Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

Hallo, ich bin Greg Zott. Ich bin am UCSF Diabetes Center im Bluestone Laboratory und zeige Ihnen heute den Prozess zur Isolierung von Mausösen. Das Verfahren beinhaltet die Injektion einer Kollagenaselösung in die Bauchspeicheldrüse einer C3 H-Spendermaus, wo wir dann diese Bauchspeicheldrüse entfernen, sie verdauen, die Ösen auf einem Fial-Gradienten reinigen und sie dann von Hand für die endgültige Transplantation in die Nierenkapsel einer diabetischen NOD-Maus auswählen, die unser Empfänger sein wird.

Bevor wir mit diesem Verfahren beginnen, haben wir unsere ATE-Lösung in einem modifizierten Hanks-Puffer verdünnt und wir haben die Konzentration angepasst, die spezifisch für den Mausstamm ist, den wir verwenden, den C3 H. Wir fanden eine bessere Verdauung bei einer Kollagenaselösung von 0,8 mg pro Mil, und wir werden diese verwenden, um in den gemeinsamen Gallengang zu injizieren, um die Bauchspeicheldrüse zu dehnen. Aufführend. Der Eingriff heute wird Pavo codre des Diabetes-Zentrums sein. Er injiziert, öffnet die Maus, legt den Darm frei und injiziert dann in den gemeinsamen Gallengang.

Wir sprühen die Maus mit Ethanol ein, um die Haare unten zu halten, und dann überprüfen wir auch, ob die Maus richtig geopfert wurde, indem wir sie in die Zehen kneifen. Pavo öffnet nun die Maus und legt den Darm und die Bauchspeicheldrüse mit einem Mittellinienschnitt frei. Die Membran wird ebenfalls durchtrennt, um sicherzustellen, dass die Maus geopfert wird.

Bevor es losgeht, möchte ich noch auf einige wichtige Strukturen hinweisen. Der Magen liegt genau hier, mit der Bauchspeicheldrüse, die unten im Zwölffingerdarm und darüber befestigt ist. Dies ist die Leber, in der sich die Gallenblase und der Gallengang befinden, den Sie hier sehen können.

Was Pavo also als nächstes tun wird, ist, den Dünndarm zu isolieren und herauszufinden, wo der gemeinsame Gallengang in den Dünndarm eintritt. Sobald der Darm freigelegt ist, klemmen wir auf beiden Seiten des gemeinsamen Gallengangs mit Mückenklemmen fest. Wir stellen fest, dass dadurch mehr Kollagenate in die Bauchspeicheldrüse gelangen können, während andere Gruppen versuchen, die Klemme auf den gemeinsamen Gallengang zu richten.

Wir finden, dass dies eine bessere Technik ist, um dem Enzym den Eintritt in die Bauchspeicheldrüse zu ermöglichen. Dies ist ein schonendes Verfahren. Du willst den Darm nicht zerreißen.

Sie sollten die Klemmen sanft auf beiden Seiten des gemeinsamen Gallengangs liegen lassen. Jetzt werden wir eine Gallenblase finden, und sobald die Gallenblase freigelegt ist, werden wir diese als Leitfaden für die Injektion der Kollagenase in den gemeinsamen Gallengang verwenden. Powell verwendet eine 30-Gauge-Nadel mit einer Fünf-cm³-Spritze, die drei Mühlen Kollagenaselösung enthält.

Wenn er in den gemeinsamen Gallengang eintritt, dehnt er diesen Kanal mit Kollagenaselösung auf und wandert dann den gemeinsamen Gallengang hinunter, bis er in die Nähe des Darms kommt. Und während er nach unten geht, werden die Enzymlösungen, die in die Bauchspeicheldrüse gepumpt werden, in die Bauchspeicheldrüse injiziert. Jetzt, da die Bauchspeicheldrüse mit Kollagenaselösung aufgebläht ist, wird Powell die Hämostatika entfernen und dann die Bauchspeicheldrüse aus der Maus entfernen, indem er sie vorsichtig vom Darm wegreißt.

Er entnimmt es aus dem Magen. Okay, und dann benutzt er die Milz als Griff, hebt die Bauchspeicheldrüse an und schneidet sie dann langsam in den gemeinsamen Gallengang ein, und das war's. Die Bauchspeicheldrüse wird ausgelegt und dann wird die Milz entfernt, und dort entfernt er das mesoenterische Gewebe, und dann wird die Bauchspeicheldrüse in eine Kollagenaselösung mit zwei Mühlen und ein sterilisiertes Glasfläschchen gelegt und wieder auf Eis gelegt.

Die isolierte Bauchspeicheldrüse, die wir in die Glasfläschchen geben, wird nun für etwa 17 Minuten in ein 37 Grad heißes Wasserbad gelegt. Wir haben sie in ein 50 mil konisches Gestell gelegt, damit sie nicht aufschwimmen. Einmal während des Bades startet der Timer und die Verdauung beginnt.

Sobald die Aufschlusszeit abgelaufen ist, werden die Fläschchen entnommen, dann geschüttelt und vorsichtig zerkleinert. Und sobald das Gewebe auseinander fällt, wird das Fläschchen auf Eis gelegt. Ein steriles Sieb wird über einen 400-mil-Becher gelegt, der Waschpuffer enthält.

Der Pankreasverdau wird dann vorsichtig über das Sieb in den Waschpuffer gegossen. Zu Demonstrationszwecken wurde die Haube ausgeschaltet und das Glas der Haube angehoben, damit wir sehen konnten, was wir taten. Sobald der Pankreasverdau in das Becherglas gegossen wurde, werden die Fläschchen mit demselben Waschpuffer gespült und der Waschpuffer über das Sieb gelegt.

Wir haben eine Spritze, die mit Waschpuffer gefüllt ist. Wir werden das verwenden, um das Gewebe gewaltsam durch das Sieb zu waschen. Die Idee ist, alle losen Ösen freizugeben, die nicht an der Matrix befestigt sind, aber die Membranen und das unverdaute Gewebe auf dem Bildschirm belassen.

Und wenn Sie mit dem Waschen eines Taschentuchs fertig sind, sehen Sie dies normalerweise am Ende des Eingriffs. Das Bauchspeicheldrüsengewebe, das sich am Boden des Röhrchens befindet, wird nun auf zwei 50 mil konische Röhrchen übertragen, und das Gewebe wird gewaschen, das Gewebe gleichmäßig gemischt und dann gleichmäßig verteilt, so dass wir in jedem Röhrchen ein gleiches Pelletvolumen haben. Der Becher wird nun mit mehr Waschpuffer gespült.

Die Seiten sind gespült, so dass Sie das gesamte Gewebe, das in den Becher gelangt ist, wieder bekommen. Dann wird es gleichmäßig auf jeweils zwei verteilt, beide 50 mil. Konische werden dann mit Waschpuffer aufgefüllt.

Das Gewebe wird mehrmals invertiert und dann in eine Zentrifuge gegeben. Das ist eine schnelle Drehung. Die Zentrifuge wird auf tausend Umdrehungen pro Minute gelassen und dann ausgeschaltet.

Das Gewebe ist zu diesem Zeitpunkt sehr S-Ösen sind sehr empfindlich, und Sie möchten sie nicht zu stark verdichten. Die Schläuche werden entfernt und wir werden diesen Waschschritt noch drei Mal durchführen. Dies ist das Ende der dritten Wäsche.

Die Bestandteile des 50 mil konischen Röhrchens werden für tausend U/min auf das 15 konische Röhrchen überführt und zentrifugiert und dann gestoppt. Das Supernat wird entfernt und der erste Teil des FI-Calls wird gestartet. Wir sind an dem Punkt angelangt, an dem wir unseren pelletierten Pankreasverdau haben.

Wir werden das Gewebe wieder aufhängen, so dass es schön locker an den Pellets anliegt. Wir fügen den ersten Dichtegradienten hinzu, der 1 1 0 8 ist. Wir fügen jedem Rohr fünf mil hinzu.

Das Pellet wird dann in jedem der Gradienten gründlich durchmischt. Es ist wichtig, dass Sie eine gute Gewebeverteilung in Ihrem stärksten Gradienten erhalten. Jetzt schichten wir zwei Mils mit einer Dichte von 1 0 9 6 übereinander.

Darüber hinaus schichten wir zwei Mils mit einer Dichte von 1 0 6 9 und dann eine Dichte von 1 0 3 7. Es ist wichtig, dass Sie beim Schichten der Dichten nicht mischen. Dann wurden alle Schichten auf das Rohr aufgebracht.

Und Sie können sehen, dass dies das Top von 1 1 0 8, das Top von 9 1 0 9 6, das Top von 1 0 6 9 und das Top von 1 0 3 7 ist. Und man konnte sehen, dass sich das Gewebe auch ohne Zentrifusion bereits zu seiner richtigen Dichte zu bewegen beginnt. Die Fial-Gradienten werden 15 Minuten lang bei 1800 U/min auf Geschwindigkeit gebracht, und denken Sie daran, die Bremse ausgeschaltet zu lassen, nachdem die Schläuche aus der Zentrifuge genommen wurden.

Sie können sehen, dass zwischen der Schicht 0 0 9 6 und 0 0 7 ein schönes Band aus Ösengewebe von Pablo ist. Entfernen Sie nun die 0 3 7 Schicht, um Gewebeablagerungen und DNA zu entfernen, die während der Verarbeitung freigesetzt worden sein könnten. Mit einer sterilen Weidepipette aus Kunststoff entfernt er nun die Inselschicht und überträgt sie auf eine 50 mil konische Flüssigkeit mit 25 mil Waschpuffer

Sie möchten diesen Schritt schnell ausführen, da Fol giftig für Ösen ist. Wir haben tatsächlich die gesamte 0 6 9 und 0 9 6 Schicht entfernt. Pavo schneidet die Oberseite der Kunststoffpipette ab und spült sie mit Waschpuffer ab.

Die Ösen werden dann zentrifugiert, wie wir zuvor zentrifugieren. Die Zentrifuge wird auf tausend Umdrehungen pro Minute gebracht, dann stoppen wir sie und saugen ab. Die überstehenden Ösen werden dreimal mit Waschmedium gewaschen.

Wir haben also gerade den Prozess der Lidisolierung abgeschlossen, den wir nach unserer dritten Wäsche mit Waschpuffer vom Verdau über den Folgradienten bis zu den gereinigten Ösen genommen haben, wir haben die Ösen in unserem RPMI-Medium resuspendiert und in einer Gewebekulturplatte abgespielt. Diese Ösen sind nun bereit für In-vitro-Assays oder In-vivo-Präparate wie die Ösentransplantation.