DNA-basierte Fischarten Identification Protocol

Das Fischartenidentifikationssystem ist eine einfache, schnelle und genaue DNA-basierte Methode zur Identifizierung der in einer bestimmten Probe vorhandenen Fischarten. Fischproben werden mit Proteinase K behandelt, um Nukleinsäuren in Lösung freizusetzen. Die genomische DNA der Fische wird dann isoliert und mittels Primern PCR-amplifiziert, die an Sequenzen binden, die in allen Fischgenomen vorkommen.

Die PCR-Produkte werden dann mit drei verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer aufgelöst. Die bei den Verdauungsreaktionen erzeugten Fragmentlängen können verwendet werden, um die Fischart mit Hilfe des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus oder der RFLP-Mustervergleichssoftware zu bestimmen. Hallo, ich bin Rachel Formosa von Agilent Technologies.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur DNA-basierten Fischartenbestimmung. Bei diesem Verfahren handelt es sich um eine Screening-Methode, mit der Sie die Fischarten identifizieren können, die in frischen, gefrorenen, gehackten, gekochten, getrockneten oder anderweitig verarbeiteten Proben enthalten sind. Und das in weniger als einem Arbeitstag.

Wir verwenden dieses Verfahren, um die Authentizität von Meeresfrüchten zu untersuchen, was für die Fisch- und Meeresfrüchteindustrie sehr wichtig ist, da Substitution und falsche Etikettierung erhebliche Folgen für die Wirtschaft, die Umwelt und die Lebensmittelsicherheit haben können. Außerdem kann es besonders schwierig sein, Fischarten durch visuelle Identifizierung und andere traditionelle Methoden zu bestimmen. Sobald ein Fisch verarbeitet wurde, liefert der DNA-Test ein viel genaueres und zuverlässigeres Ergebnis.

Also lasst uns loslegen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Proben für die DNA-Extraktion, indem Sie jedem Fisch 10 bis 1000 Milligramm jeder rohen oder gekochten Fischgewebeprobe in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben. Probe mit 220 Mikrolitern frisch zubereiteter Proteinase-Falllösung nehmen und auf und ab pipettieren.

Inkubieren Sie die Röhrchen nach der Inkubation 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius und zentrifugieren Sie drei bis fünf Minuten lang bei 14.000 g, um unverdautes Gewebe zu pelletieren. Füllen Sie anschließend vorsichtig 150 Mikroliter jedes Überstands in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen um, wobei unverdautes Material am Boden und öliges Material oben vermieden wird. Der Überstand wird nun für die Extraktion genomischer DNA verwendet.

Beginnen Sie die genomische DNA-Extraktion, indem Sie jeder Probe 500 Mikroliter des Nukleinsäurebindungspuffers hinzufügen. Damit erhöht sich das Gesamtprobenvolumen auf 650 Mikroliter. Wirbeln Sie die Probe vor, bis sie homogenisiert ist.

Übertragen Sie anschließend jede Probe in einen DNA-Bindungs-Spin-Cup, der in einem der beiden im Kit enthaltenen Milliliter-Gefäßröhrchen sitzt. Lassen Sie die Kappe des Röhrchens auf die Oberseite des Spin-Bechers einrasten. Drehen Sie die Proben eine Minute lang bei 14.000 G, um die DNA auf die Spin-Cup-Matrix zu laden.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation die Spin-Becher, entsorgen Sie das Filtrat und setzen Sie die Becher wieder in die Behälterröhrchen ein. Fügen Sie 500 Mikroliter eines x Salz-Waschpuffers hinzu. Verschließen Sie die Röhrchen und zentrifugieren Sie sie nach der Zentrifugation erneut.

Entsorgen Sie das Filtrat und setzen Sie die Schleuderbecher wieder in die Behälterröhrchen ein. Fügen Sie nun 500 Mikroliter 80%Ethanol hinzu. Verschließen Sie die Tube und drehen Sie sie eine Minute lang bei 14.000 g.

Wiederholen Sie die Ethanolwäsche nach der dritten Wäsche wieder in 80%iger Ethanol und entsorgen Sie die Filter. Setze die Schleuderbecher wieder in die Hülsen ein und schleudere sie diesmal zwei Minuten lang, um die Fasermatrix zu trocknen. Füllen Sie nun die Schleuderbecher in 1,5 Milliliter Auffangröhrchen um.

Geben Sie 100 Mikroliter Evolutionspuffer in jeden Schleuderbecher direkt auf die Fasermatrix im Inneren des Bechers. Setzen Sie dann die Kappen der Entnahmeröhrchen auf die Schleuderbecher und inkubieren Sie sie eine Minute lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation drehen Sie die Proben eine Minute lang mit maximaler Geschwindigkeit.

Entsorgen Sie als Nächstes den Spin-Becher und verschließen Sie die Röhrchen. Bei der Messung von DNA-Konzentrationen sind Konzentrationen im Bereich von fünf Nanogramm pro Mikroliter bis 500 Nanogramm pro Mikroliter zu erwarten. Für die Langzeitlagerung darf die DNA nun bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius gelagert werden, für die Langzeitlagerung wird die DNA bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius gelagert.

Führen Sie die PCR mit den Primern und Reagenzien durch, die im P-C-R-R-F-L-P-Reagenzienkit enthalten sind. Gemäß dem beigefügten schriftlichen Protokoll wird empfohlen, jede Probe, einschließlich der positiven Anti-Anti-Template-Kontrolle, in zweifacher Ausführung durchzuführen, während die PCR läuft. Bereiten Sie Restriktionsenzym-Mastermixe für die Aufschlüsse mit DTE, E, einem, HAE, drei und NL drei vor, indem Sie die folgenden Komponenten der Reihe nach kombinieren: 1,5 Mikroliter steriles destilliertes Wasser, 0,5 Mikroliter 10 x Enzympuffer und 0,5 Mikroliter 10 x Enzym.

Bereiten Sie genug für alle Proben plus ein Reaktionsvolumen vor, überschüssiges Vierex-Drei-Reagenzien-Gemisch. Verteilen Sie dann 2,5 Mikroliter auf jedes Reaktionsröhrchen, das mit der Probe und dem Enzymnamen beschriftet ist. Sobald die PCR abgeschlossen ist, nehmen Sie die Proben aus dem Thermocycler und legen Sie sie auf Eis.

Geben Sie für diese Reaktion 2,5 Mikroliter jedes PCR-Produkts in jedes der drei Restriktionsverdauröhrchen. DDE ein HAE drei und NLA drei. Nächster Wirbel.

Die Aufschlüsse kurz zentrifugieren und bei 37 Grad Celsius zwei Stunden lang inkubieren. Wenn es bequemer ist, können die Verdauungen auch über Nacht inkubiert werden. Nach dem Aufschluss werden die Reaktionen 15 Minuten lang bei 65 Grad Celsius inkubiert.

Geben Sie dann einen Mikroliter 60 millimolare EDTA in jedes Röhrchen, um die Reaktion und den Vortex zu beenden. Bereiten Sie mit dem Agilent Bioanalyzer-Reagenzienkit den Restriktionsverdau vor und laden Sie ihn in die Vertiefungen des A-DNA-Chips gemäß der Kit-Anleitung. Für jede Probe sollten alle drei Aufschlüsse auf denselben Chip geladen werden.

Wirbeln Sie dann den Chip durch und laden Sie ihn in die Maschine. Nachdem der Lauf abgeschlossen ist, gehen Sie zum Assay-Kontext und wählen Sie die Registerkarte Chip-Zusammenfassung aus. Geben Sie im Feld für den Probennamen einen Probennamen für alle 12 Vertiefungen des Chips ein, um die Fischarten für die Test-DNA-Proben zu identifizieren.

Starten Sie das RFLP-Decoderprogramm, indem Sie auf Datei klicken. Öffnen Sie dann die XAD-Datei. Das Dialogfeld zum Öffnen wird geöffnet.

Wählen Sie nun die XAD-Datei für den verwendeten DNA-Chip aus. Klicken Sie auf Öffnen, um eine Liste der auf den Chip geladenen Proben anzuzeigen. Wählen Sie die drei Verdaue aus, die der ersten DNA-Probe entsprechen.

Geben Sie in der Spalte "Enzym" die Restriktionsenzyme an, die in dem Feld mit der Bezeichnung "Min. Peakhöhe" als Prozentsatz des unteren Markers verwendet wurden. Der Standardwert ist bei Bedarf 10 %. Dieser Wert kann gesenkt werden, um kleine Peaks zu identifizieren, die übersehen wurden, oder um Peaks zu verwerfen, die auf unspezifisches Rauschen im Elektropherogramm zurückzuführen sind.

Nachdem Sie den Wert für die minimale Spitzenhöhe angepasst haben, klicken Sie auf Reintegrieren. Klicken Sie nun unten im Dialogfeld auf calc. Die Fragmentlängendaten, die aus dem Bioanalyselauf gewonnen werden, füllen die Softwarefelder aus.

Wählen Sie als Nächstes in der Punkte-Dropdown-Liste in der oberen linken Ecke des Bildschirms Würfel aus. Besteht die Fischprobe aus einer einzigen Fischart oder einem Gemisch, so wird die Tabelle am unteren Rand des Bildschirms mit der Bezeichnung "Kombinierte Score-Liste" angezeigt. Die beste Übereinstimmung der Spezies basiert auf den Ergebnissen aller drei Verdauungsreaktionen.

Perfekte Übereinstimmungen mit einer Punktzahl von eins werden grün hervorgehoben. Übereinstimmungen in der Nähe werden oben auf dem Bildschirm gelb hervorgehoben. Der untere Grenzwert gibt die minimale Fragmentgröße an, die in der Analyse verwendet wird, und der Wert für die Übereinstimmungstoleranz bestimmt, wie nah die Länge eines Fragments an dem vorhergesagten Fragment liegen muss, um als Übereinstimmung betrachtet zu werden.

Die angezeigten Werte sind die Standardeinstellungen und können angepasst werden. Wiederholen Sie diese Schritte für die Analyse der verbleibenden DNA-Proben an der Spitze. DNA-Proben von vier verschiedenen Fischarten wurden mit der in diesem Video beschriebenen Methode isoliert, amplifiziert und verdaut.

Hier wird ein Bioanalyzer-Gel gezeigt, das die Restriktionsaufschlussproben mit dem Agilent Bioanalyzer und RFLP-Decoder zeigt. Hier werden Software-Biegemuster verwendet, um die Fische zu identifizieren. Die erste Probe wird korrekt als Forelle, die zweite als Thunfisch, die dritte als Gesteinserde identifiziert.

Und die letzte Probe als spezifischer Kabeljau. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie mit der P-C-R-R-F-L-P-Methode von Agilent eine DNA-basierte Fischartenbestimmung durchführen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine Kreuzkontamination der Proben zu vermeiden, da die Methode so empfindlich ist.

Das war's also. Jetzt wissen Sie, wie Sie die in Ihren Proben vorhandenen Fischarten schnell, einfach und genau identifizieren können. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.