Name: Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung muriner Inselzellen aus der Bauchspeicheldrüse mit Kollagenase-Verdau und Ficoll-Gradientenzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Aufreinigung lebensfähiger Inseln für Transplantationsstudien bei Diabetes.

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Collagenase Vorbereitung <ol><li> Abwiegen der Kollagenase in einen 50 ml konische und fügen Isolation Puffer, um die Endkonzentration, wie in der folgenden Tabelle angegeben zu machen. Lösen Sie die Kollagenase durch Vortexen. (12 Mäuse + 2 extra Mäuse = 14 Mäuse x 5 ml / Maus = 70 ml insgesamt Kollagenase-Lösung) (70 ml x 0,5 mg / ml oder 0,3 mg / ml = 35 mg oder 21 mg Kollagenase P gesamt) <table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%"><tbody><tr><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Belastung </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Alter </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Collagenase P (mg / ml) </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Zeit (min) </th></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 Wochen </td><td style="font-size: 12px"> 0,8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 Wochen </td><td style="font-size: 12px"> 0,5 </td><td style="font-size: 12px"> 13 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NOR, NICHT </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 Wochen </td><td style="font-size: 12px"> 0,8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NOR, NICHT </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 Wochen </td><td style="font-size: 12px"> 0,5 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr></tbody></table> </li><li> Dispense 2 ml Kollagenase-Lösung in jede Glasflasche und auf Eis stellen. Legen Sie jeweils 5 ml Spritze mit 3 ml Kollagenase 30g Nadel und im Eis (Vorbereitung in der Kapuze). </li></ol> Distension <ol><li> Kurz vor Dissektion, opfern Tiere durch Genickbruch. Spray den ganzen Körper mit 70% EtOH, so dass es komplett nass. Machen Sie eine V-Insision ab dem Genitalbereich. Drehen Sie die Maus so den Schwanz weg von Ihnen zugewandt ist. </li><li> Entfernen Sie den Darm auf der linken Seite des offenen Maus. Dies legt die Bauchspeicheldrüse und Gallengang. </li><li> Legen Sie eine hemostat Klammer auf beiden Seiten der kleinen Darm, wo der Gallengang Kanalisation, so dass eine kleine Tasche für Kollagenase-Lösung in den Darm gelangen. </li><li> Inflate der Bauchspeicheldrüse durch den Gallengang mit einer 30g Nadel und 5 ml Spritze mit 3 ml kaltem Kollagenase-Lösung, beginnend an der Gallenblase. </li><li> Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse aus dem Körper und legen Sie sie in eine silikonisierte Fläschchen mit 2 ml Kollagenase-Lösung. Dieser Schritt sollte schnell und so sauber wie möglich durchgeführt werden, zu minimieren Ansammlung von Fett und Bindegewebe. </li><li> Legen Sie die Flasche auf Eis und wiederholen Sie Schritt 3 mit der nächsten Maus. </li></ol> Verdauung <ol><li> Seal jedes Fläschchen und legen Sie sie in ein 37 ° C Wasserbad. Inkubieren für 13-17 Minuten (variiert mit dem Stamm und Alter des Tieres). </li><li> Nach Zeit abgelaufen ist, schütteln kräftig. Die Bauchspeicheldrüse ist zerfallen. </li><li> Gießen Sie jedem Verdauungsvorgang durch eine große sterile Spülbeckensiebkopf in ein steriles 1000 ml Becherglas und Pipette mit Nachdruck aus dem Bildschirm mit Waschpuffer. Dispense die Sedimente in 50 ml konische Röhrchen (3 pancreata/50 ml Tube: wenn n = 12, verwenden Sie genug Waschpuffer auf das Endvolumen 200 ml zu machen und verzichten sie auf 4x50 ml Röhrchen). Die Verdünnung sollte schnell und auf Eis durchgeführt werden, um unerwünschte Insel Verdauung zu vermeiden. </li><li> Spin down: Start der Zentrifuge. Wenn es 1300 rpm erreicht, schalten Sie ihn aus. </li><li> Den Überstand aspirieren, so dass ca. 5 mL. Seien Sie sehr vorsichtig, nicht zu dem Pellet absaugen. </li><li> Pellet, indem Sie kräftig mit der Hand, dann mit 50 ml Waschpuffer. </li><li> Spin down: Start der Zentrifuge. Wenn es 1300 rpm erreicht, schalten Sie ihn aus. </li><li> Das Pellet und wäscht mit 5 ml Waschpuffer. </li><li> Übertragen Sie die 5 ml bis 15 ml konische und Spin-Down, wie oben beschrieben. </li><li> Saugen Sie den Überstand so vollständig wie möglich. (Remaining Puffer kann dazu führen, die Änderung der Dichte des Ficoll.) </li></ol> Ficoll Führen Sie schnell. Langfristige Ficoll Exposition ist giftig für kleine Inseln. <ol><li> Stellen Sie sicher, Pellet vollständig ist vor der Zugabe von Ficoll (durchgezogene Gewebe ist schwierig, in Ficoll resuspendieren) gebrochen. </li><li> Das Pellet in 7 ml Ficoll, Dichte 1.108, durch Vortexen kräftig. </li><li> Layer übereinander Dichte von Ficoll 2ml jede der verbleibenden Dichten in dieser Reihenfolge: 1.096, 1.069, dann 1,037. </li><li> Spin für 15 Minuten bei 1800 rpm bei 4 Grad, mit Pause OFF! </li><li> Pick-Inseln aus der zweiten Schicht mit spoid (sterile plastic Pipette). Übertragen Sie alle Sammlungen auf einem 50 ml konischen mit ~ 25 ml kaltem Puffer. </li><li> Wash, wie oben, 3 mal mit Waschpuffer (Wiederholung von Schritt 12-15). </li><li> Resuspendieren Islets in 20 ml RPMI-1640 (mit 10% FCS und Penicillin und Streptomycin, HEPES, MEM-NEAA) und vorsichtig mischen. Nehmen Sie 100 ul der Probe für das Zählen. </li><li> Transfer 100 ul bis 35 mm Grid-Platte mit 1 ml Medium und 1 ml Dithizon. </li><li> Inkubieren übrigen Inseln in RPMI 1640, in einem 37 ° C, 7% CO 2-Inkubator, in 160 mm-Platten mit insgesamt 30 ml Medium / Platte. <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="Abbildung 1" width="220" height="194" /></li></ol>

murine inselzellen der bauchspeicheldrüse isolation

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

Hallo, ich bin Greg Zott. Ich arbeite am UCSF Diabetes Center im Bluestone-Labor, und heute zeige ich Ihnen das Verfahren zur Isolierung von Mausinseln. Das Verfahren umfasst die Injektion einer Kollagenase-Lösung in die Bauchspeicheldrüse einer C3H-Donormaus, woraufhin wir die Bauchspeicheldrüse entnehmen, sie enzymatisch aufspalten, die Inseln über ein Dichtegradientenverfahren reinigen und anschließend per Hand auswählen, um sie letztendlich unter die Nierenkapsel einer diabetischen NOD-Maus – unserem Empfänger – zu transplantieren.Bevor wir mit diesem Verfahren beginnen, haben wir unsere ATE-Lösung in einem modifizierten Hanks-Puffer verdünnt und die Konzentration spezifisch für den Mäusestamm C3H angepasst. Wir haben festgestellt, dass die Verdauung mit einer Kollagenase-Lösung von 0,8 mg pro ml besser funktioniert, und werden diese verwenden, um sie in den Ductus choledochus zu injizieren, um die Bauchspeicheldrüse aufzudehnen. Den Eingriff wird heute Pavo Codre vom Diabeteszentrum durchführen. Er wird die Maus öffnen, die Därme freilegen und anschließend in den Ductus choledochus injizieren.Wir werden die Maus mit Ethanol besprühen, um das Fell glatt zu halten, und anschließend überprüfen, ob die Maus korrekt getötet wurde, indem wir eine Zehe kneifen. Pavo wird nun die Maus eröffnen und mittels einer medianen Inzision den Darm und die Bauchspeicheldrüse freilegen. Außerdem wird das Zwerchfell durchtrennt, um sicherzustellen, dass die Maus getötet wurde.Bevor wir beginnen, möchte ich auf einige der wichtigen Strukturen hinweisen. Der Magen liegt genau hier, wobei die Bauchspeicheldrüse darunter mit dem Zwölffingerdarm verbunden ist. Dies ist die Leber, in der wir die Gallenblase und den Ductus choledochus finden, den Sie genau hier sehen können.Als Nächstes wird Pavo den Dünndarm isolieren und die Stelle finden, an der der Ductus choledochus in den Dünndarm mündet. Sobald der Darm freigelegt ist, klemmen wir mit Moskitoklammern auf beiden Seiten des Ductus choledochus ab. Wir stellen fest, dass dies ermöglicht, dass mehr Kollagenasen in die Bauchspeicheldrüse gelangen, während andere Gruppen versuchen, die Klammer direkt über dem Ductus choledochus anzubringen.Wir stellen fest, dass diese Technik eine bessere Durchlässigkeit des Enzyms in den Pankreas ermöglicht. Dies ist ein schonendes Verfahren. Sie sollten den Darm nicht verletzen.Sie sollten die Klammern sanft auf beiden Seiten des Ductus choledochus liegen lassen. Nun werden wir eine Gallenblase finden, und sobald die Gallenblase freigelegt ist, nutzen wir sie als Orientierungshilfe, um die Kollagenase in den Ductus choledochus zu injizieren. Powell verwendet eine Nadel mit 30 Gauge und eine Fünf-cc-Spritze, die drei Milliliter Kollagenase-Lösung enthält.Während er in den Ductus choledochus eindringt, dehnt er diesen mit Kollagenase-Lösung aus und bewegt sich dann entlang des Ductus choledochus, bis er nahe dem Darm angekommen ist. Während er sich vorwärts bewegt, wird die Enzymlösung in die Bauchspeicheldrüse gepumpt. Nun, da die Bauchspeicheldrüse mit Kollagenase-Lösung aufgebläht ist, wird Powell die Hämostasen entfernen und anschließend die Bauchspeicheldrüse vorsichtig vom Darm lösen und aus der Maus entnehmen.Er entfernt es aus dem Magen. Gut, und dann benutzt er die Milz als Griff, hebt die Bauchspeicheldrüse an und trennt sie langsam im Bereich des Ductus choledochus ab, das war's. Die Bauchspeicheldrüse wird ausgebreitet, anschließend wird die Milz entfernt, und dort entfernt er das mesenterische Gewebe. Danach wird die Bauchspeicheldrüse in eine zwei Milliliter umfassende Kollagenase-Lösung gegeben und in ein sterilisiertes Glasröhrchen überführt, das anschließend wieder auf Eis gestellt wird.Das isolierte Pankreas, das wir in die Glasgefäße gegeben haben, wird nun für etwa 17 Minuten in ein 37 °C warmes Wasserbad gestellt. Wir haben sie in ein 50 ml konisches Röhrchen gestellt, damit sie nicht nach oben aufsteigen. Sobald das Wasserbad beginnt, startet die Zeitschaltuhr und die Verdauung setzt ein.Nach Beendigung der Verdauungszeit werden die Gefäße entnommen, vorsichtig geschüttelt und aufgelöst. Sobald das Gewebe zu zerfallen beginnt, wird das Gefäß anschließend auf Eis gestellt. Ein steriler Sieb wird über einen 400 ml-Becher gelegt, der Waschpuffer enthält.Der Pankreas-Digester wird anschließend vorsichtig über das Sieb in den Waschpuffer gegossen. Zu Demonstrationszwecken wurde die Abzugshaube ausgeschaltet und die Glasscheibe der Haube angehoben, damit wir sehen können, was wir tun. Sobald der Pankreas-Digester in den Becher gegossen ist, werden die Gefäße mit dem gleichen Waschpuffer gespült und der Waschpuffer über das Sieb gegeben.Wir haben eine Spritze, die mit Waschpuffer gefüllt ist. Damit werden wir das Gewebe kräftig durch das Sieb spülen. Ziel ist es, alle losen Ösen freizusetzen, die nicht an der Matrix befestigt sind, während die Membranen und das undigestierte Gewebe auf dem Sieb verbleiben.Und wenn Sie die Wäsche eines Gewebes abgeschlossen haben, sieht das am Ende des Verfahrens normalerweise so aus. Das Pankreasgewebe, das sich am Boden des Röhrchens befindet, wird nun auf zwei 50-ml-Konischgefäße verteilt, das Gewebe wird gewaschen, gleichmäßig vermischt und anschließend gleichmäßig verteilt, sodass wir in jedem Röhrchen ein gleiches Pelletvolumen erhalten. Der Becher wird nun mit weiterem Waschpuffer ausgespült.Die Seiten werden gespült, um das gesamte Gewebe, das in den Becher gelangt ist, erneut aufzunehmen. Anschließend wird es gleichmäßig auf zwei 50-mL-Konische verteilt. Diese werden dann mit Waschpuffer aufgefüllt.Das Gewebe wird mehrmals umgestülpt und anschließend in eine Zentrifuge gegeben. Es erfolgt ein kurzer Zentrifugationsschritt. Die Zentrifuge darf bis zu 1.000 U/min erreichen und wird danach ausgeschaltet.Das Gewebe ist zu diesem Zeitpunkt sehr empfindlich, und Sie sollten es nicht zu stark verdichten. Die Röhrchen werden entfernt, und wir werden diesen Waschschritt noch dreimal durchführen. Hiermit ist der dritte Waschschritt beendet.Die Bestandteile des 50-ml-Kegelrohrs werden in das 15-ml-Kegelrohr überführt und bei tausend U/min zentrifugiert, dann angehalten. Der Überstand wird entfernt, und der erste Teil des FI Call wird gestartet. Wir befinden uns in dem Schritt, in dem wir unser pelletiertes Pankreas-Digest vorliegen haben.Wir resuspendieren das Gewebe, sodass es locker auf den Pellets liegt. Wir geben den ersten Dichtegradienten, also 1 1 0 8, hinzu. Wir fügen fünf Mille zu jedem Röhrchen hinzu.Das Pellet wird dann gründlich in jedem der Gradienten vermischt. Es ist wichtig, dass Sie eine gute Gewebeverteilung in Ihrem schwersten Gradienten erzielen. Nun werden wir zwei Milliliter Dichte 1 0 9 6 aufschichten.Danach geben wir zwei Mils einer Dichte von 1 0 6 9 darauf, und darauf dann eine Dichte von 1 0 3 7. Es ist wichtig, dass Sie beim Schichten der Dichten keine Vermischung verursachen. Anschließend wurden alle Schichten dem Röhrchen hinzugefügt.Und Sie können sehen, dass dies die Oberseite von 1 1 0 8, die Oberseite von 9 1 0 9 6, die Oberseite von 1 0 6 9 und die Oberseite von 1 0 3 7 ist. Zudem erkennen Sie, dass sich das Gewebe bereits in Richtung seiner korrekten Dichte bewegt, selbst ohne Zentrifugation. Die Gradienten werden 15 Minuten lang mit 1800 U/min aufgefahren, und denken Sie daran, die Bremse ausgeschaltet zu lassen, nachdem die Röhrchen aus der Zentrifuge entnommen wurden.Zwischen der 0 0 9 6- und der 0 0 7-Schicht ist ein deutlicher Band von Augs-Gewebe von Pablo sichtbar. Nun wird die 0 3 7-Schicht entfernt, um Gewebetrümmer und DNA zu beseitigen, die während der Verarbeitung freigesetzt worden sein könnten. Mithilfe einer sterilen Kunststoff-Pasteurpipette entfernt er nun die Inselzell-Schicht und überträgt sie in einen 50-ml-Kegelbehälter, der 25 ml Waschpuffer enthält.Sie sollten diesen Schritt schnell durchführen, da Fol für die Augen giftig ist. Tatsächlich haben wir die gesamte 0 6 9- und 0 9 6-Schicht entfernt. Pavo schneidet die Spitze der Plastik-Pasteurpipette ab und spült sie mit Waschpuffer aus.Die Augenlöcher werden anschließend zentrifugiert, wie zuvor bereits beschrieben. Die Zentrifuge wird auf tausend U/min hochgefahren, dann gestoppt, und wir aspirieren die Flüssigkeit ab. Die überstehenden Augenlöcher werden dreimal mit Waschmedium gewaschen.Wir haben soeben den Augenlid-Isolationsprozess abgeschlossen, bei dem wir vom Verdau über den Folgradienten bis hin zu den gereinigten Augenlidchen nach der dritten Wäsche mit Waschpuffer die Augenlidchen in unserem RPMI-Medium resuspendiert und in eine Zellkulturschale überführt haben. Diese Augenlidchen sind nun bereit für In-vitro-Assays oder In-vivo-Präparationen wie die Augenlidchen-Transplantation.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe) mit einem modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil II: Reinigung und Kultur der menschlichen Inseln) mit einer modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

Eine detaillierte Beschreibung der Maus Inselisolierung wird beschrieben unter Verwendung der Technik der in situ-pankreatischen duktalen Kanülierung und Perfusion einer Kombination von gereinigten Collagenase und neutralen Protease.

Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Maus pankreatische Inselzellen für das screening von ROS Induktionen durch die XENOBIOTIKA Ermittlung der potenziellen diabetogene XENOBIOTIKA Chemikalien zu isolieren.

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Calciumdynamik in heterogenen Zellpopulationen wie Pankreas-Isletzellen vor. Fluoreszierende Reporter werden in die periphere Zellschicht innerhalb der Islet geliefert, die dann immobilisiert und abgebildet wird, und es wird eine pro-Zell-Analyse der Dynamik der Fluoreszenzintensität durchgeführt.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Erfahren Sie die Isolierung muriner Inselzellen aus der Bauchspeicheldrüse mit Kollagenase-Verdau und Ficoll-Gradientenzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Aufreinigung lebensfähiger Inseln für Transplantationsstudien bei Diabetes.

Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

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