Dreikammer-Array-basierter Impedanz-Assay: Eine Echtzeit-Analysetechnik zur Bewertung des invasiven Potenzials von Krebszellen durch Messung der elektrischen Impedanz

Krebsassoziierte Stromazellen sezernieren chemische Faktoren, die die metastasierenden Tumorzellen auslösen können, die sich auf der Basalmembran des Gewebes befinden. Infolgedessen dringen die Krebszellen in die Basalmembran ein und wandern in den extrazellulären Raum des Gewebes.

Um die Invasivität von Krebszellen in vitro zu messen, beginnen Sie mit einer Multiwell-Platte mit mehreren Dreikammer-Arrays. In jedem Array befindet sich in der unteren Kammer eine adhärente Kultur von Stromazellen. Die obere Kammer mit fusionierten impedanzmessenden Mikroelektroden - Miniaturelektroden, die die elektrische Aktivität einer Zelle messen - wird von Krebszellen überlagert, die an der mit extrazellulärer Matrix beschichteten mikroporösen Membran über den Elektroden haften.

Während der Inkubation auf einem impedanzbasierten Analysator geben die Stromazellen chemotaktische Faktoren an das Medium ab, die sich in Richtung der Krebszellen bewegen. Diese Faktoren bewegen sich durch die semipermeable Membran, die sich an der Unterseite der mittleren Kammer befindet.

Die stromazellsezernierten Faktoren signalisieren den adhärenten Krebszellen, sich in invasive Phänotypen zu verwandeln. Als Reaktion darauf wandern die invasiven Zellen durch die mikroporöse Membran und erreichen die interdigitierten Elektroden auf der gegenüberliegenden Seite der Membran.

Im Laufe der Zeit, wenn mehr Krebszellen an den Elektroden haften, verursachen sie eine zelluläre Impedanz - eine Behinderung des Stromflusses durch die Zellen. Die Messung der zellulären Impedanz ist ein Hinweis auf das invasive Potenzial von Krebszellen.

Platzieren Sie alle drei sterilen Kammern in der Gewebekulturhaube. Platzieren Sie den Knopf an der kurzen Seite der unteren Kammer und richten Sie die untere Kammer so aus, dass der Knopf zum Experimentator zeigt.

Geben Sie 30.000 bis 50.000 Zellen in 90 Mikroliter Medium aus der unteren Kammer in jede Vertiefung, ohne Blasen zu bilden. Verwenden Sie 5 % mit fötalem Rinderserum supplementiertes Medium in zwei unteren Kammern als Positivkontrolle für die Zellmotilität und verwenden Sie 0 % serumsupplementiertes Medium als Negativkontrolle.

Drehen Sie die untere Kammer um 90 Grad, nachdem Sie sie 10 bis 15 Minuten in der Motorhaube ruhen gelassen haben. Setze dann die mittlere Kammer darauf, so dass der Knopf an der unteren Kammer in die Kerbe an der mittleren Kammer gleitet. Schieben Sie die Kammer senkrecht nach unten, bis an jeder der Längsseiten der Baugruppe ein Klicken zu hören ist.

Geben Sie 160 Mikroliter serumfreies Medium in alle Vertiefungen der mittleren Kammer. Stellen Sie sicher, dass ein kuppelförmiger Meniskus sichtbar ist, nachdem die Vertiefungen gefüllt wurden, und platzieren Sie die obere Kammer mit den Elektroden nach unten auf der mittleren Kammer, um die blauen Punkte in der mittleren und oberen Kammer auszurichten. Schieben Sie die Kammer senkrecht nach unten, bis von jeder der Längsseiten der Baugruppe ein Klickgeräusch zu hören ist.

Geben Sie 20 bis 50 Mikroliter serumfreies Medium in die obere Kammer. Montieren Sie die Baugruppe auf dem Dual-Purpose-Zellanalysator im Gewebekultur-Inkubator und warten Sie 30 Minuten, bevor Sie den Hintergrund messen.

Öffnen Sie die Zellanalysator-Software, wählen Sie dann die zu verwendende Dockingstation aus, klicken Sie anschließend auf die Registerkarte "Meldung" und stellen Sie sicher, dass "Verbindungen OK" angezeigt wird, um sicherzustellen, dass das Array gut in der Dockingstation platziert ist und die Elektroden gut mit den Sensoren ausgerichtet sind.

Klicken Sie auf die Registerkarte "Experimentnotizen" und geben Sie alle möglichen Informationen über das Experiment ein. Klicken Sie dann auf die Registerkarte "Layout" und geben Sie die Beschreibung des Array-Layouts ein. Klicken Sie dann auf die Registerkarte "Zeitplan" und fügen Sie zwei Schritte aus dem Menü "Schritte" hinzu; Ein Hintergrundschritt mit einem Sweep und ein Testschritt mit 100 Sweeps.

Sobald sich das Array 30 Minuten lang im Inkubator des Dual-Purpose-Zellanalysators befunden hat, klicken Sie auf die Schaltfläche "Play", um die Hintergrundmessung zu starten.

Nachdem die Hintergrundmessung abgeschlossen ist, nehmen Sie das Array aus der Dockingstation und setzen Sie es wieder in die Zellkulturhaube ein. Geben Sie dann 30.000 bis 50.000 Zellen in 100 Mikrolitern serumfreiem Medium in jede Vertiefung der oberen Kammer. Dies sind die Zellen, die die Elektrode erkennt, sobald sie erfolgreich durch die Membran gewandert sind.

Lassen Sie die Baugruppe 30 Minuten in der Haube stehen, bevor Sie sie zur Impedanzmessung auf den Dual-Purpose-Zellanalysator montieren.

Setzen Sie das Array wieder in den Dual-Purpose-Zellanalysator ein und überprüfen Sie die Registerkarte "Meldung" auf die Meldung "Verbindungen OK". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Play", um die Impedanzmessung zu starten, und klicken Sie dann auf die Registerkarte "Plot", um den Fortschritt des Signals zu überwachen.

Wenn der Endpunkt vor 25 Stunden erreicht wird, klicken Sie im Dropdown-Menü "Ausführen" auf den Schritt "Abbrechen". Um Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm, wählen Sie "Kopieren" im Listenformat und fügen Sie die Daten dann in eine Tabelle ein.