Schnittbildung, Färbung und TEM-Bildgebung von eingebetteten Exosomen: Ein Protokoll zur Visualisierung der strukturellen Merkmale von Exosomen mit TEM

Exosomen sind nanosized, kugelförmige Vesikel, die von einer Lipiddoppelschicht umgeben sind, die DNA-, RNA- und Proteinmoleküle enthält, die im Lumen vorhanden sind.

Um die Exosomenstruktur mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sichtbar zu machen, beginnen Sie mit der Entnahme eines Exosomenblocks - eines festen Matrixblocks, der die eingebetteten Exosomen enthält. Mit einem Ultramikrotom erhalten Sie ultradünne Schnitte des Exosomenblocks.

Sammeln Sie den Exosomenabschnitt auf einem geeigneten Gitter und lassen Sie ihn an der Oberfläche haften. Das Gitter bietet der Exosomenprobe einen stabilen Halt für nachfolgende Färbeschritte.

Positionieren Sie dann das Gitter über einem Tropfen Uranylacetat - einem Schwermetallfleck - und inkubieren Sie es für die gewünschte Dauer. Uranyl-Ionen interagieren mit Lipiden, Proteinen, DNAs und RNAs, die in den Exosomen vorhanden sind.

Anschließend wird der Exosomenabschnitt mit Bleicitrat gefärbt, das ebenfalls an die exosomalen Biomoleküle bindet. Bleicitrat bindet schwach an die vorgebundenen Uranylionen und erhöht den Kontrast zum Hintergrund während der Bildgebung.

Beobachten Sie die doppelt gefärbten Exosomen mit TEM. TEM fokussiert den Elektronenstrahl auf die Exosomenprobe. Gefärbte Regionen im Exosom streuen Elektronen stärker als die ungefärbten Bereiche.

Die Objektivblende filtert diese stark gestreuten Elektronen. So erscheinen Exosomen, die gefärbte Biomoleküle enthalten, dunkler als der Hintergrund.

Bereiten Sie mit einem Ultramikrotom Schnitte mit einer Dicke von 60 Nanometern vor. Legen Sie die Abschnitte auf ein Nickelgitter und färben Sie einige von ihnen 20 Minuten lang doppelt mit 2 % Uranylacetat, gefolgt von Bleicitrat für 10 Minuten. Legen Sie dann den gefärbten Schnitt in ein Transmissionselektronenmikroskop und betrachten Sie die Probe mit 80 kV und befolgen Sie die automatischen Einstellungen für die Belichtungszeit. Wenn Sie ein Exosomenbild vor Augen haben, erfassen und speichern Sie das Bild mit der Software des Mikroskops.