Nachweis von Fischpathogenen mittels Variable Number Tandem Repeat (VNTR)-Analyse

Beginnen Sie mit einer PCR-Platte, die eine formamidbasierte Denaturierungslösung enthält.

Fügen Sie die verdünnten PCR-Amplicons, die von einem fischpathogenen Bakterium gewonnen werden, in jedes Bohrloch ein.

Diese Amplikone enthalten fluoreszierend markierte Variablen-Tandem-Wiederholungen (VNTRs), kurze, sich wiederholende Sequenzen, die als genetische Marker zur bakteriellen Identifikation dienen.

Versiegeln Sie die Platte und Zentrifuge, um Luftblasen zu vermeiden.

Erhitze die Platte in einem thermischen Zyklus, um die doppelsträngigen VNTRs zu denaturieren.

Formamid verbessert die Fasertrennung und hemmt die Wiederannealing.

Kühlen Sie die Platte schnell ab, um die einsträngige DNA zu stabilisieren.

Zentrifuge, um das Probenvolumen zu sammeln.

Entfernen Sie die Dichtung und sichern Sie die Platte mit einem Rahmen.

Setzen Sie die Kapillarröhre ein und führen Sie eine Kapillarelektrophorese durch.

Während der Elektrophorese wandern VNTR-Fragmente unter einem elektrischen Feld durch die Kapillare und trennen sich nach Größe.

Ein Laser regt die fluoreszierenden Tags an jedem Fragment an und erzeugt farbcodierte Signale.

Das resultierende Elektropherogramm zeigt VNTR-Peakmuster, die dem path