Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Die klinische Proteomik ist eine wichtige neue Disziplin, die die Entdeckung von Biomarkern verspricht, die für die Frühdiagnose und Prognose von Krankheiten nützlich sein werden. Hier berichten wir über eine neue digitale Mikrofluidik- oder DMF-Methode, die mehrere Verarbeitungsschritte integriert, die in der klinischen Proteomik verwendet werden, einschließlich Proteinextraktion, Resolubilisierungsreduktion, Alkylierung und enzymatischer Verdau. DMF verwendet diskrete Mikrotröpfchen von Probenproteinen auf einem Array von Elektroden und kann bei Raumtemperatur betrieben werden, was eine parallele automatisierte Analyse von Proben ermöglicht.

Diese Methodik stellt einen bedeutenden Fortschritt gegenüber herkömmlichen Methoden dar und hat das Potenzial, ein nützliches neues Werkzeug in der klinischen Proteomik zu sein. Hallo, ich bin Steve Sche von Laborprofessorin Erin Wheeler am Department of Chemistry und Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering an der University of Toronto. Hallo, ich bin Gabriel vom Wheeler Lab an der University of Toronto.

Und ich bin Vivian Luke, ebenfalls aus dem Wearer-Labor an der University of Toronto. Ich bin Erin Wheeler. Ich habe das Glück, mit Steve Mace und Vivian zusammenzuarbeiten.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur proteomischen Verarbeitung mittels digitaler Mikrofluidik. Dieses Verfahren verwenden wir in unserem Labor, um Proteine und biologische Proben zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Beginnen Sie den Vorgang im Abzug, indem Sie die Glassubstrate in Piranha-Lösung reinigen. Bei ausreichendem Schutz besteht die Piranha-Lösung aus drei zu eins konzentrierter Schwefelsäure und 30% Wasserstoffperoxid. Bei der Arbeit damit ist also Vorsicht geboten.

Inkubieren Sie die Glassubstrate 10 Minuten lang in Piranhas und spülen Sie sie nach der Reinigung ab und deionisieren oder entwässern Sie die Substrate und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas. Platzieren Sie die Substrate in der Elektronenstrahlverdampfungskammer für die Chromabscheidung bis zu einer Dicke von 250 Nanometern. Sobald diese Dicke erreicht ist, nehmen Sie die Substrate aus der Kammer, spülen Sie sie mit Isopropanol ab und trocknen Sie sie fünf Minuten lang auf einer heißen Platte bei 115 Grad Celsius.

Die getrockneten Substrate mit Hexamethylxylazin oder HMDS durch Schleuderbeschichtung bei 30 Sekunden grundieren. 3000 U/min Spincode erneut mit Shipley S 1811 Foto. Resistieren Sie mit identischen Parametern.

Das Substrat direkt auf einer heißen Platte bei 100 Grad Celsius vorbacken. Strukturieren Sie dann den Fotolack, indem Sie ihn fünf Sekunden lang durch eine Fotomaske ultravioletter oder UV-Strahlung aussetzen. Entwickeln Sie als Nächstes die UV-belichteten Substrate in Shipley MF 3 21 Entwickler Genug, um das Substrat danach drei Minuten lang einzutauchen.

Spülen Sie das Substrat mit DI-Wasser ab und backen Sie es direkt auf einer heißen Platte bei 100 Grad Celsius für eine Minute. Ätzen Sie das freiliegende Chrom, indem Sie die Substrate 30 Sekunden lang in gerade genug Chromätzung tauchen, um sie vollständig zu bedecken.

Spülen Sie die Untergründe mit DI-Wasser ab und tauchen Sie sie so weit in einen Abstreifer Z 300 T, dass der Untergrund 10 Minuten lang eingetaucht ist. Um den restlichen Fotolack zu entfernen. In DI-Wasser abspülen und in Stickstoffgas trocknen.

Nach dieser Abscheidung werden zwei bis fünf Mikrometer Paraline C.Ein isolierendes Polymer durch chemische Gasphasenabscheidung 50 Nanometer Teflon AF auf das Substrat aufgebracht, um die Oberfläche durch Schleuderbeschichtung hydrophob zu machen. 1% Gewicht pro Gewicht in Flora Nerv FC 40 bei 2000 U/min für 60 Sekunden. Auf den Untergrund.

Wiederholen Sie den Vorgang mit nicht passiertem Indiumzinnoxid oder ITO-Glassubstrat, um den oberen Plattenpfosten zu erstellen. Backen Sie beide Substrate auf einer heißen Platte bei 160 Grad Celsius. 10 Minuten, um das digitale mikrofluidische Gerät einzurichten.

Entfernen Sie Polymerbeschichtungen von den Kontaktpads eines unteren Substrats, indem Sie mit einem Skalpell abkratzen. Koppeln Sie die freiliegenden Pads des unteren Substrats mit 40-poligen Anschlüssen und schalten Sie einen Computer ein, auf dem Lab View ausgeführt wird. Wir verwenden eine selbstgebaute Steuerbox, die Relais mit Signalen enthält, die über dpad gesteuert werden.

Die Computersteuerbox erleichtert dem Benutzer die Steuerung über das Anlegen von 100 Volt RMS pro 18 Kilohertz Signal an das Gerät über die 40-poligen Anschlüsse. Schalten Sie auch einen Funktionsgenerator und einen Verstärker ein. Montieren Sie das Gerät, indem Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband mit einer Gesamtdicke von 140 Mikrometern an den Rändern des unteren Substrats positionieren.

Pipettieren Sie vier Mikroliter DI-Wasser in eines der Reservoirs und schließen Sie das Gerät ein, indem Sie den unstrukturierten Indiumzinnoxid-Objektträger mit der teflonbeschichteten Seite nach unten auf dem Gerät positionieren. Schließen Sie einen Erdungsstecker an die obere Plattenstrecke an. Das Labor erstellte ein Initialisierungsprogramm in der Laboransicht, um die Feedback-Steuerung zu kalibrieren, das Gerät ist nun bereit für Experimente.

In diesem Protokoll werden wir Rinderserumalbumin oder BSA als Proteinprobe verwenden, um unser Design und unsere Verwendung der digitalen Mikrofluidik zu demonstrieren. BSA wird in einem Arbeitspuffer oder WB aus 100 Millimolar Tris HCL pH 7,8 mit 0,08 % Onic F1 27 Gewicht pro Volumen verdünnt. Bereiten Sie einen Milliliter jeder Probe und Reagenzlösung vor und geben Sie das Reservoir an, in das sie gegeben wird.

Entfernen Sie nach der Reagenzienvorbereitung die obere Platte vom Gerät und pipettieren Sie vier Mikroliter Lösung in das zugewiesene Reservoir. Setzen Sie nach dem Befüllen der Behälter die obere Platte wieder auf das Gerät. Verwenden Sie das hauseigene Lab-View-Programm, um die folgenden Schritte auszuführen.

Denken Sie daran, dass die Computerschnittstelle es dem Benutzer ermöglicht, etwa 600 Nanoliter Tröpfchen aus Reservoirs abzugeben und die Tröpfchen auf dem Elektrodenarray zu manipulieren. Zuerst wird ein Tröpfchen Protein abgegeben, das eine Probe von R eins und ein Tröpfchen Fällungsmittel von R zwei enthält. Füge die beiden Tröpfchen zusammen und lasse das kombinierte Tröpfchen fünf Minuten lang inkubieren, so dass Proteine auf der Oberfläche ausfallen.

Den Überstand vom gefällten Protein weg zum Abfallbehälter betätigen. Um das gefällte Protein zu waschen, geben Sie drei Tröpfchen Waschpuffer von R vier ab und treiben sie über das gefällte Protein in den Abfallbehälter. Lassen Sie den Niederschlag trocknen und geben Sie einen Tropfen resolubilisierenden Puffers von R fünf auf das Protein ab.

Lassen Sie den Puffer 20 Minuten lang inkubieren, bis sich der Niederschlag aufgelöst hat. Geben Sie anschließend ein Tröpfchen Reduktionsmittel von R sechs ab und verschmelzen Sie es mit dem Probentröpfchen. Mischen Sie das kombinierte Tröpfchen, indem Sie es über sechs Elektroden in einem kreisförmigen Muster betätigen.

Lassen Sie das Tröpfchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Ein Tröpfchen Alkylierungsmittel aus R sieben wird abgegeben und mit dem Probentröpfchen zusammengeführt, anschließend gemischt. Lassen Sie das Tröpfchen 15 Minuten lang bei Lichtschutz bei Raumtemperatur inkubieren.

Zum Schluss geben Sie ein Tröpfchen Trypsin von R 8 ab und verschmelzen es mit dem Probentröpfchen, gefolgt von einem Mischen. Lassen Sie das Tröpfchen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer Petrischale auf einer heißen Platte inkubieren. Um die Reaktion zu beenden, entfernen Sie die obere Platte und schrecken Sie den Aufschluss durch Pipettieren ab.

Sechs Milliliter 2,5%ige Trichloressigsäure in Wasser auf das Reaktionströpfchen geben. Reinigen Sie das abgeschreckte Reaktionsprodukt, indem Sie das Probentröpfchen direkt von der Bodenplatte absaugen. Mit einer C 18 Zip-Spitze können nun gemäß den Anweisungen des Herstellers die Proben nach Bedarf verdünnt und massenspektrometrisch ausgewertet werden, um die Proteine in der Probe zu identifizieren. Mit diesem System

Anschließend wurden Massenspektrometrieproteine mit Wahrscheinlichkeitswerten von weniger als dem Einfachen von E bis zu minus drei identifiziert, was einem Konfidenzintervall von 99,9 % und Sequenzabdeckungen von mindestens 30 % entspricht. Daher ist DMF eine sehr nützliche Methode für die automatisierte Verarbeitung von proteomischen Proben. Wir haben also erst heute gezeigt, wie wir die digitale Mikrofluidik nutzen, um Proteine automatisiert zu extrahieren und zu verarbeiten. Diese Methodik bietet eine potenzielle Lösung für Probenverlust und Kontamination bei der Proteinisolierung und -identifizierung.

Wir hoffen, diese Methode in Zukunft auch auf andere biologische Anwendungen anwenden zu können, unter anderem auf Immunoassays und zellbasierte Assays. Wenn Sie diese Art von Experiment durchführen, ist es am wichtigsten, daran zu denken, es zu genießen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.