Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

Hi.C ist eine Methode zur Identifizierung von Chromatin-Wechselwirkungen mit großer Reichweite in einer unvoreingenommenen genomweiten Weise. Zuerst werden Zellen mit Formaldehyd fixiert, Zellen lysiert und anschließend die DNA mit einem Restriktionsenzym fragmentiert. Als nächstes wird ein biotinylierter Rest eingebaut, indem die fünf Prime-Überhänge stumpf gefüllt werden und die Ligation unter verdünnten Bedingungen durchgeführt wird, die Ligationsereignisse zwischen Vernetzungen, DNA-Fragmenten, begünstigen.

Die Bibliothek wird geschert und die Verbindungsstellen werden mit Streptokokken-Havein-Perlen nach unten gezogen. Die aufgereinigten Übergänge können anschließend mit einem Hochdurchsatz-Sequenzer analysiert werden, was zu einem Katalog wechselwirkender Fragmente führt. Diese Ergebnisse geben uns Einblicke in die Faltung des Chromatins, zeigen das Vorhandensein von Chromosomenterritorien, die Kompartimentierung des Genoms in offenem und geschlossenem ch-Chromatin und Hinweise auf die fraktale Glo-Organisation auf der Megabasenskala.

Hallo, ich bin Nka Van Bergham vom Laboratory Field Decker im Programm für Genfunktion und -expression an der University of Massachusetts Medical School. Hallo, ich bin Ez Lieberman Aiden vom Labor von Eric Lander am Broad Institute of Harvard und am Massachusetts Institute of Technology. Ich bin Louis Williams von der Forschungs- und Entwicklungsgruppe für Molekularbiologie am Broad Institute und dann Maxima Mackay aus dem Labor von Len Muni vom Massachusetts Institute of Technology.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur genomweiten Erfassung von Chromosomen, das als hohes C bezeichnet wird und das wir in unserem Labor anwenden, um die Architektur des menschlichen Genoms experimentell zu erforschen. Der erste Teil des Verfahrens, den wir Ihnen zeigen werden, findet an der UMass Medical School statt und der zweite Teil wird am Prude Institute durchgeführt. Wir zeigen Ihnen auch, wie wir die Ergebnisse des Experiments mit hohem C verwendet haben, um die Dynamik des Genoms am MIT zu simulieren.

Also lasst uns loslegen. Also, fangen wir an. Hi C beginnt mit der Vernetzung von Zellen, was eine gängige Methode bei der Erfassung von Chromosomen ist.

Zu Beginn wachsen zwischen zwei mal 10 zu den sieben und 2,5 mal 10 zu den sieben Säugetierzellen, entweder ein Durant oder in Suspension und Vernetzung der Zellen liegen die Zellen in 550 Mikrolitern Lysepuffer mit Homogenisator. Schleudern Sie das Chromatin bei 5.000 U/min und waschen Sie das Pellet zweimal mit 500 Mikrolitern NEB-Puffer zwei qu in fünf nummerierte Röhrchen und fügen Sie einen beliebigen B-Puffer hinzu. Zwei auf ein Endvolumen von 362 Mikrolitern.

Fügen Sie 38 Mikroliter 1% SDS hinzu, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Legen Sie die Röhrchen sofort wieder auf Eis und löschen Sie das SDS, indem Sie 44 Mikroliter Triton X 100 hinzufügen, sorgfältig mit 400 Einheiten Hindi drei mischen, und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren, während Sie rotieren. Die nächsten Schritte sind spezifisch für hohe C-Werte und umfassen die Markierung der DNA-Enden mit Biotin und die Durchführung einer stumpfen Endligatur von vernetzten Fragmenten.

Dieser Schritt ermöglicht die Reinigung von Ligationsübergängen im späteren Röhrchen. Man sollte sich nicht dem Biotin-Elationsschritt unterziehen und stattdessen als Drei-C-Kontrolle dienen, um sicherzustellen, dass die Verdauungs- und Ligaturbedingungen optimal sind, um die Überhänge des Restriktionsfragments zu füllen und die DNA in den verbleibenden vier Röhrchen zu markieren. Geben Sie D-A-T-P-D-G-T-P und DTTP in die Röhrchen zwei bis fünf.

Fügen Sie auch Biotin, hochatmiges DCTP und Klino hinzu. Vorsichtig mischen und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Legen Sie die Röhrchen nach der Inkubation auf Eis und geben Sie dann 86 Mikroliter 10 % SDS in alle Röhrchen, um die Enzyme zu inaktivieren.

Inkubieren Sie die Röhrchen bei 65 Grad Celsius genau 30 Minuten lang und legen Sie sie direkt danach auf Eis. Um Ligationsereignisse zwischen vernetzten Fragmenten zu begünstigen, wird die Ligation unter extrem verdünnten Bedingungen durchgeführt. Bei der Arbeit auf Eis geben Sie 7,61 Milliliter Ligaturmischung in jedes der fünf 15-Milliliter-Röhrchen.

Übertragen Sie dann jedes verdaute Chromatingemisch in das entsprechende Röhrchen. Geben Sie 10 Mikroliter T-4-DNA-Ligase in das erste Röhrchen, um eine reguläre Drei-C-Ligation durchzuführen. Geben Sie dann 50 Mikroliter T-vier-DNA-Ligase in die Röhrchen zwei bis fünf, um eine stumpfe C-Ligation mit hohem Ende durchzuführen.

Mischen Sie die Röhrchen, indem Sie sie umdrehen, und inkubieren Sie sie vier Stunden lang bei 16 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird das Protein abgebaut und die CNA-Vernetzung umgekehrt, indem 50 Mikroliter Proteinase K pro Röhrchen hinzugefügt und die Röhrchen über Nacht bei 65 Grad Celsius inkubiert werden. Fügen Sie am nächsten Tag weitere 50 Mikroliter Proteinase K pro Röhrchen hinzu und inkubieren Sie weitere zwei Stunden lang bei 65 Grad Celsius.

Rufen Sie die Reaktionsgemische auf und überführen Sie sie auf fünf 50 Milliliter bis konische Röhrchen. Reinigen Sie die DNA in diesen Röhrchen, indem Sie eine Phenolextraktion durchführen. Fügen Sie 10 Milliliter Phenol hinzu und wirbeln Sie zwei Minuten lang.

Schleudern Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 3.500 U/min und übertragen Sie vorsichtig so viel wässrige Phase wie möglich auf ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Wiederholen Sie die Extraktion mit Phenolchloroform und fällen Sie die DNA mit Ethanol aus. Nach der Zentrifugation der mit Ethanol gefällten DNA wird jedes DNA-Pellet in 450 Mikrolitern eines XTE-Puffers aufgelöst und in ein 1,7-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Eine weitere Reinigungsrunde wird durchgeführt, indem zwei Phenol-Chloroform-Extraktionen bei 500 Mikrolitern Phenol, Chloroform und Vortex für eine Minute durchgeführt werden, fünf Minuten lang bei 14.000 U/min in die Röhrchen zentrifugiert und die wässrige Phase nach der zweiten Extraktion in ein neues Röhrchen überführt wird.

Die DNA ist Ethanol, das nach dem Schleudern der gefällten DNA ausgefällt wird, jedes DNA-Pellet wird einmal mit 70 % Ethanol gewaschen und dann in 25 Mikrolitern eines XT-Puffers resuspendiert. Bauen Sie eventuell vorhandene RNA ab, indem Sie einen Mikroliter RNAs pro Röhrchen hinzufügen und die Röhrchen 30 Minuten lang inkubieren. Bei 37 Grad Celsius. Ziehen Sie den hohen C-Gehalt der Röhrchen zwei bis fünf und halten Sie das Röhrchen immer noch getrennt als einen Drei-C-Regler.

Jetzt ist ein guter Zeitpunkt, um die Quantität und Qualität der Bibliotheken zu untersuchen, indem ein Aliquot in einem 0,8%-AASE-Gel durchgeführt wird, das die Ligationseffizienz von HI C markiert, sollte mit einem PCR-Digest-Assay bewertet werden. Die Erzeugung und Ligation des stumpfen Endes im HI-C-Verfahren schafft Restriktionsstellen für die Endonuklease in HE eins: amplifizierte Fragmente aus den drei C- und High-C-Bibliotheken können mit Hindi drei und NHE one verdaut werden, um zu bestimmen, wie gut die stumpfen Enden erzeugt wurden, und einige Fragmente wurden nicht ligiert. Entfernen Sie Biotin von diesen unligierten Enden unter Verwendung der Exon-Nukleaseaktivität der T-4-DNA-Polymerase, wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben.

Reinigen Sie die DNA erneut mit Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung und resuspendieren Sie die DNA-Pellets in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern Wasser. Wenn die Probe die Qualitätskontrollassays bestanden hat, wird das Protokoll mit dem Bio-Timple-Down und der Sequenzierung fortgesetzt. Vielen Dank.

Um die BIOTINYLIERTE DNA für die Hochdurchsatz-Sequenzierung geeignet zu machen, muss die DNA mit einem CAVAS S two-Gerät auf eine Größe von 300 bis 500 Basenpaaren geteilt werden. Die she-DNS werden durch Zugabe von 10 x Lationspuffer, DN TPS T, vier DNA-Polymerase T, vier POLYNUKLEOTIDKINASE, klarer DNA-Polymerase und Wasser repariert, inkubieren Sie die Proben nach der Inkubation 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, verwenden Sie eine Kaya Gym MinLu-Säule, um die DNA gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu reinigen. Nachdem Sie die DNA auf die Säule geladen und die Säule gewaschen haben, eluieren Sie die DNA zweimal mit 50 Mikrolitern eines XTLE-Puffers, dann binden Sie DATP an die drei Promen der endreparierten DNA, indem Sie 10 XNEB-Puffer, zwei DATP-Wasser und ein Exonuklease-defizientes Cile-Fragment hinzufügen.

Inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um das Cil-Fragment zu inaktivieren. Inkubieren Sie die Reaktionen 20 Minuten lang bei 65 Grad Celsius und rufen Sie die Reaktionen anschließend mit einem Speed-Vac auf Eis auf, reduzieren Sie das Reaktionsvolumen auf 20 Mikroliter. Laden Sie als Nächstes die DNA in ein 1,5%iges Aris-Gel mit einem XTAE und lassen Sie es 3,5 Stunden lang bei 80 bis 90 laufen.

Vols schneidet DNA-Fragmente zwischen 300 und 500 Basenpaaren heraus und reinigt sie mit einem Qiagen-Gel-Extraktionskit mit zwei bis vier Säulen, je nach Gewicht des Gels. Kombinieren Sie die gelben Achten aus den Kajak-Schnellspalten und bringen Sie das Endvolumen mit einem XTLE-Puffer auf 300 Mikroliter. Bestimmen Sie abschließend die DNA-Konzentration mit dem QU-Assay unter Verwendung des Qubits und berechnen Sie die Gesamtmenge an DNA in diesem Abschnitt des Protokolls.

Ligationsübergänge werden aus dem DNA-Pool aufgereinigt, was eine effiziente Identifizierung von interagierenden Chromatinfragmenten durch Paarendsequenzierung ermöglicht. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in DNA-Röhrchen mit geringer Bindung durch. Kügelchen für Biotin vorbereiten.

Ziehen Sie es nach unten, indem Sie 150 Mikroliter resuspendierte magnetische Streptokokken A zweimal mit 400 Mikrolitern eines x Tween-Puffers in Kügelchen waschen. Diese Waschvorgänge bestehen in Zukunft aus fünf Schritten, bei denen die Kügelchen mit Puffer versehen, die Mischung in ein neues Röhrchen umgefüllt und die Probe drei Minuten lang bei Raumtemperatur gedreht wird. Rückgewinnung der Kügelchen mit einem Magnetpulverkonzentrator.

Ich entferne den Supinat-Reus. Biegen Sie die Kügelchen in 300 Mikroliter von zwei x ohne Tween-Puffer und kombinieren Sie sie mit 300 Mikrolitern hohem CDNA. Lassen Sie das mit Biotin markierte hohe CDNA-Gehalt an die Streptokokken-Din-Kügelchen binden, indem Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Rotation inkubieren.

Das DNA-gebundene strp A wird mit einem Magnetpulverkonzentrator in den Kügelchen zurückgewonnen und der Überstand entfernt. Waschen Sie die Kügelchen mit 400 Mikrolitern eines x no Tween-Puffers, gefolgt von 100 Mikrolitern eines x Ligation. Puffer. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern eines x Ligationspuffers und überführen Sie die Mischung in ein neues Röhrchen.

Um die DNA für die Illumina-Kopplung in der Sequenzierung vorzubereiten, nehmen Sie die Gesamtmenge der DNA-Eingabe des Benutzers für den Biotin-Pulldown, die zuvor mit dem Quant-Assay berechnet wurde, und dividieren Sie sie durch 20, um die Menge an hoher CDNA zu schätzen, die abgezogen wurde und für die Ligation zur Verfügung steht. Fügen Sie sechs P-OLS von Illumina gepaart und Adapter pro Mikrogramm mit hohem CDNA-Gehalt hinzu, die für die Ligation verfügbar sind. Verwenden Sie 1.200 Einheiten der T-Vier-DNA-Ligase, um die Adapter an die DNA zu ligieren.

Inkubieren Sie die zwei Stunden bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nicht ligierte gepaarte Endadapter, indem Sie die stark CDNA-gebundenen Kügelchen zurückgewinnen und die Kügelchen zweimal mit 400 Mikrolitern eines x Tween-Puffers waschen. Waschen Sie die Kügelchen mit 200 Mikrolitern eines x, ohne Tween-Puffer, gefolgt von 200 Mikrolitern und dann 50 Mikrolitern eines XNEB-Puffers.

Zwei nach der letzten Wäsche. Die Kügelchen in 50 Mikrolitern eines NEB-Puffers und zwei resuspendieren und in ein neues Röhrchen umfüllen. Bestimmung der Anzahl der Zyklen, die erforderlich sind, um genügend PCR-Produkt für die Sequenzierung zu generieren.

Richten Sie vier Test-PCR-Reaktionen mit 6, 9, 12 oder 15 Zyklen ein. Bestimmen Sie die optimale Zykluszahl, indem Sie die PCR-Reaktionen auf einem 5-Cent-Polyacrylamid-Gel durchführen und mit Cybergrün färben, wobei sichergestellt wird, dass keine Störbanden vorhanden sind und dass zwischen 400 600 Basenpaaren ein Abstrich vorhanden ist, was der Länge der gemeinsam genutzten Produkte nach der Ligation zu den Adaptern entspricht, und den Rest der hohen C-Bibliothek rundgestrippt amplifizieren. haben in Kügelchen in einer PCR im großen Maßstab mit der optimalen Anzahl von PCR-Zyklen. Ziehen Sie die PCR-Produkte aus den separaten Vertiefungen und gewinnen Sie die Kügelchen zurück.

Bewahren Sie 1 % der PCR-Produkte in großem Maßstab getrennt auf, um sie auf einem Gel laufen zu lassen, und reinigen Sie den Rest des PCR-Produkts mit dem 1,8-fachen Volumen und reinen Kügelchen gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Eluieren Sie die DNA mit 50 Mikrolitern eines XTLE-Puffers und vergleichen Sie 1 % des gereinigten PCR-Produkts mit 1 % des ursprünglichen PCR-Produkts auf einem 5 %igen Polyacrylamid-Gel. Um die erfolgreiche Entfernung der PCR-Primer-Sequenz zu gewährleisten, richtet die High-C-Bibliothek mit Illumina-Paarendsequenzierung jedes Ende unabhängig voneinander mithilfe von MAC aus, um interagierende Chromatinfragmente zu identifizieren.

Die folgenden Ergebnisse sind zu erwarten, wenn das High-C-Protokoll technisch gut ausgeführt wird und als Qualitätskontrollstandard angesehen werden kann. Die Schritte der Qualitätskontrolle sollten zeigen, dass sowohl drei C- als auch High-C-Bibliotheken als ziemlich enge Banden verlaufen, die größer als 10 Kilo Basen sind. Ein DNA-Abstrich deutet auf eine schlechte Ligatureffizienz hin.

In der Regel ist die Ligationseffizienz in einer Bibliothek mit hohem C-Gehalt etwas geringer als in einem Drei-C-Template. Eine hohe C-Markierungs- und Ligationseffizienz kann durch den Aufschluss eines Produkts mit drei CPCR abgeschätzt werden. Drei C-Kreuzungen werden von Hindi drei und nicht von NHE eins geschnitten.

Umgekehrt gilt dies für hohe C-Übergänge. Dieser PCR-Digest-Assay zeigt, dass 70% der Amplikons mit hohem C-Gehalt mit NHE 1 und nicht mit HI Hindi geschnitten werden. Um die effiziente Markierung der Ligationsverbindungen zu bestätigen, sollte die Analyse der sequenzierten Reads zeigen, dass Reads sowohl aus intrachromosomalen als auch aus interchromosomalen Interaktionen, die durch die blauen und roten Linien gekennzeichnet sind, signifikant näher an den Hindi-3-Restriktionsstellen ausgerichtet sind, verglichen mit zufällig generierten Reads, die in grün dargestellt sind.

In einem erfolgreichen Experiment repräsentieren 55 % der alignablen Lesepaare interchromosomale Interaktionen, 15 % intrachromosomale Interaktionen zwischen Fragmenten, die weniger als 20 Kilobasen voneinander entfernt sind, und 30 % sind intrachromosomale Lesepaare, die mehr als 20 Kilobasen voneinander entfernt sind. Diese Verteilung kann vor der Hochdurchsatzsequenzierung als eine Form der Qualitätskontrolle entnommen werden.

Klonierung und Sanger-Sequenzierung von etwa 100 Klonen ist in der Regel ausreichend. Die Chromatin-Wechselwirkungen können als Heatmap visualisiert werden, wobei die x- und y-Achse die genomische Ordnung mit niedrigem Vorzeichen darstellen und jedes Pixel die Anzahl der beobachteten Wechselwirkungen zwischen ihnen darstellt. Typischerweise neigen DNA-Fragmente, die im linearen Genom sehr nahe beieinander liegen, dazu, häufig miteinander zu interagieren.

Dies ist in den Intrachromosomen- oder Heatmaps als markante Diagonale zu sehen. Die folgenden Ergebnisse zeigen verschiedene Möglichkeiten, die Daten zu analysieren, um verschiedene Ebenen des Genoms aufzudecken. Die Darstellung der Kontaktwahrscheinlichkeit im Vergleich zur genomischen Distanz zeigt, dass die Wahrscheinlichkeit eines Kontakts in Abhängigkeit von der genomischen Distanz abnimmt und schließlich bei jeder Entfernung ein Plateau erreicht.

Intrachromosomale Interaktionen, die in der durchgezogenen Linie dargestellt sind, sind im Verhältnis zu den interchromosomalen Wechselwirkungen, die durch die Strichlinien dargestellt werden, angereichert. Dies impliziert direkt das Vorhandensein von Chromosomenterritorien: Die Berechnung der beobachteten und erwarteten Anzahl des interchromosomalen Kontexts zwischen allen Chromosomenpaaren zeigt eine bevorzugte Assoziation zwischen bestimmten Chromosomenpaaren. Kleine genreiche Chromosomen interagieren bevorzugt miteinander, was durch die leuchtend rote Farbe gekennzeichnet ist.

Auch einzelne Chromosomen können untersucht werden. Die rohe Heatmap kann unter Verwendung einer erwarteten Heatmap angepasst werden, um den genomischen Abstand zwischen Paaren von Loci zu berücksichtigen, was zu einer beobachteten übererwarteten Heatmap führt. Dann kann eine Korrelationsmatrix erstellt werden, indem die Zeilen und Spalten der beobachteten Heatmaps über die erwarteten Heatmaps korreliert werden.

Mit Hilfe der Korrelationsanalyse konnte gezeigt werden, dass sich das menschliche Genom in zwei Kompartimente aufteilt. Dies wird durch das Karomuster verdeutlicht. In den Korrelations-Heatmaps mit Daten mit hohem C-Gehalt wurden neue Erkenntnisse über die Chromatinfaltung auf der Megabasenskala gewonnen.

Ein gewöhnliches Polymermodell der Chromatinpackung würde darauf hindeuten, dass das Chromatinpaket in ein Gleichgewicht GLO Die Darstellung der Kontaktwahrscheinlichkeit ist eine Funktion der Entfernung zeigt, dass die Kontaktwahrscheinlichkeit als Potenzgesetz mit der genomischen Distanz skaliert, deren Steigung ungefähr minus eins ist. Dies ist nicht konsistent mit dem Verhalten eines Gleichgewichts-Glo, entspricht aber den Erwartungen an eine alternative Struktur, die als fraktales Glo bekannt ist. Hier sind zwei gulare Strukturen dargestellt.

Die Färbung entspricht der Entfernung von einem Endpunkt und reicht von Blau bis Cyangrün, Gelb, Orange und Rot. Und wie Gleichgewichtskügelchen fehlen fraktale Kügelchen Verschränkungen in einem fraktalen Glo. Loci in der Nähe entlang der Kontur neigen dazu, in 3D nahe zu sein, was zum Vorhandensein von monochromatischen Blöcken führt.

Solche Blöcke sind im Gleichgewicht Glo nicht zu finden. Das Fehlen von Verschränkungen kann auch demonstriert werden, indem die Kraft, die die Kügelchen einhält, entfernt wird und die Kügelchen sich ausdehnen können. Während das Gleichgewicht Glo dies nicht tut, weil es zu verknotet ist.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie eine High-C-Bibliothek für einen Analysator erstellen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die richtigen Kontrollen durchzuführen, um eine effiziente Ligatur und Reinigung mit hohem C-Gehalt zu gewährleisten. Die Anzahl der Lesevorgänge bestimmt letztendlich die Auflösung der Interaktionskarten.

Wir haben etwa 30 Millionen Reads verwendet, um Interaktionskarten des menschlichen Genoms mit einer Auflösung von etwa einer Megabase zu erstellen. Um die Auflösung um den Faktor N zu erhöhen, muss die Anzahl der Lesevorgänge um den Faktor n zum Quadrat erhöht werden. Ich wünsche Ihnen viel Spaß beim Lernen über die Struktur des menschlichen Genoms.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.