Name: Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Hi-C-Methode zur Analyse dreidimensionaler Chromatin-Interaktionen und genomischer Architektur. Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Chromosomenterritorien und Kompartimenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken A. Kosmrlj für Diskussionen und Code; AP Aiden, XR Bao, M. Brenner, D. Galas, W. Gosper, A. Jaffer, A. Melnikov, A. Miele, G. Giannoukos, C. Nusbaum, AJM Walhout , L. Wood, und K. Zeldovich für Diskussionen, und L. Gaffney und B. Wong Hilfe mit Visualisierung. Unterstützt durch eine Fannie und John Hertz-Stiftung Promotionsstipendium, ein National Defense Science and Engineering Graduate Fellowship, ein NSF Promotionsstipendium, das National Space Biomedical Research Institute, und gewähre keine. T32 HG002295 vom National Human Genome Research Institute (NHGRI) (EL); i2b2 (Informatik für die Integration von Biologie und der Bedside), der NIH-unterstützten Center for Biomedical Computing an der Brigham and Women s Hospital (LAM), Grant No. HG003143 vom NHGRI und ein Keck Foundation aufstrebenden Young Scholar Award (JD). Raw und kartiert Hallo-C-Sequenz-Daten an die GEO-Datenbank (hinterlegt worden <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/">www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</a> ), Beitritt nein. GSE18199. Weitere Visualisierungen sind verfügbar unter <a href="http://hic.umassmed.edu">http://hic.umassmed.edu</a> .

<ol><li>Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Kosak, S. T., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+follows+function%3A+the+genomic+organization+of+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation.</a> Genes and Dev. 18, 1371-1384 (2004).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (2007).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Regulation+in+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene Regulation in the Third Dimension.</a> Science. 319, 1793-1794 (2008).</li>
<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nat Rev Genet. 2, 292-301 (2001).</li>
<li>Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+through+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+and+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene regulation through nuclear organization.</a> Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Chromosome+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+chromosome+conformation+capture+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).</li>
<li>Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).</li>
<li>Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., Rubio, E. D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., Green, R. D., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+%285C%29%3A+A+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Res. 16, 1299-1309 (2006).</li>
<li>Miele, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Cis-+and+Trans+Chromatin+Interaction+Networks+Using+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).</li>
<li>Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALLPATHS+2%3A+small+genomes+assembled+accurately+and+with+high+continuity+from+short+paired+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+%22%5BJournal%5D)">ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads.</a> Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).</li>
</ol>

Eine vorläufige Patent auf die Hallo-C-Methode (Nr. 61/100, 151) wird derzeit geprüft.

Wir präsentieren eine Methode zur Untersuchung der 3-dimensionalen Architektur des Genoms durch die Abbildung Chromatin-Wechselwirkungen in eine unvoreingenommene, genomweite Weise. Die wichtigsten experimentellen Schritt, was diese Technologie abhebt von früheren Arbeiten - ist der Einbau von biotinylierten Nukleotiden an die Beschränkung Enden der vernetzten Fragmenten vor blunt-end Ligation. Performing dieser Schritt erfolgreich ermöglicht tiefe Sequenzierung aller Ligation Kreuzungen und gibt Hallo-C ihres Umfangs und ihrer Macht. Die Zahl der liest, wird letztlich die Auflösung der Interaktion Karten. Hier wird eine 1 Mb Interaktion Karte für den menschlichen Genoms vorgestellt mit ~ 30 Mio. ausrichtbar liest. Um &quot;Allzweck-&quot; Auflösung um einen Faktor von n zu erhöhen, muss die Anzahl der Lese mit einem Faktor von n 2 erhöht werden. Die Hallo-C-Technik kann leicht mit anderen Techniken, wie zum Beispiel Hybrid-Capture-Bibliothek nach Generation (auf bestimmte Teile des Genoms Ziel) und Chromatin-Immunopräzipitation nach Ligation (die Chromatin Umfeld der Regionen mit spezifischen Proteinen assoziiert zu untersuchen) kombiniert werden.

<table><tbody><tr><td>Proteaseinhibitoren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340-5ml</td><td>Schritt 1.2</td></tr><tr><td>Biotin-14-dCTP</td><td>Invitrogen</td><td>19518-018</td><td>Schritt 1.6</td></tr><tr><td>Klenow</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td>Schritte 1.6 und 2.2</td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase</td><td>Invitrogen</td><td>15224</td><td>Schritt 1.9</td></tr><tr><td>T4-DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td>Schritte 1.17 und 2.2</td></tr><tr><td>10x Ligationspuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td>Schritte 2.2 und 3.4</td></tr><tr><td>T4-PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td>Schritt 2.2</td></tr><tr><td>Klenow (exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>Schritt 2.3</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>650.01</td><td>Schritt 3.2</td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase HC</td><td>Enzymatics</td><td>L603-HC-L</td><td>Schritt 3.5</td></tr><tr><td>Phusion-HF-Mastermix</td><td>New England Biolabs</td><td>F531</td><td>Schritt 3.8</td></tr><tr><td>Ampure-Beads</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A2915</td><td>Schritt 3.9</td></tr></tbody></table>

hallo-c: eine methode, um die dreidimensionale architektur des genoms study.

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Die dreidimensionale Faltung von Chromosomen compartmentalizes das Genom und und kann ferner funktionelle Elemente, wie Promotoren und Enhancer, in enger räumlicher Nähe 2-6 zu bringen. Die Entzifferung der Beziehung zwischen Chromosom Organisation und Genom-Aktivität wird in das Verständnis genomische Prozesse wie Transkription und Replikation unterstützen. Allerdings ist wenig darüber, wie Chromosomen falten bekannt. Mikroskopie ist nicht in der Lage, eine große Zahl von Loci gleichzeitig oder in hoher Auflösung zu unterscheiden. Bislang erforderte die Detektion von chromosomalen Interaktionen mit Chromosom Konformation capture (3C) und seine spätere Anpassungen der Wahl aus einer Reihe von Ziel-Loci, so dass genomweite Studien unmöglich 7-10. Wir entwickelten Hallo-C, eine Erweiterung von 3C, die in der Lage zu identifizieren langreichweitige Wechselwirkungen in eine unvoreingenommene, genomweiter ist. In Hallo-C werden die Zellen mit Formaldehyd fixiert, wodurch die Interaktion loci miteinander zu durch kovalente DNA-Protein-Quervernetzungen gebunden zu sein. Wenn die DNA anschließend mit einem Restriktionsenzym fragmentiert, so bleiben diese loci verbunden. Ein biotinylierter Rückstand wird aufgenommen, als die 5 &#39;Überhänge in. nächstes blunt-end Ligation unter verdünnten Bedingungen, die Ligation Ereignisse zwischen vernetzten DNA-Fragmente zu Gunsten durchgeführt gefüllt sind. Dies resultiert in einer genomweiten Bibliothek Ligationsprodukte, entsprechend Paare von Fragmenten, die ursprünglich in unmittelbarer Nähe zu einander in den Zellkern wurden. Jeder Ligationsprodukt ist mit Biotin auf dem Gelände der Kreuzung markiert. Die Bibliothek ist geschert, und die Kreuzungen sind mit Streptavidin-Beads-down gezogen. Das gereinigte Kreuzungen können anschließend analysiert mit Hilfe eines High-Throughput-Sequenzer, die sich in einem Katalog von wechselwirkenden Fragmente werden. Direkte Analyse des resultierenden Kontakt Matrix zeigt zahlreiche Merkmale der genomischen Organisation, wie das Vorhandensein des Chromosoms Territorien und die bevorzugte Verband von kleinen Gen-reiche Chromosomen. Korrelationsanalyse kann, um den Kontakt Matrix angewendet werden, die zeigen, dass das menschliche Genom in zwei Abteilungen getrennt ist: ein weniger dicht gepackt Compartment mit offenen, zugänglichen und aktives Chromatin und einem dichteren Compartment mit geschlossenen, unzugänglich und inaktiven Chromatin Regionen. Schließlich ergab Ensemble Analyse der Kontakt-Matrix, mit theoretischen Ableitungen und Computersimulationen gekoppelt, dass bei der Megabasen Hallo-C Funktionen in Einklang mit einer fraktalen globule Konformation zeigt.

Die Hallo-C-Methode ermöglicht unvoreingenommene, genomweite Identifizierung von Chromatin-Wechselwirkungen (1). Hallo-C Paare Ligationssysteme und massiv parallele Sequenzierung. Die resultierenden Daten können verwendet werden, um genomische Architektur auf mehreren Skalen zu studieren: die ersten Ergebnisse identifizierten Features wie Chromosom Gebiete, Segregation von offenen und geschlossenen Chromatin und Chromatin-Struktur an der Megabasen.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

Die dreidimensionale Faltung von Chromosomen kompartimentiert das Genom und kann weit voneinander entfernte funktionelle Elemente, wie Promotoren und Enhancer, ...

Hi.C ist eine Methode zur Identifizierung langreichweitiger Chromatin-Interaktionen auf unvoreingenommene, genomweite Weise. Zunächst werden Zellen mit Formaldehyd fixiert, anschließend lysiert und die DNA wird danach mit einem Restriktionsenzym fragmentiert. Danach wird ein biotinylierter Rest eingebaut, während die 5'-Überhänge zu stumpfen Enden aufgefüllt werden, und die Ligierung wird unter verdünnten Bedingungen durchgeführt, die Ligationsereignisse zwischen vernetzten DNA-Fragmenten begünstigen.Die Bibliothek wird fragmentiert und die Junctions mit Streptavidin-Beads angereichert. Die gereinigten Junctions können anschließend mittels eines Hochdurchsatz-Sequenziersystems analysiert werden, wodurch ein Katalog wechselwirkender Fragmente entsteht. Diese Ergebnisse liefern Einblicke in die Faltung von Chromatin und zeigen die Existenz von Chromosomenterritorien, die Kompartimentalisierung des Genoms in offenes und geschlossenes Chromatin sowie Hinweise auf die fraktale Globul-Organisation im Megabasen-Maßstab.Hallo, ich bin Nka Van Bergham aus dem Labor von Field Decker im Programm für Genfunktion und -expression an der Universität von Massachusetts Medical School. Hallo, ich bin Ez Lieberman Aiden aus dem Labor von Eric Lander am Broad Institute von Harvard und dem Massachusetts Institute of Technology. Ich bin Louis Williams aus der Gruppe für molekularbiologische Forschung und Entwicklung am Broad Institute und dann Maxima Mackay aus dem Labor von Len Muni am Massachusetts Institute of Technology.Heute stellen wir Ihnen ein Verfahren zur genomweiten Chromosomenkonformationsanalyse namens Hi-C vor. In unserem Labor nutzen wir dieses Verfahren, um die Architektur des menschlichen Genoms experimentell zu untersuchen. Der erste Teil des Verfahrens wird an der UMass Medical School durchgeführt und der zweite Teil am Prude Institute. Außerdem zeigen wir Ihnen, wie wir die Ergebnisse des Hi-C-Experiments genutzt haben, um die Dynamik des Genoms am MIT zu simulieren.Beginnen wir also. Beginnen wir, fangen wir an. Hi C beginnt mit der Vernetzung von Zellen, einer gängigen Methode bei der Chromosomenkonformationsanalyse.Um zu beginnen, züchten Sie zwischen zwei mal 10 hoch sieben und 2,5 mal 10 hoch sieben Säugetierzellen, entweder angeheftet oder in Suspension, und vernetzen Sie die Zellen durch Zugabe von 550 Mikrolitern Lysepuffer unter Verwendung eines Homogenisators. Zentrifugieren Sie das Chromatin bei 5.000 U/min und waschen Sie das Pellet zweimal mit jeweils 500 Mikrolitern NEB-Puffer 2. Überführen Sie die Probe in fünf nummerierte Röhrchen und geben Sie Any B-Puffer hinzu, um ein Endvolumen von 362 Mikrolitern zu erreichen.Fügen Sie vorsichtig 38 Mikroliter einer 1 %igen SDS-Lösung hinzu und inkubieren Sie bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Stellen Sie die Röhrchen anschließend sofort auf Eis und quenchern Sie das SDS, indem Sie vorsichtig 44 Mikroliter Triton X-100 zugeben, gemischt mit 400 Einheiten Hindi drei, und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Rühren. Die nächsten Schritte sind hochspezifisch für C und beinhalten das Markieren der DNA-Enden mit Biotin sowie die stumpfe End-Ligation von vernetzten Fragmenten.Dieser Schritt ermöglicht es später, Ligationsverbindungen zu reinigen. Ein Rohr sollte nicht dem Biotin-Elutionsschritt unterzogen werden und dient stattdessen als Drei-C-Kontrolle, um sicherzustellen, dass die Verdauungs- und Ligationsbedingungen optimal waren, um die Überhänge der Restriktionsfragmente aufzufüllen und die DNA-Enden in den verbleibenden vier Röhrchen mit Biotin zu markieren. Fügen Sie D-A-T-P-D-G-T-P und DTTP den Röhrchen zwei bis fünf hinzu.Fügen Sie außerdem biotinyliertes dCTP und Klino hinzu. Vorsichtig mischen und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Röhrchen auf Eis stellen und dann 86 Mikroliter 10 % SDS zu allen Röhrchen hinzufügen, um die Enzyme zu inaktivieren.Inkubieren Sie die Röhrchen genau 30 Minuten bei 65 Grad Celsius und stellen Sie sie anschließend sofort auf Eis. Um Ligationsereignisse zwischen vernetzten Fragmenten zu begünstigen, wird die Ligierung unter äußerst verdünnten Bedingungen durchgeführt. Geben Sie unter Arbeit auf Eis 7,61 Milliliter Ligationsmix zu jedem der fünf 15-Milliliter-Röhrchen hinzu.Überführen Sie dann jede verdauten Chromatinmischung in das entsprechende Reagenzglas. Geben Sie 10 Mikroliter T4-DNA-Ligase in Reagenzglas eins, um eine reguläre 3C-Ligation durchzuführen. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter T4-DNA-Ligase in die Reagenzgläser zwei bis fünf, um eine Ligation stumpfer Enden im Rahmen der Hi-C-Methode durchzuführen.Mischen Sie die Röhrchen durch vorsichtiges Umstülpen und inkubieren Sie sie vier Stunden lang bei 16 Grad Celsius. Nach der Inkubation brechen Sie das Protein ab und lösen die CNA-Vernetzungen auf, indem Sie 50 Mikroliter Proteinase K pro Röhrchen hinzufügen und die Röhrchen über Nacht bei 65 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie am nächsten Tag weitere 50 Mikroliter Proteinase K pro Röhrchen hinzu und setzen Sie die Inkubation bei 65 Grad Celsius für weitere zwei Stunden fort.Rufen Sie die Reaktionsgemische an und überführen Sie sie in fünf 50-Milliliter-Konizgläser. Reinigen Sie die DNA in diesen Röhrchen durch eine Phenolextraktion. Geben Sie 10 Milliliter Phenol hinzu und wirbeln Sie zwei Minuten lang im Vortex. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten bei 3.500 U/min und überführen Sie vorsichtig so viel wie möglich der wässrigen Phase in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Wiederholen Sie die Extraktion mit Phenol-Chloroform und fällen Sie die DNA mit Ethanol nach. Nach der Zentrifugation der ethanolpräzipitierten DNA wird jedes DNA-Pellet in 450 Mikroliter 1×TE-Puffer gelöst und in ein 1,7-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Eine weitere Reinigungsrunde erfolgt durch zwei Phenol-Chloroform-Extraktionen mit jeweils 500 Mikroliter Phenol-Chloroform, anschließend wird eine Minute lang vortexiert, dann 5 Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert und die wässrige Phase nach der zweiten Extraktion in ein neues Röhrchen überführt.Die DNA wird nach dem Zentrifugieren der präzipitierten DNA ethanolpräzipitiert; jedes DNA-Pellet wird einmal mit 70 % Ethanol gewaschen und anschließend in 25 Mikrolitern eines XT-Puffers resuspendiert. Degradieren Sie jegliche vorhandene RNA, indem Sie je Reagenzglas ein Mikroliter RNase hinzufügen und die Röhrchen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Ziehen Sie den hohen C-Gehalt der Röhrchen zwei bis fünf ab, wobei Röhrchen eins weiterhin separat als 3C-Kontrolle behandelt wird.Jetzt ist ein guter Zeitpunkt, um Menge und Qualität der Bibliotheken zu überprüfen, indem ein Aliquot in einem 0,8 %igen AASE-Gel laufen gelassen wird. Die Ligations-Effizienz von HI C sollte mit einem PCR-Digest-Assay bewertet werden. Die Erzeugung stumpfer Enden und die Ligationsreaktion im HI-C-Verfahren erzeugen Restriktionsstellen für das Endonuklease in HE eins; amplifizierte Fragmente aus den 3C- und Hi-C-Bibliotheken können mit HindIII und NheI digeriert werden, um zu bestimmen, wie gut die stumpfen Enden gebildet wurden. Einige Fragmente werden nicht ligiert worden sein. Entfernen Sie Biotin von diesen nicht ligierten Enden mithilfe der Exonuklease-Aktivität der T4-DNA-Polymerase, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.Reinigen Sie die DNA erneut mittels Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation und lösen Sie die DNA-Präzipitate in einem Gesamtvolumen von 100 µL Wasser auf. Wenn die Probe die Qualitätskontrollanalysen bestanden hat, folgen als nächstes Biotin-Markierung und Sequenzierung. Vielen Dank.Um die BIOTINLIERTE DNA für die Hochdurchsatzsequenzierung geeignet zu machen, muss die DNA mit einem CAVAS S two-Gerät auf eine Größe von 300 bis 500 Basenpaaren fragmentiert werden. Die DNA-Enden werden repariert, indem 10× Ligationspuffer, dNTPs, T4-DNA-Polymerase, T4-Polynukleotidkinase, Klenow-DNA-Polymerase und Wasser hinzugefügt werden; anschließend werden die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wird die DNA mithilfe einer Kaya Gym MinLu-Säule gemäß den Herstellerempfehlungen gereinigt. Nach dem Auftragen der DNA auf die Säule und dem Waschen der Säule wird die DNA zweimal mit jeweils 50 Mikrolitern 1×TE-Puffer eluiert. Anschließend wird dATP an das 3'-Ende der reparierten DNA angehängt, indem 10×NEB-Puffer, dATP, Wasser und ein exonuklease-defizientes Klenow-Fragment hinzugefügt werden.Die Reaktion 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um das cile-Fragment zu inaktivieren. Die Reaktionen 20 Minuten bei 65 Grad Celsius inkubieren und anschließend die Reaktionen auf Eis abkühlen, dabei unter Verwendung eines Speed-Vacs die Reaktionsvolumina auf 20 Mikroliter reduzieren. Danach die DNA in ein 1,5 %iges Aris-Gel mit 1×TAE laden und 3,5 Stunden bei 80 bis 90 laufen lassen.Verschneiden Sie DNA-Fragmente zwischen 300 und 500 Basenpaaren aus und reinigen Sie diese mit einem Qiagen-Gel-Extraktionskit unter Verwendung von zwei bis vier Säulen, abhängig vom Gewicht des Gels. Kombinieren Sie die gelben Achte aus den Kayak-Quick-Säulen und stellen Sie das Endvolumen mit 1x TLE-Puffer auf 300 Mikroliter ein. Bestimmen Sie abschließend die DNA-Konzentration mit dem QU-Assay unter Verwendung des Qubit und berechnen Sie die Gesamtmenge an DNA in diesem Abschnitt des Protokolls.Ligationsverbindungen werden aus dem DNA-Pool gereinigt, was eine effiziente Identifizierung wechselwirkender Chromatinfragmente durch Paired-End-Sequenzierung ermöglicht. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in DNA-Low-Bind-Röhrchen durch. Bereiten Sie die Kügelchen für Biotin vor.Zentrifugieren Sie durch zweimaliges Waschen von 150&nbsp;Mikrolitern resuspendierten magnetischen Streptavidin-A-Kügelchen mit jeweils 400&nbsp;Mikrolitern 1×-Tween-Puffer. Diese zukünftigen Waschschritte bestehen aus fünf Schritten: Zugabe von Puffer zu den Kügelchen, Übertragung der Mischung in ein neues Röhrchen, Rotation der Probe drei Minuten bei Raumtemperatur und Rückgewinnung der Kügelchen mithilfe eines magnetischen Partikelkonzentrators.Ich entferne die supinaten Reagenzien. Verrühren Sie die Kügelchen in 300 Mikrolitern 2x-Puffer ohne Tween und mischen Sie sie mit 300 Mikrolitern hochkonzentrierter cDNA. Lassen Sie die biotinylierte hochkonzentrierte cDNA an die Streptavidin-Kügelchen binden, indem Sie das Gemisch 15 Minuten bei Raumtemperatur unter Rotation inkubieren.Stellen Sie die an die Strp A-Kügelchen gebundene DNA mit einem magnetischen Partikelkonzentrator wieder her und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen mit 400 Mikrolitern eines 1×-No-Tween-Puffers, gefolgt von 100 Mikrolitern eines 1×-Ligationspuffers. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern eines 1×-Ligationspuffers und überführen Sie die Mischung in ein neues Röhrchen.Um die DNA für die Illumina-Paar-End-Sequenzierung vorzubereiten, nehmen Sie die Gesamtmenge der eingesetzten DNA, die zuvor mithilfe des Quantifizierungs-Assays berechnet wurde, und teilen diese durch 20, um die Menge an hochwertiger cDNA abzuschätzen, die angereichert wurde und für die Ligation zur Verfügung steht. Geben Sie sechs P OLS der Illumina-Paar-End-Adapter pro Mikrogramm an verfügbarer hochwertiger cDNA zu. Verwenden Sie 1.200 Einheiten T4-DNA-Ligase, um die Adapter an die DNA zu ligieren.Die Probe zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Nicht ligierte Paired-End-Adapter entfernen, indem die hochgradig cDNA-gebundenen Perlen gewonnen und zweimal mit 400 µL 1x Tween-Puffer gewaschen werden. Die Perlen anschließend mit 200 µL 1x Puffer ohne Tween waschen, gefolgt von 200 µL und danach 50 µL 1x NEB-Puffer.Zwei nach der letzten Waschung. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern Puffer NEB zwei und überführen Sie sie in ein neues Röhrchen. Um die Anzahl der Zyklen zu bestimmen, die notwendig sind, um ausreichend PCR-Produkt für die Sequenzierung zu erzeugen.Richten Sie vier Test-PCR-Reaktionen mit 6, 9, 12 oder 15 Zyklen ein. Bestimmen Sie die optimale Zykluszahl, indem Sie die PCR-Reaktionen auf einem 5 Cent großen Polyacrylamidgel laufen lassen und mit Cyber Green färben, wobei darauf zu achten ist, dass keine unspezifischen Banden sichtbar sind und ein Smear zwischen 400 und 600 Basenpaaren vorhanden ist, was der Länge der gemeinsamen Produkte nach Ligierung an die Adapter entspricht. Amplifizieren Sie den Rest der High-C-Bibliothek der runden, streptavidin-gebundenen DNA im großen Maßstab mittels PCR mit der optimalen Anzahl an PCR-Zyklen. Gewinnen Sie die PCR-Produkte aus den separaten Vertiefungen und gewinnen Sie die Beads zurück.Behalten Sie 1 % der PCR-Produkte im größeren Maßstab separat, um sie auf einem Gel laufen zu lassen, und reinigen Sie den Rest der PCR-Produkte mit 1,8-fachem Volumen und reinen Böden gemäß den Herstellerempfehlungen. Eluieren Sie die DNA mit 50 Mikrolitern eines XTLE-Puffers und vergleichen Sie 1 % des mit PU-Böden gereinigten PCR-Produkts mit der 1 %-Aliquot der ursprünglichen PCR-Produkte auf einem 5 %igen Polyacrylamid-Gel. Um die erfolgreiche Entfernung der PCR-Primer-Sequenz sicherzustellen, wird die High-C-Bibliothek mit Illumina-Paired-End-Sequenzierung verwendet, wobei jedes Ende unabhängig mit MAC ausgerichtet wird, um interagierende Chromatinfragmente zu identifizieren. Die folgenden Ergebnisse sind zu erwarten, wenn das High-C-Protokoll fachgerecht durchgeführt wird, und können als Qualitätskontrollstandards angesehen werden. Bei den Qualitätskontrollen sollte sich zeigen, dass sowohl die 3C- als auch die High-C-Bibliotheken als relativ scharfe Banden größer als 10 Kilobasen laufen. Ein DNA-Schmierband weist auf eine geringe Ligationswirksamkeit hin.Typischerweise ist die Ligations-Effizienz in einer High-C-Bibliothek geringfügig niedriger im Vergleich zu einer Three-C-Vorlage. Die Markierung mit High-C und die Ligations-Effizienz können durch den Verdau eines Three-C-PCR-Produkts abgeschätzt werden. Three-C-Übergänge werden durch Hindi drei geschnitten und nicht durch NHE eins.Umgekehrt verhält es sich bei High-C-Verbindungsstellen. Dieser PCR-Digest-Assay zeigt, dass 70 % der High-C-Amplicons von NHE1 geschnitten werden, nicht jedoch von HindIII. Drei. Zur Bestätigung einer effizienten Markierung der Ligationsverbindungsstellen sollte die Analyse der sequenzierten Reads zeigen, dass Reads sowohl aus intrachromosomalen als auch aus interchromosomalen Interaktionen – gekennzeichnet durch die blauen und roten Linien – signifikant näher an den HindIII-Restriktionsstellen liegen im Vergleich zu zufällig generierten Reads, die in grün dargestellt sind.Bei einem erfolgreichen Experiment repräsentieren 55 % der zuordenbaren Read-Paare interchromosomale Interaktionen. 15 % stellen intrachromosomale Interaktionen zwischen Fragmenten dar, die weniger als 20 Kilobasen voneinander entfernt sind, und 30 % sind intrachromosomale Read-Paare, die mehr als 20 Kilobasen voneinander entfernt liegen. Diese Verteilung kann vor der Hochdurchsatzsequenzierung als eine Form der Qualitätskontrolle abgetastet werden.Klonierung und Sanger-Sequenzierung von etwa 100 Klonen sind in der Regel ausreichend. Die Chromatin-Interaktionen können als Wärmekarte dargestellt werden, wobei die x- und y-Achse die genomische Reihenfolge niedriger Signale repräsentieren und jedes Pixel die Anzahl beobachteter Interaktionen zwischen ihnen angibt. Typischerweise weisen DNA-Fragmente, die im linearen Genom sehr nahe beieinander liegen, die Tendenz auf, häufig miteinander zu interagieren.Das zeigt sich in den Intra-Chromosomen- oder Wärmekarten als hervorstechende Diagonale. Die folgenden Ergebnisse zeigen unterschiedliche Methoden zur Analyse der Daten, um verschiedene Organisationsebenen des Genoms aufzudecken. Die Auftragung der Kontaktwahrscheinlichkeit gegen die genomische Distanz zeigt, dass die Wahrscheinlichkeit eines Kontakts mit zunehmender genomischer Distanz abnimmt und schließlich bei jeder Distanz ein Plateau erreicht.Intra-chromosomale Wechselwirkungen, die durch durchgezogene Linien dargestellt sind, sind im Vergleich zu inter-chromosomalen Wechselwirkungen, die durch gestrichelte Linien repräsentiert werden, angereichert. Dies deutet direkt auf die Existenz von Chromosomenbereichen hin. Die Berechnung der beobachteten gegenüber der erwarteten Anzahl an inter-chromosomalen Kontakten zwischen allen Chromosomenpaaren zeigt eine bevorzugte Assoziation zwischen bestimmten Chromosomenpaaren. Kleinere, genreichere Chromosomen wechselwirken bevorzugt miteinander, was durch die leuchtend rote Farbe angezeigt wird.Einzelne Chromosomen können ebenfalls untersucht werden. Die rohe Heatmap kann mithilfe einer erwarteten Heatmap angepasst werden, um den genomischen Abstand zwischen Paaren von Loci zu berücksichtigen, was zu einer „beobachtet-zu-erwartet“-Heatmap führt. Anschließend kann eine Korrelationsmatrix erstellt werden, indem die Zeilen und Spalten der beobachtet-zu-erwartet-Heatmaps miteinander korreliert werden.Mithilfe der Korrelationsanalyse wurde gezeigt, dass das menschliche Genom in zwei Kompartimente segregiert. Dies wird durch das Karomuster veranschaulicht. In den Korrelations-Heatmaps unter Verwendung von Hoch-C-Daten wurden neue Erkenntnisse zur Chromatin-Faltung im Megabase-Maßstab gewonnen.Ein gewöhnliches Polymermodell der Chromatinverpackung würde nahelegen, dass sich Chromatin in ein Gleichgewichts-GLO packt. Die Darstellung der Kontaktwahrscheinlichkeit als Funktion der Distanz veranschaulicht, dass die Kontaktwahrscheinlichkeit nach einem Potenzgesetz mit der genomischen Distanz skaliert, wobei die Steigung etwa minus eins beträgt. Dies stimmt nicht mit dem Verhalten eines Gleichgewichts-GLO überein, entspricht jedoch den Erwartungen für eine alternative Struktur, die als fraktales GLO bekannt ist. Hier werden zwei regelmäßige Strukturen gezeigt.Die Färbung entspricht dem Abstand von einem Endpunkt, der von blau über cyanfarbenes Grün, Gelb, Orange bis Rot reicht. Und wie bei Gleichgewichts-Globulen weisen fraktale Globulen in einem fraktalen Glo keine Verschlingungen auf. Loci, die entlang der Kontur nahe beieinander liegen, befinden sich tendenziell auch im dreidimensionalen Raum nahe beieinander, was zur Bildung monochromatischer Blöcke führt.Derartige Blöcke kommen im Gleichgewichts-Glo nicht vor. Das Fehlen von Verhakungen kann auch gezeigt werden, indem man die Kraft entfernt, die die Globuli einschränkt, und die Globuli erlaubt, sich auszudehnen – das fraktale Glo dekondensiert dann rasch. Das Gleichgewichts-Glo hingegen nicht, da es zu stark verknotet ist.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man eine High-C-Bibliothek herstellt. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, die geeigneten Kontrollen durchzuführen, um eine effiziente High-C-Ligation und Reinigung sicherzustellen. Die Anzahl der Reads bestimmt letztendlich die Auflösung der Interaktionskarten.Wir haben etwa 30 Millionen Reads verwendet, um Interaktionskarten des menschlichen Genoms mit einer Auflösung von etwa einem Megabase-Paar zu erstellen. Um die Auflösung um einen Faktor N zu erhöhen, muss die Anzahl der Reads um einen Faktor N-Quadrat erhöht werden. Ich hoffe, Ihnen gefällt das Lernen über die Struktur des menschlichen Genoms.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

hi-c-a-method-to-study-the-three-dimensional-architecture-of-genomes

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die 3DNA Softwarepaket ist eine beliebte und vielseitige Bioinformatik-Tool mit Funktionen zu analysieren, zu konstruieren, zu visualisieren und dreidimensionale Strukturen Nukleinsäure. Dieser Artikel stellt ausführliche Protokolle für eine Teilmenge der neue und beliebte Features, die in 3DNA, für beide einzelnen Strukturen und Ensembles von verwandten Strukturen.

Analysieren und Bauen Nukleinsäurestrukturen mit 3DNA

Wir beschreiben eine robuste und vielseitige Protokoll zur Analyse von 3D-Kern Architektur DNA FISH mit direkt markierten fluoreszierenden Sonden.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Erzeugung von hoher Auflösung in Situ Hi-C-Bibliotheken von dicht vor Gastrulation Drosophila Melanogaster inszeniert Embryonen.

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

3D-Mehrfarben-DNA-FISH stellt ein Werkzeug dar, um mehrere genomische Loci innerhalb von 3D-konservierten Kernen zu visualisieren und ihre wechselseitigen Wechselwirkungen und Lokalisierungen innerhalb des Kernraums auf einer einzigen Zellebene eindeutig zu definieren. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für ein breites Spektrum menschlicher Primärzellen beschrieben.

3D Multicolor DNA FISH Tool zur Erforschung der Kernarchitektur in menschlichen Primärzellen

Das Genom ist im Kernraum in verschiedene Strukturen organisiert, die durch Chromosomenkonformationserfassungstechnologien aufgedeckt werden können. Die In-Nucleus-Hi-C-Methode liefert eine genomweite Sammlung von Chromatin-Interaktionen in Drosophila-Zelllinien, die Kontaktkarten generiert, die mit Megabasenauflösung auf Restriktionsfragmentebene untersucht werden können.

In-Nucleus Hi-C in Drosophila-Zellen

Hi-C 3.0 ist ein verbessertes Hi-C-Protokoll, das Formaldehyd- und Disuccinimidylglutarat-Vernetzer mit einem Cocktail aus DpnII- und DdeI-Restriktionsenzymen kombiniert, um das Signal-Rausch-Verhältnis und die Auflösung der Chromatin-Interaktionsdetektion zu erhöhen.

Erfassung der Chromosomenkonformation über Längenskalen hinweg

Dieses Protokoll beschreibt die Capture Hi-C-Methode, die verwendet wird, um die 3D-Organisation von megabasierten Zielgenomregionen mit hoher Auflösung zu charakterisieren, einschließlich der Grenzen topologisch assoziierender Domänen (TADs) und langreichweitiger Chromatininteraktionen zwischen regulatorischen und anderen DNA-Sequenzelementen.

Entschlüsselung der hochauflösenden 3D-Chromatinorganisation über Capture Hi-C

Ein Protokoll zur Kartierung der dreidimensionalen Genomorganisation mit Nukleosomenauflösung unter Verwendung der genomweiten Chromosomenkonformationserfassungsmethode Micro-C-XL wird hier vorgestellt.

Kartierung von 3D-Genominteraktionen von Säugetieren mit Micro-C-XL

Hier stellen wir eine Adaption der Technik zur Erfassung der Chromosomenkonformation (3C) im Detail vor, wobei der Schwerpunkt auf der Beteiligung und dem Lernen von Studenten liegt.

Eine Eins mit den 3Cs bekommen: Erfassung der Chromosomenkonformation für Studenten

Die Genexpression wird durch Wechselwirkungen von Genpromotoren mit distalen regulatorischen Elementen reguliert. In dieser Arbeit beschreiben wir, wie Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) die Identifizierung dieser Interaktionen in seltenen Zelltypen ermöglicht, die bisher nicht messbar waren.

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erfassung RNA-assoziierter Chromatin-DNA-Interaktionen zur Kartierung der RNA-bezogenen dreidimensionalen Genomorganisation.

RNA-assoziierte Chromatin-DNA-Interaktionsmethode

Erfahren Sie die Hi-C-Methode zur Analyse dreidimensionaler Chromatin-Interaktionen und genomischer Architektur. Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Chromosomenterritorien und Kompartimenten.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

Weitere Videos entdecken