’insignifiant compte tenu de cette petite taille d’échantillon, l’importance pourrait résulter d’un plus grand nombre d’animaux. Ce retard dans la croissance tumorale est similaire à ce qui a été montré dans l’article pionnier sur ce sujet de Wu et al. (2019), qui a montré un ralentissement de la croissance tumorale au fil du temps chez les animaux traités, ainsi qu’une augmentation des temps de survie9.
Les considérations qui ont été prises en compte lors de la conception de ce protocole comprenaient la souche animale, le type de tumeur et la sélection de l’agent sonosensibilisant. Des souris nues athymiques ont été choisies pour ce protocole pour de multiples raisons. Tout d’abord, la souris nue est plus facile à soniser car l’absence de poils empêche toute atténuation. De plus, l’absence d’un système immunitaire permet l’implantation de xénogreffes dérivées du patient (PDX) afin que le modèle tumoral ressemble davantage à la situation clinique. L’inconvénient de l’utilisation d’un modèle athymique est que le système immunitaire ne peut pas être caractérisé, de sorte que toute réponse immunitaire générée par la SDT ne sera pas mesurée dans ces études10. La lignée tumorale choisie est une lignée PDX agressive et à croissance rapide. Le moment du traitement est très important car l’établissement de la tumeur doit être vérifié, mais la charge tumorale ne doit pas remplir l’hémisphère crânien. Différentes lignées cellulaires nécessitent des temps d’incubation différents pour obtenir une tumeur de taille optimale pour l’expérimentation préclinique. Dans ce protocole, le 5-ALA a été utilisé comme sonosensibilisateur en raison de son absorption préférentielle dans les tumeurs GBM, ce qui a été confirmé in vitro pour cette lignée cellulaire dans des expériences antérieures (données non publiées). D’autres sonosensibilisants peuvent être substitués et testés pour déterminer le composé le plus approprié en termes d’efficacité et d’innocuité. Enfin, le traitement a été commencé 3 h après l’injection de 5-ALA, car la littérature antérieure a montré qu’il s’agissait du moment optimal avec cette dose d’injection5.
Les paramètres FUS choisis dans ce protocole (10 W/cm 2 pendant2 min à 515 kHz à chaque emplacement cible) ont été décidés sur la base d’une revue de la littérature antérieure et d’expériences initiales 4,9. Une grille de points de sonication couvrant l’ensemble de la tumeur a été choisie afin de générer l’effet ROS sur l’ensemble de la tumeur. L’intensité utilisée ici est plus élevée que dans d’autres publications, mais à court terme, on ne s’attend pas à ce qu’elle entraîne des effets indésirables liés à la température, car des intensités allant jusqu’à 25 W/cm2 ont été utilisées avec succès dans un modèle murin sans effets secondaires significatifs11. Il est important de noter qu’aucun ensemble normalisé ou optimisé de paramètres FUS n’a été publié dans la littérature. Par conséquent, les valeurs spécifiques qui sont rapportées ici peuvent être ajustées pour déterminer l’ensemble optimal de paramètres, conduisant à la réduction maximale du tissu tumoral tout en maintenant la sécurité. De plus, comme différentes lignées cellulaires ont des niveaux variables de vascularisation et d’hypoxie, ce traitement peut devoir être ajusté. Nous avons montré une diminution globale de la croissance tumorale (Figure 5) dans les 24 heures suivant le traitement par SDT, bien que les paramètres doivent être optimisés et que davantage d’animaux doivent être testés pour déterminer l’effet maximal de ce traitement. Les IRM post-traitement ne montrent aucune apparition de lésions créées par le traitement FUS dans les tissus sains, l’effet étant localisé au tissu tumoral (Figure 6). Il est également possible de combiner le SDT avec d’autres techniques FUS, telles que la perméabilisation transitoire de la barrière hémato-encéphalique, afin de maximiser l’absorption du 5-ALA dans la tumeur12. Ce protocole peut être complété par l’exécution de diverses techniques histologiques pour vérifier l’innocuité et l’efficacité au niveau structurel. Une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) peut être effectuée pour vérifier les dommages structurels ou tumoraux13, tandis qu’une coloration terminale de la désoxynucléotidyl transférase dUTP (TUNEL) peut être effectuée pour vérifier l’apoptose cellulaire14. Quoi qu’il en soit, ce protocole présente un traitement sûr et spécifique à la tumeur où les changements sont perceptibles même 24 h après le traitement, ce qui est évident en comparant le taux de croissance des tumeurs traitées avec SDT et des tumeurs non traitées, ainsi qu’en comparant les coupes tumorales avant et après sonication.
Avec n’importe quel protocole, il y a toujours des inconvénients ou des limites qui doivent être pesés. La principale limite du protocole actuel est le temps et les coûts. Pendant ce temps, l’un des avantages de ce protocole est son objectif ciblé automatisé. Pour accomplir cette procédure ciblée, des IRM doivent être prises pour chaque animal individuel afin de s’assurer que le ciblage de la tumeur est correct, un processus qui peut être à la fois long et coûteux. De plus, en fonction du nombre de points focaux souhaités, le temps nécessaire à l’exécution de ce protocole peut être de quelques heures, même pour quelques animaux, ce qui entraîne un faible nombre d’animaux expérimentaux. Malgré ces inconvénients, ce protocole ciblé non invasif reste une préférence réalisable par rapport aux options de chirurgie ouverte.
En conclusion, ce protocole a montré la capacité du traitement SDT à diminuer la croissance tumorale dans le cerveau dans les 24 heures suivant le traitement tout en maintenant un tissu neural sain dans un modèle murin préclinique. Des études sur l’efficacité de la SDT et l’optimisation des différents paramètres pour augmenter la production de ROS sont nécessaires pour rendre ce traitement cliniquement adapté. De nouvelles pistes devraient être explorées pour l’utilisation de la TDS comme modèle thérapeutique non invasif.
Disclosures
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel. Amir Manbachi enseigne et est consultant pour BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical, et est l’inventeur d’un certain nombre de technologies FUS en instance de brevet. Betty Tyler bénéficie d’un financement de recherche du NIH et est copropriétaire d’Accelerating Combination Therapies*. Ashvattha Therapeutics Inc. a également obtenu une licence pour l’un de ses brevets, et elle est actionnaire de Peabody Pharmaceuticals (*comprend les actions et les options).
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le soutien financier du prix STTR Phase 1 de la National Science Foundation (NSF) (# : 1938939), du prix de l’ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (# : N660012024075) et du programme de chercheurs cliniques (KL2) de l’Institut Johns Hopkins pour la recherche clinique et translationnelle (ICTR), administré par le National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) des National Institutes of Health (NIH). Les cellules ont été achetées et fournies par la Fondation Mayo pour l’éducation et la recherche médicales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
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