Name: Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Lernen Sie die Isolierung genomischer DNA aus Maus-Schwanzbiopsien. Diese Methode zeigt, wie Sie Kontamination vermeiden und Mäuse eindeutig identifizieren, um zuverlässige genetische Analysen durchzuführen.

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<ol style="margin-top: 0in"><li> Cut Schwanz Stück (3mm) und markieren den Ohren. </li><li> Add 720 m l STE und 30 m l Proteinase K (10 mg / ml Stammlösung). </li><li> Inkubation bei 55 ° C auf Heizblock und Wirbel jede Stunde für 3 Stunden bei Höchstgeschwindigkeit für 10 Sekunden. </li><li> Inactivate Proteinase K bei 70 ° C für 5 Minuten. </li><li> Quench auf Eis für 5 Minuten. </li><li> Centrifuge tail DNA für 10 Minuten bei voller Geschwindigkeit. </li><li> Dekantieren in neue Röhrchen mit 720 m l Isopropanol. &nbsp; </li><li> Niederschlag DNA durch Invertieren des Röhrchens oder Vortexen. </li><li> Spin down DNA für 5 Minuten bei voller Geschwindigkeit. Überstand entfernen. </li><li> Wash-Pellet mit 70% Ethanol. </li><li> Spin down genomische DNA 5 Minuten bei voller Geschwindigkeit. Überstand entfernen. </li><li> Lassen DNA für 1-2 Minuten trocknen lassen. </li><li> Resuspendieren DNA in 100-200 m l je nach Größe der Pellets. </li><li> Das Röhrchen bei 55 ° C für 1 Stunde zu erleichtern Auflösung der DNA. &nbsp; </li></ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>Puffer</td><td></td><td></td><td>100 mm Tris; pH 8,5 /5 mM EDTA /0,2 % SDS /200 mM NaCl / in H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>Puffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5,0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

isolierung genomischer dna aus maus-tails

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Das ist also ein zehn Tage altes Mäusejunges, von dem ich eine Schwanzbiopsie entnehmen werde, um anschließend genomische DNA aus dem Schwanz zu isolieren. Ich werde also ein kleines Stück des Schwanzes abschneiden, ungefähr drei Millimeter, und das Schwanzstück in ein Eppendorf-Röhrchen geben, das ich dann auf Trockeneis lege. Um Kontaminationen von einer Maus zur anderen zu vermeiden, markiere ich üblicherweise die Rasierklinge an der Stelle, an der ich den letzten Schnitt gemacht habe.Auf diese Weise stelle ich sicher, dass ich für die nächste Maus ein sauberes Rasierklingenstück für die nächste Schwanzbiopsie verwende. Um die verschiedenen Mäuse in Ihrem Wurf unterscheiden zu können, benötigen Sie eine Möglichkeit, die Mäuse zu kennzeichnen. Eine Möglichkeit besteht darin, mit einem hier gezeigten Ohrlochstecher ein Loch in ihre Ohren zu stanzen.Nehmen Sie die Maus vorsichtig am Nackenfell, drehen Sie sie um und klemmen Sie ihren Schwanz zwischen die Finger. Halten Sie die Ohrlochperforation mit der anderen Hand und machen Sie dort einen schnellen Schnitt in das Ohr der Maus. Sehen Sie, wie schmerzlos das war?Okay, nun können Sie sehen, dass ich einige Schwanzstücke in diesen Eppendorf-Röhrchen habe, und jetzt werde ich die Lösungen hinzufügen, die der Verdauung helfen. Zuerst werde ich 720 µL STE-Lösung hinzufügen und danach 30 µL Proteinase K. Hier sehen Sie das Schwanzstück, das wir vor der Verdauung geschnitten haben.Jetzt lege ich die Schwanzstücke auf einen Heizblock mit 55 Grad. Viele Protokolle sehen eine kontinuierliche Schüttelbewegung bei 55 Grad vor, doch für meine Zwecke ist dies nicht notwendig, da ich die Schwanzstücke verwirbeln werde. Nun werde ich das Schwanzstück zwei Sekunden lang verwirbeln.Eins, zwei. Nach dem Vortexen sehen Sie hier, was im Eppendorf-Röhrchen zurückgeblieben ist. Wie Sie erkennen können, wurde das Schwanzstück vollständig aufgelöst. Aktivieren Sie die Proteinase K bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten. Anschließend fünf Minuten auf Eis abkühlen.Zentrifugieren Sie die Schwanzstücke in einer Mikrozentrifuge 10 Minuten bei maximaler Drehzahl. In dieser Mikrozentrifuge beträgt die maximale Drehzahl 13.000 U/min. Während die Verdauungsschwänze zentrifugiert werden, beschriften Sie einige Einwegröhrchen und füllen Sie diese mit 750 µL Isopropanol.Nach dem Zentrifugieren der verdauten Schwänze bilden die Haare und unverdautes Material ein Pellet am Boden des Röhrchens. Die Lösung, die das verdauten Material, STE und Proteinase K enthält, wird in das Eppendorf-Röhrchen mit dem Isopropanol gegeben; die DNA beginnt, aus der Lösung auszufallen, erscheint geisterhaft und federartig, und genau dort, wo diese Blase schwimmt, befindet sich die genomische DNA, die aus dem Schwanz der Maus isoliert wurde. Nach dem Mischen der Isopropanol- und STE-Lösung fällt die genomische DNA aus der Lösung aus und erscheint als dieser kleine Klumpen hier; zentrifugieren Sie die ausgefällte genomische DNA fünf Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge.Ganz unten im Reagenzglas ist unser pelletiertes genomisches DNA zu sehen. Nun werde ich die Flüssigkeit im Reagenzglas absaugen, wobei nur das Pellet der genomischen DNA zurückbleibt. Jedes Mal, wenn ich ein weiteres Reagenzglas absauge, werde ich die Pipette wechseln.Spitze des Pipettenspitzenhalters auf die Spitze dieses Aspirators. Nachdem ich das STE und das Isopropanol abgesaugt habe, werde ich ein Milliliter 70 %igen Ethanol hinzufügen, um das Pellet der genomischen DNA zu waschen. Da das Pellet der genomischen DNA normalerweise an der Wand des Mikrozentrifugenröhrchens haftet und schwer vollständig in den 70 %igen Ethanol zu überführen ist, müssen Sie es über das Mikrozentrifugenröhrchen-Rack, das ich hier habe, abstreifen.Sie können dies wie folgt tun. Hier sehen Sie die genomische DNA, nachdem sie pelletiert und mit 70 % Ethanol gewaschen wurde. Ich werde dies erneut fünf Minuten lang bei maximaler Drehzahl zentrifugieren und dann den 70 %igen Ethanol überstand abpipettieren, um die Pellets der genomischen DNA nach der Wäsche abzutrennen.70 % Ethanol fünf Minuten bei maximaler Drehzahl, anschließend das 70 % Ethanol abpipettieren und die DNA fünf Minuten trocknen lassen. Achten Sie auf das Pellet der genomischen DNA am Boden des Röhrchens, das sollte etwa so trocken sein, wie gewünscht. Ich habe die Pellets der genomischen DNA aus den Mäuseschwänzen getrocknet und werde nun hundert Mikroliter 40 Millimolar Tris bei pH 8 hinzufügen.Ich habe also die genomische DNA bei 50 Grad Celsius, wo sie sich schneller in Lösung geht als bei Raumtemperatur. Nach etwa einer Stunde bei 50 Grad werde ich sie entweder einfrieren oder bei vier Grad lagern, bis ich meine PCR-Reaktionen durchführen möchte, um tatsächlich herauszufinden, welche Mäuse positiv für mein Transgen sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die vollständige Genotypisierung von einer Maus Schwanz Probe, einschließlich Gewebe Verdauung und PCR-Anzeige ist in eineinhalb Stunden mit Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit durchgeführt.

Schnelle Genotypisierung von Maus Tissue Mit Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Wir präsentieren ein nicht-invasives Vorgehen bei der Probennahme, um effizient zu sammeln Haarproben von schwer fassbaren kleinen Säugetieren, wie für den amerikanischen pika gezeigt. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode durch Extraktion von DNA aus Proben Haar und verstärkt verschiedene Arten von molekularen Markern häufig in Studien für Wildtierkunde und Ökologie und Naturschutz eingesetzt.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zum Schwanzschneiden in einem Mausmodell, um peripheres Blut zu sammeln. Das gesammelte Blut wird anschließend einer Zentrifugation unterzogen, um Plasma zu trennen, das für weitere Experimente verwendet werden kann.

Ein Mausschwanz-Snip-Verfahren zur peripheren Blutentnahme und Plasmaisolierung

Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden.

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

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Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

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Die Lambda wählen Sie cII Mutation-Detection-System

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Dieses Protokoll bietet eine einfache, kostengünstige DNA-Isolationsmethode für die Analyse von Veränderungen der Mikrobiota des murinen Darms während der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen.

Analyse der Dynamik fäkaler Mikrobiota in Lupus-anfälligen Mäusen mit einer einfachen, kostengünstigen DNA-Isolierungsmethode

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Lernen Sie die Isolierung genomischer DNA aus Maus-Schwanzbiopsien. Diese Methode zeigt, wie Sie Kontamination vermeiden und Mäuse eindeutig identifizieren, um zuverlässige genetische Analysen durchzuführen.

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

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