Elektrochemilumineszenz-Assay zur Quantifizierung der Zielproteinspiegel im Gehirnlysat

Für den quantitativen Nachweis eines spezifischen Proteins im Lysat des Mausgehirns unter Verwendung des Elektrochemilumineszenz-Immunoassays (ECL) beginnen Sie mit einer Multi-Well-Assay-Platte.

Die Vertiefungen bestehen aus leitenden Arbeits- und Gegenelektroden, die den elektrischen Stromkreis vervollständigen. Eine dielektrische Schicht trennt die Elektroden und verbessert so die Empfindlichkeit des Assays.

Geben Sie primäre monoklonale Maus-Antikörper gegen das Zielprotein in die Vertiefungen. Die Arbeitselektroden mit größerer Bindungskapazität erleichtern es den Antikörpern, sich auf ihnen zu immobilisieren.

Inkubieren Sie mit einer proteinhaltigen Lösung, die an die verbleibenden Bindungsflächen der Vertiefung bindet, um Hintergrundinterferenzen zu reduzieren.

Fügen Sie das Kernfraktionslysat des Mausgehirns hinzu. Das Zielprotein im Lysat bindet spezifisch an die monoklonalen Antikörper.

Fügen Sie unmarkierte polyklonale Antikörper hinzu, erkennen und binden Sie an Epitope auf dem Protein, das an primäre monoklonale Antikörper auf der Elektrode gebunden ist. Fügen Sie spezifische Sekundärantikörper hinzu, die mit dem Rutheniumkomplex markiert sind und an die unmarkierten Antikörper binden. Fügen Sie einen geeigneten Puffer hinzu, der Tensid enthält – das eine geeignete Umgebung für die ECL-Erzeugung bietet – und Tripropylamin (TPA).

Setzen Sie die Multiwell-Platte in das ECL-Detektionssystem ein. Beim Anlegen von Potential über die Elektroden wird der an die Antikörper gebundene Rutheniumkomplex oxidiert. Gleichzeitig wird das TPA oxidiert und verliert spontan ein Proton.

Das resultierende TPA-Radikal reduziert den oxidierten Ruthenium-Komplex in seinen angeregten Zustand. Nach der Entspannung in seinen Grundzustand emittiert der Ruthenium-Komplex ein Photon, das vom Photodetektor detektiert wird.

Die gemessene Lichtintensität ist repräsentativ für die spezifische Proteinkonzentration des Lysats.

Nehmen Sie die 96-Well-Platte aus dem Kühlschrank und entfernen Sie die Folie. Entfernen Sie die Antikörper-Beschichtungslösung aus den Vertiefungen, indem Sie sie in einen Abfallbehälter schnippen. Klopfen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die restliche Lösung zu entfernen.

Geben Sie als Nächstes 125 Mikroliter Blockierlösung in jede Vertiefung. Verschließe die Platte dann wieder mit Klebefolie. Stellen Sie die Platte auf einen orbitalen Mikrotiterplattenschüttler, stellen Sie sie auf 800 U/min und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Tauen Sie ein Fläschchen mit MeCP2- oder TAT-MeCP2-Proteinstammlösung, Lysate aus dem Gehirn von Mäusen und HDF-Lysate auf Eis auf. Verdünnen Sie die Proteinstammlösung in sauberen Röhrchen, wie in Tabelle 2 des Manuskripts beschrieben.

Verdünnen Sie anschließend die Lysatproben. Verwenden Sie für die Lysate des Mausgehirns 1 bis 20 Mikrogramm pro 25 Mikroliter Lysepuffer. Für das HDF-Lysat fügen Sie 0,25 bis 1 Mikrogramm pro 25 Mikroliter Lysepuffer hinzu.

Nachdem die 96-Well-Platte 90 Minuten lang inkubiert wurde, entfernen Sie die Blockierungslösung aus den Wells, indem Sie sie in einen Abfallbehälter schnippen. Klopfen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die restliche Lösung zu entfernen. Waschen Sie dann die Platte 3 Mal mit 150 Mikrolitern Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.

Geben Sie 25 Mikroliter Standards und Proben in die Vertiefungen der 96-Well-Platte. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie weitere vier Stunden bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln von 800 U/min.

Tauen Sie den unmarkierten Nachweisantikörper, polyklonales Kaninchen-Anti-MeCP2, auf Eis auf. Verdünnen Sie den Antikörper mit einer Verdünnungslösung im Verhältnis 1:6000. Wenn die 96-Well-Platte auf dem Schüttler inkubiert ist, entfernen Sie die Standards und Proben, indem Sie die Platte in einen Abfallbehälter schnippen. Klopfen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die restliche Lösung zu entfernen.

Waschen Sie die Platte 3 Mal mit 150 Mikrolitern Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen. Geben Sie mit der Mehrkanalpipette 25 Mikroliter unmarkierte Nachweis-Antikörperlösung in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln bei 800 U/min.

Holen Sie sich den spezifischen Sekundärantikörper aus dem Kühlschrank und legen Sie ihn auf Eis. Der Sekundärantikörper wird in einer Assay-Verdünnungslösung verdünnt und vorsichtig gemischt.

Um den freien, unmarkierten Nachweisantikörper von der 96-Well-Platte zu entfernen, schnippen Sie ihn in den Abfallbehälter und klopfen Sie dann mit der Platte auf ein Papiertuch. Nachdem Sie die Platte, wie zuvor beschrieben, 3-mal gewaschen haben, geben Sie mit der Mehrkanalpipette 25 Mikroliter Sekundärantikörper in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln bei 800 U/min.

Entfernen Sie den freien Sekundärantikörper, indem Sie ihn in den Abfallbehälter schnippen, klopfen Sie die Platte auf ein Papiertuch und waschen Sie die Platte dann dreimal, wie zuvor beschrieben.

Geben Sie in jede Vertiefung der Platte 150 Mikroliter 1X Tris-basierten Gold-Lesepuffer mit Tensid, der Tripropylamin als Co-Reaktant für die Lichterzeugung enthält.

Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, verwenden Sie umgekehrte Pipettiertechniken. Platzieren Sie die 96-Well-Platte mit einem Elektrochemilumineszenz-Detektionssystem auf der Mikrotiterplatten-Plattform.

Mit der eingebauten CCD-Kamera können Sie sofort mit der Datenerfassung beginnen. Erfassen Sie die Signalzählungen, die den relativen Lichteinheiten entsprechen und direkt proportional zur Lichtintensität sind.