Nachweis von Fischpathogenen mittels Variable Number Tandem Repeat (VNTR)-Analyse

Beginnen Sie mit einer PCR-Platte, die eine formamidbasierte Denaturierungslösung enthält.

Fügen Sie die verdünnten PCR-Amplicons, die von einem fischpathogenen Bakterium gewonnen werden, in jedes Bohrloch ein.

Diese Amplikone enthalten fluoreszierend markierte Variablen-Tandem-Wiederholungen (VNTRs), kurze, sich wiederholende Sequenzen, die als genetische Marker zur bakteriellen Identifikation dienen.

Versiegeln Sie die Platte und Zentrifuge, um Luftblasen zu vermeiden.

Erhitze die Platte in einem thermischen Zyklus, um die doppelsträngigen VNTRs zu denaturieren.

Formamid verbessert die Fasertrennung und hemmt die Wiederannealing.

Kühlen Sie die Platte schnell ab, um die einsträngige DNA zu stabilisieren.

Zentrifuge, um das Probenvolumen zu sammeln.

Entfernen Sie die Dichtung und sichern Sie die Platte mit einem Rahmen.

Setzen Sie die Kapillarröhre ein und führen Sie eine Kapillarelektrophorese durch.

Während der Elektrophorese wandern VNTR-Fragmente unter einem elektrischen Feld durch die Kapillare und trennen sich nach Größe.

Ein Laser regt die fluoreszierenden Tags an jedem Fragment an und erzeugt farbcodierte Signale.

Das resultierende Elektropherogramm zeigt VNTR-Peakmuster, die dem pathogenen Bakterium entsprechen.

Nach der Bestätigung der PCR-Amplikone verwenden Sie neue PCR-Streifen oder Platten, um PCR-Produkte 1 bis 10 in gereinigtem Wasser zu verdünnen. Wirbel und Zentrifuge kurz. Während der Arbeit in einem Abgasschrank bereiten Sie eine Hauptmischung in einer Zentrifugenröhre vor, bestehend aus Formamid und Standardlösung in Referenzgröße.

Je nach Anzahl der zu analysierenden PCR-Produkte verwenden Sie Reagenzienvolumen, wie im Manuskript beschrieben. Erlauben Sie ein Überschussvolumen von 10%. Vortex kurz und verteilt 9,5 Mikroliter in einzelne Bohrungen auf einer PCR-Platte, die für das verfügbare Kapillarelektrophoresesystem geeignet ist.

Dann fügen Sie 0,5 Mikroliter verdünntes PCR-Produkt hinzu. Versiegeln und kurz zentrifugieren. Dann wird die Platte mit den Proben in einen PCR-Thermocycler geladen und die Proben bei 95 Grad Celsius für drei Minuten denaturiert, bevor sie unbegrenzt auf 4 Grad Celsius abkühlen.

Zentrifugieren Sie bei 1000 g für eine Minute, entfernen Sie vorsichtig die Dichtung und legen Sie die Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers auf ein kalibriertes Kapillarelektrophoresesystem. Führen Sie Kapillarelektrophorese mit Fragmentanalyse durch, wobei Reagenzien für das bevorzugte Gerät verwendet werden, und die Laufzeitbedingungen entsprechend der Beschreibung im Manuskript angepasst werden.