Oberflächenplasmonenresonanz zur Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen mit einem Sensorchip

Um eine Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) zur Untersuchung der biomolekularen Wechselwirkungen durchzuführen, beginnen Sie mit einem Sensorchip, der über einem SPR-Detektor in einer Durchflusszelle positioniert ist. Dieser metallbeschichtete Sensorchip hat eine Schicht aus Hydrogelmaterial, die auf der Chipoberfläche abgeschieden ist, wodurch er sich besser für die Immobilisierung von Proteinen eignet.

Überlagern Sie den Chip mit viralen Peptiden, die mit dem Hydrogel interagieren und sich auf der Oberfläche immobilisieren. Mit einer alkalischen Abschrecklösung waschen, die unspezifische Proteinwechselwirkungen verhindert.

Direktes polarisiertes Licht auf den Chip. Beim Resonanzwinkel absorbieren die Metallelektronen dieses Licht und schwingen, wodurch die Intensität des reflektierten Lichts im entsprechenden Reflexionswinkel reduziert wird.

Der Photodetektor sammelt dieses reflektierte Licht, und der Prozessor wandelt dieses Signal in die Grundlinie um und erzeugt ein Sensorgramm – ein Diagramm, das die Sensorreaktion im Zeitverlauf darstellt.

Fließen Sie eine Lösung eines antiviralen Mittels in die Durchflusszelle. Während des Flusses interagieren die antiviralen Wirkstoffe mit den immobilisierten viralen Peptiden auf dem Chip. Diese Assoziation verändert den Brechungsindex, wodurch sich der Winkel und die Intensität des reflektierten Lichts ändert, was letztendlich zu einer Sensorreaktion führt.

Fügen Sie einen Waschpuffer mit hoher Ionenstärke hinzu, der die Wechselwirkung zwischen den beiden Molekülen stört, was zu ihrer Dissoziation führt und die Sensorreaktion verringert.

Analysieren Sie die Form des Sensorgramms und beurteilen Sie die Assoziation und Dissoziation der beiden Moleküle, die für biomolekulare Wechselwirkungen entscheidend sind.

Verwenden Sie für das Zweikanal-SPR-System HBS-EP+ als Laufpuffer, 10 Millimolare Glycinsalzsäure mit einem pH-Wert von 1,5 bis 1,6 als Regenerationspuffer und schalten Sie den Entgaser, den Autosampler und die Pumpe des Geräts ein. Waschen Sie dann das gesamte System 1 Stunde lang mit doppelt destilliertem Wasser.

Als nächstes tropfen Sie Immersionsöl auf den Detektor und montieren Sie einen Glassensorchip, der mit einem dünnen Goldfilm beschichtet und auf der Oberseite mit Carboxymethyldextran-Hydrogel funktionalisiert ist, direkt auf den Detektor unterhalb der Durchflusszelle mit drei Anschlüssen. Korrigieren Sie dann die Einstellung, indem Sie die Handhabung nach unten ziehen.

Um die proteinhaltigen Liganden auf Sensorchips zu immobilisieren, öffnen Sie eine Run-Tabelle, indem Sie in der Menüleiste auf Form klicken, und Run Table Editor in der integrierten SPRAutoLink-Software. Wählen Sie dann BASIC_Immobilization aus der Liste der verfügbaren Lauftabellen aus und klicken Sie auf und folgen Sie den Schritten des experimentellen Verfahrens auf dem Computerbildschirm.

Klicken Sie anschließend im Abschnitt Formular auf Sample Set Editor, um die Reagenzienliste für zwei Racks auszufüllen, die für weitere Analysen im Autosampler platziert wurden. Klicken Sie in der Menüleiste auf Autosampler Sampler Direct Control als Werkzeug, um die Racks nach vorne oder hinten zu bringen, und wählen Sie 4 Grad Celsius als Betriebstemperatur.

Starten Sie die Pumpe, um doppelt destilliertes Wasser zu infundieren, indem Sie auf Tools und "Pump Direct Control" klicken, und zeichnen Sie Daten auf, indem Sie auf "SPR Instrument Direct Control" klicken, und starten Sie jedes Mal im neu erscheinenden Fenster. Nachdem Sie die Koppelreagenzien in 300-Mikroliter-Fläschchen gegeben haben, legen Sie diese in die Autosampler-Racks und starten Sie die Lauftabelle mit einem Klick auf Ausführen.

Für die einfache Protein-Protein-Interaktion nach dem Befüllen der Pumpe mit 25.000 Mikrolitern pro Minute führen Sie eine Basiseinstellung für 30 Sekunden durch. Lassen Sie die anschließende Baseline-Einstellung 1,5 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser warten, bevor Sie die aktivierte Chipoberfläche mit 1 molaren Ethanolaminhydrochlorid, pH 8,5, abschrecken. Schalten Sie dann die Röhrchen vom Flüssigprobenehmer auf den Entgaser von doppelt destilliertem Wasser in die Flasche mit HBS-EP+ um.

Klicken Sie auf Formular, scrollen Sie nach unten und wechseln Sie zu "Nachbearbeitung", indem Sie auf diesen Betriebsmodus klicken. Klicken Sie dann auf Hinzufügen, um die im Laufe der Zeit generierten Bindungskurven im Datendiagramm für jede Flusszelle auszuwählen und die Überlagerung als Scrubber-Datei zu exportieren. Klicken Sie anschließend auf Datei, um die Optionen zum Speichern von Dateien zu öffnen und Antwortkurven zu erhalten, indem Sie die linke und rechte Kurve ausrichten und die Signale des zweiten Referenzkanals von denen des Ligandenkanals subtrahieren.