Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Das ist also ein 10 Tage alter Mäusewelpe und ich werde eine Schwanzbiopsie machen und dann genomische DNA aus seinem Schwanz extrahieren. Was ich also tun werde, ist, ein kleines Stück seines Schwanzes abzuschneiden, etwa drei Millimeter, und dann lege ich das Stück des Schwanzes in eine Einorröhre und ich lege die Einorröhre auf Trockeneis. Um eine Kontamination von Maus zu Maus zu vermeiden, markiere ich die Rasierklinge normalerweise an der Stelle, an der ich den letzten Schnitt gemacht habe.

Auf diese Weise werde ich für die nächste Maus sicher ein sauberes Stück Rasierklinge für die nächste Schwanzbiopsie verwenden. Um zwischen den verschiedenen Mäusen in deinem Wurf zu unterscheiden, brauchst du eine Möglichkeit, die Mäuse zu identifizieren. Eine Möglichkeit, dies zu tun, besteht darin, mit einem Ohrlocher, der hier gezeigt wird, ein Loch in ihre Ohren zu stanzen.

Nehmen Sie die Maus vorsichtig am Nacken, drehen Sie sie um und kneifen Sie ihren Schwanz zwischen Ihre Finger. Nimm die Ohrlochpunktion in die andere Hand und mache dort einen schnellen Schnitt in das Ohr der Maus. Sehen Sie, wie schmerzlos das war?

Okay, jetzt können Sie sehen, dass ich einige Schwanzstücke in diesen Einor-Röhren habe, und jetzt werde ich die Lösungen hinzufügen, die ihnen bei der Verdauung helfen. Zuerst füge ich 720 Mikroliter STE-Lösung hinzu und dann füge ich 30 Mikroliter Protein hinzu. Ace K.So hier ist ein Blick auf das Stück Schwanz, das wir vor der Verdauung abgeschnitten haben.

Jetzt lege ich die Heckstücke auf einen 55 Grad heißen Block. Viele Protokolle verlangen ein kontinuierliches Schaukeln bei 55 Grad, aber für meine Zwecke ist das nicht notwendig, da ich die Heckstücke wirbeln werde. Jetzt werde ich das Stück Schwanz zwei Sekunden lang wirbeln.

Eins, zwei. Hier ist also ein Blick auf das, was hier im Einor-Rohr übrig geblieben ist, und Sie könnten sehen, dass das Stück Schwanz vollständig aufgelöst wurde und die Proteinase K bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten aktiviert. Fünf Minuten auf Eis abschrecken.

Schleudern Sie die Schwanzstücke in einer Mikrozentrifuge für 10 Minuten bei voller Geschwindigkeit herunter. In dieser Mikrozentrifuge beträgt die volle Drehzahl 13.000 U/min. Während sich die Verdauungsschwänze nach unten drehen, beschriften Sie einige Einor-Röhrchen und füllen die Einor-Röhrchen mit 750 Mikrolitern Isopropanol.

Nach dem Abdrehen der verdauten Schwänze bilden die Haare und das unverdaute Material ein Pellet am Boden des Röhrchendekanters. Die Lösung, die das verdaute Material, STE und Proteinase K enthält, in das Einor-Röhrchen, das die Isopropanol-DNA enthält, beginnt aus der Lösung auszutreten, erscheint geisterhaft und federartig, und genau dort schwimmt um diese Blase herum genomische DNA, die aus dem Schwanz der Maus isoliert wurde. Nach dem Mischen von Isopropanol und STE-Lösung kommt die genomische DNA aus der Lösung und es sieht so aus, als ob diese kleine Kugel hier die gefällte genomische DNA fünf Minuten lang bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge herunterschleudert.

Dort, am Boden des Röhrchens, ist ein Blick auf unsere pelletierte genomische DNA. Jetzt werde ich die Lösung im Inneren des Röhrchens absaugen und nur das Kügelchen der genomischen DNA zurücklassen. Jedes Mal, wenn ich einen weiteren Schlauch aspiriere, wechsle ich den Schlauch.

Haustierspitze an der Spitze dieses Saugers. Nachdem ich das STE und das Isopropanol abgesaugt habe, füge ich einen Milliliter 70%iges Ethanol hinzu, um das genomische DNA-Pellet zu waschen. Da das Pellet aus genomischer DNA normalerweise an der Seite eines Mikro-Fugenröhrchens haftet und schwer zu entfernen ist, um es gründlich mit dem 70%igen Ethanol zu waschen, müssen Sie es über das Mikro-Fugenröhrchengestell harken, das ich hier habe.

Das kannst du so machen. Hier ist also ein Blick auf die genomische DNA, nachdem sie pelletiert und in 70 % Ethanol gewaschen wurde. Ich werde dies wieder fünf Minuten lang bei voller Geschwindigkeit herunterschleudern und dann die 70%ige Ethanol-Schleuderung der genomischen DNA-Pellets absaugen, nachdem sie gewaschen wurden.

Ihr 70%Ethanol fünf Minuten bei voller Geschwindigkeit, um das 70%ige Ethanol abzusaugen und die DNA fünf Minuten lang trocknen zu lassen. Es gibt einen Blick auf das genomische DNA-Kügelchen am Boden des Röhrchens, und das ist ungefähr so trocken, wie man es sich wünscht. Also habe ich die Pellets der genomischen DNA aus den Mäuseschwänzen getrocknet, und jetzt füge ich hundert Mikroliter 40 Millimolare Triss bei pH acht hinzu.

Ich habe also die genomische DNA bei 50 Grad Celsius, wo sie schneller in Lösung geht als bei Raumtemperatur. Nach etwa einer Stunde oder so bei 50 Grad friere ich es entweder ein oder stelle es auf vier Grad, bis ich meine PCR-Reaktionen durchführen möchte, um tatsächlich herauszufinden, welche Mäuse positiv für mein Transgen sind.