Name: Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Erfahren Sie die kalibrierungsfreie Quantifizierung von Protein-Homo-Oligomerisierung mittels Fluoreszenz-Fluktuationsspektroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen von Protein-Protein-Interaktionen für die Arzneimittelentwicklung.

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Diese Arbeit wurde von Wellcome Trust unterstützt gewähren R.N 105278/Z/14/2 Der Wellcome Trust Centre for Human Genetics wird vom Wellcome Trust Core Award 203852/Z/16/2 finanziert. Arbeit in der c.s.-Gruppe wird von Cancer Research UK (C20724/A14414) und des European Research Council unter Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm Grant 647278 der Europäischen Union unterstützt.

(1) FKBP12 F36V - mVenus Reinigung
<ol><li>Transformieren Sie (DE3) pLysS Zellen mit pET22b Vektor, monomerized menschlichen FKBP12F36V12 und N-terminale His6 und mVenus-Tags (Vektor auf Anfrage erhältlich) enthält. Platte Zellen auf LB-Agar mit 50 µg/mL Ampicillin und 34 µg/mL Chloramphenicol ergänzt.</li>
	<li>Transformierte Kolonien in 100 mL LB Starterkultur und wachsen für 16-20 Stunden bei 37 ° C mit schütteln.</li>
	<li>Verdünnen Sie dichten Starterkultur (OD600 > (1) 1: 100 in LB-Medium (2 x 500 mL Chargen) und wachsen für 2-3 Stunden zu OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 u/min).</li>
	<li>Cool Kulturen auf Eis. Mit 250 µM IPTG induzieren und 16-20 Stunden bei 21 ° C, 200 u/min zu wachsen.</li>
	<li>Ernten Sie Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 20 Minuten.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Pellet in 40 mL IMAC Puffer ein (20 mM Natriumphosphat pH 7.5, 500 mM NaCl, 3 mM Imidazol, 1 mM β-Mercaptoethanol) mit EDTA-freie Protease-Inhibitoren (1 Tablette pro Zelle Pellet) ergänzt.</li>
	<li>Beschallen Zellen (500 Watt, 20 kHz, 40 % Amplitude, 9 s auf, 11 s aus für 15 min) auf Eis und Ernte lösliche Material durch Zentrifugation bei 20.000 x g.</li>
	<li>Transfer lösliche lysate zu einem konischen Kolben und 2 mL Harz (siehe Tabelle der Materialien). 1 Stunde mit 105 u/min inkubieren Hinweis: Nickel Sepharose kann auch für diesen Schritt IMAC verwendet werden.</li>
	<li>Ernten Sie Harz zu und waschen Sie mit 250 mL IMAC Puffer A, gefolgt von 500 mL IMAC Puffer B (20 mM Natriumphosphat pH 7.5, 500 mM NaCl, 7 mM Imidazol, 1 mM β-Mercaptoethanol). Hinweis: Erhöhen Sie um 50 mM Imidazol wenn Nickel Sepharose Harz verwenden.</li>
	<li>Eluieren Sie His6-markierte Protein mit IMAC Puffer C (20 mM Natriumphosphat pH 7.5, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol, 1 mM β-Mercaptoethanol).</li>
	<li>Spritzen auf eine Größe Ausgrenzung Spalte (siehe Tabelle der Materialien) in 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT equilibriert. FKBP12F36V hat seinen Höhepunkt Elution bei 87,71 mL auf die Spalte, die wir verwendet.</li>
	<li>Reinheit über SDS-PAGE und Pool zu beurteilen und bei Bedarf konzentrieren.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Multiwell Plate Array
<ol><li>Auftauen der gereinigten FKBP12F36V (oder mit der Bezeichnung Protein des Interesses) von-80 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung von 100 nM gereinigt FKBP12F36V (mittlere, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DVB-t). Beschallen Sie und Zentrifugieren Sie (schnelle Runde von 13.000 u/min), um die Bildung von Aggregaten zu verhindern.</li>
	<li>Pipette 100-200 µL in eine Kammer 8 gut Beobachtung mit einem Glasboden.</li>
	<li>Hinzu kommt die BB Dimerizer Endkonzentrationen von 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 und 500 nM12,13.</li>
	<li>Als Referenz, bereiten Sie eine Lösung von 100 nM mVenus allein zur Aggregation und Niederschlag Auswirkungen zu bewerten und einen Helligkeitswert für das Monomer mit den gleichen Einstellungen Erwerb zu erholen.</li>
</ol>3. Kalibrierung-freie konfokale Erwerb
<ol><li>Starten Sie die konfokale System (Abbildung 1). Kein Licht Mikroskop konfokale Abtastsystem ausgestattet mit digitaler Detektoren oder gut charakterisierten analogen Detektoren8, und in der Lage zu halten eine Konstante Verweilzeit für jedes Pixel erworben würde funktionieren.</li>
	<li>Legen Sie den Strahlengang Erregung:<ol>
<li>Schalten Sie das 514 nm Laser und setzen es bei 20-100 nW Strom am Ausgang des Ziels (für FKBP12F36V-mVenus).</li>
		<li>Wählen Sie das 63X1.4NA Ziel oder ein Halsband Korrektur Wasser eintauchen Ziel für FCS entwickelt.</li>
		<li>Schalten Sie ein HyD, APD oder kalibrierten PMT-Detektor. Detektoren in der Lage, Photon counting sind vorzuziehen, da in diesem Fall, Berechnung von S, Offset und σ0-2 sind nicht erforderlich.</li>
		<li>Wählen Sie die Emissions-Fenster von 520-560 nm</li>
		<li>1 luftig Einheit für die entsprechende Emission ~ 545 nm die Lochblende festgesetzt.</li>
		<li>Stellen Sie den Erwerb Modus mit 16 x 16 Pixel</li>
		<li>Die Pixel wohnen Zeit twohnen so eingestellt, dass es tRahmen erfüllt >> TD >> twohnen, wo D die Verweilzeit des diffundierende Protein- und t ist Rahmen ist die Frame-Rate. Das entsprach Einstellen der Haltezeit ~ 13 µs. Hinweis: Einige kommerzielle Hersteller hatte Scanner, die nicht die Verweildauer pro Pixel konstant hielten. Diese Konstanz ist entscheidend für die Methode funktioniert.</li>
		<li>Legen Sie die Pixelgröße bei ~ 120 nm.</li>
		<li>Wählen Sie den Xyt -Übernahme-Modus und wählen Sie die Anzahl der Frames pro Akquisition und gut (zum Beispiel 5.000) erworben werden.</li>
		<li>Wenn das System mit hohem Durchsatz-Modus ausgestattet ist, stellen Sie die Koordinaten jedes gut und die Zahl der Übernahmen pro Bohrloch um den Prozess zu automatisieren. Hinweis: Achten Sie, die Anwesenheit von einem Wasserspender für Wenn ein Eintauchen-Ziel verwenden.</li>
		<li>Wenn das System ist ausgestattet mit eine Perfusion System laden die BB-Lösung und Programmieren der Perfusion beginnen rechts-nach 5000th Rahmen um die Kinetik der Dimerisierung beim Erwerb von z. B. 10.000 Bilder zu bewerten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Einen Tropfen Öl in das Öl eintauchen Objektiv / Wasser wenn ein Halsband Korrektur Wasser eintauchen Ziel für FCS entwickelt.</li>
	<li>Montieren Sie die 8 gut Beobachtung Kammer in die Stufe.</li>
	<li>Wählen Sie den richtigen Brunnen und konzentrieren Sie sich auf die Lösung. Hinweis: Wichtig: vermeiden Sie mit Schwerpunkt in der Nähe der unteren Glas, Reflexion und Streuung zu vermeiden. Wenn tiefer Konzentration in der Lösung, trennen Sie die Option automatische Fokus.</li>
	<li>Starten Sie den Erwerb und speichern Sie die resultierenden Stapel Bilder im TIFF-Format zu.</li>
</ol>4. detrend und Helligkeit Analyse mit der R-Paket-Nandb
<ol><li>Als eine Vorverarbeitung Qualitätsprüfung verwenden Sie ImageJ14 werfen einen Blick auf die Bilder und die Intensität Profil wiederherstellen wie in Abbildung 2einegezeigt. Dies ist nützlich, um festzustellen, ob zuviel Immunofluoreszenz aufgetreten ist. Wenn es zu viel bleichen gibt, eignet sich die Daten nicht für weitere Analysen. Hinweis: ImageJ kann auch Bilder in TIFF aus kommerziellen Formaten konvertieren nützlich sein. Die nachfolgend beschriebene Nandb-Software funktioniert nur mit TIFF-Dateien.</li>
	<li>Downloaden Sie und installieren Sie R und RStudio15,16. Es empfiehlt sich, downloaden und installieren Sie R zuerst, dann RStudio. Hinweis: Was folgt, ist eine Beschreibung, wie das Nandb R-Paket verwenden. R Sprachkenntnisse ist nicht erforderlich, verwenden Sie Nandb, aber es Leben einfacher machen wird.</li>
	<li>Installieren Sie das Nandb-Paket.<ol>
<li>Öffnen Sie RStudio und geben Sie in der Konsole, install.packages("nandb") und warten Sie die Installation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lernen Sie Nandb kennen<ol>
<li>Überprüfen Sie die manuelle17.</li>
		<li>Überprüfen Sie die integrierte RStudio-Hilfe für verschiedene Funktionen. Die wahrscheinlichste Funktion verwendet werden wird, mit brightness() werden. Anzeigen die Hilfe-Datei für diese Funktion durch Eingabe? Brightness() an der Konsole.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Helligkeit zu berechnen<ol>
<li>Also muss man eine Image-Datei auf dem Desktop mit dem Namen img001.tif (Beachten Sie, dass "Nandb" nur mit TIFF-Dateien funktioniert). Man kann die Helligkeit des Bildes berechnen: b <-Helligkeit ("~/Desktop/img001.tif", Tau = "auto")<ol>
<li>Dies weist die Helligkeit des Bildes an die Variable b in R. Das Tau = "Auto" wird sichergestellt, dass das Bild korrekt vor Helligkeit Berechnung trendbereinigte ist. Die häufigste, was hier zu tun ist, berechnen Sie den Mittelwert oder mittlere Helligkeit des Bildes. Dies kann man durch Eingabe von mean(b) oder median(b). Man kann auch die Helligkeit Bild auf dem desktop mit schreiben. ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sagen Sie, man hat Ordner voller Bilder Images_folder auf dem Desktop und muss man die Helligkeiten dieser Bilder zu berechnen und die Helligkeit Bilder als TIFF-Dateien zu schreiben. Dann sehen? brightness_folder(). Diese Funktion verarbeitet einen ganzen Ordner auf einmal: Brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", Tau = "auto") Dies ist besonders gut für diejenigen, die eine Software, die sie zu R bevorzugen, da aller Dateien in einem einzigen Befehl verarbeitet werden, und dann man weiter mit der Ausgabe Helligkeit TIFF-Bilder in ihrer gewählten Software arbeiten gehen kann, sei es ImageJ14 , Python oder etwas anderes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pair+forster+resonance+energy+transfer%3A+A+versatile+tool+to+investigate+protein+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics.</a> BioEssays. 40, (2018).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
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<li>Butkevich, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+fluorescent+dyes+for+live-cell+labeling%3A+synthesis%2C+spectra+and+super-resolution+STED%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%3A+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED.</a> Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

N & B ist eine Technik, um Multimerization mit kommerziellen Licht Scannen konfokale Mikroskopen ausgestattet mit digitaler Detektoren erkennen. Dieser Ansatz ist sehr attraktiv im Vergleich zu single Point FCS, FCC und SmFRET weil es kostenlose Kalibrierung und die Berechnung der Helligkeit ist unkompliziert und Konzentration unabhängigen6. Es ist von großer Bedeutung, jedoch für Bleichen und langfristige intensitätsschwankungen zu korrigieren, bevor Sie Helligkeit Berechnungen9...

Protein-Protein Interaktionen ich n-vitro-
Traditionell sind die Kristallographie und Kernspinresonanz-Experimenten mit Kryo-Elektronenmikroskopie (CryoEM) kombiniert die Technologien entschieden, genau zu beschreiben, die dreidimensionale Architektur der Proteine und ihre Funktion durch Ableiten hinterfragen ihre hochauflösende strukturelle Details. Proteine, jedoch sind keine statischen Strukturen und können eine Vielzahl von Konformationsänderungen und Schwingungen in Zeit und Raum zu unterziehen. Deshalb ist die strukturelle Informationen aus kristallographischen oder CryoEM Daten müssen mit anderen Techniken (z. B. Molekulardynamik-Simulationen und Einzelmolekül-Techniken) ergänzt werden: die Funktion eines Proteins ist im Zusammenhang mit seiner Konformationsänderungen Änderungen und Interaktionen und diese Information ist nicht vorhanden in einer statischen Struktur. Um intramolekularer Dynamik untersuchen, sind Techniken, basierend auf einzelnen Moleküls Forster Resonanz Energietransfer (SmFRET) sehr effektiv1. Diese Ansätze sind verschiedene Subpopulationen von Molekülen in komplexen Medien beurteilen können. Dies ist sehr wichtig, da diese Änderungen schnelle sind und während der Erfassung der Daten (d. h. Nanosekunde, zweite Reihe treten).
Zwei Hauptansätze werden häufig eingesetzt, um zu erkennen und diese Änderungen zu quantifizieren: Proteine in Lösung und Oberfläche-Immobilisierung. Für den Nachweis der Inter molekularen Wechselwirkungen und insbesondere den Prozess der Dimerisierung von Liganden induzierte, ist SmFRET nicht immer das beste Werkzeug. In der Tat Bund richtet sich nicht nur auf der Strecke (≈10 nm), sondern auch auf die Ausrichtung der beiden Dipole (Donor und Akzeptor, χ2) und die Überlappung der Spender-Emission mit den Akzeptor Absorptionsspektren2, aber vielleicht diese letzte Bedingung ist weniger vorausgesetzt, dass der Experimentator kann wählte wichtig, das richtige Paar Bund. Ein besonderer Nachteil von SmFRET zum Sondieren Homo-Dimerisierung stammt aus der Kennzeichnung des Proteins des Interesses: für Hetero SmFRET Dimerisierung kann nur festgestellt, bis zu 50 % (d.h., Hetero-FRET werden nur Donor-Akzeptor zu erkennen und Akzeptor-Spender Homo-Dimere aber nicht Spender Spender oder Akzeptor-Akzeptor, die die anderen 50 % von der Dimere). Die Verwendung von Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie (FCS) und Derivaten (FCC, etc.3), Protein Verbreitung Konstanten und verbindliche Konstanten in Vitro zu ermitteln ist eine weitere Alternative. Diese Ansätze sind nicht in der Lage, vollständig Homo-Dimerisierung entweder zu quantifizieren, wie FCS 1 Maßnahmen Konzentration und Diffusion, und den Radius und die Verbreitung Koeffizienten eines diffundierende Teilchen sind sehr schlecht das Molekulargewicht abhängig; zum Beispiel wird ein 10-divisibel Anstieg des Molekulargewichtes nur eine 2.15 Falte Änderung in der Verbreitung Koeffizient4verbunden. Bei zweifarbigen FCS oder FCC werden nur 50 % der Homo-Dimere aus dem gleichen Grund wie oben gesehen. Praktische und quantitative Ansätze, Homo-Dimerisierung in Vitro und in Vivo zu erkennen sind Homo-Bund5 und der Anzahl und der Helligkeit (N &amp; B)6. Angesichts der Tatsache, dass Homo-FRET erfordert spezielle Instrumente Erholung von der Anisotropie-Wert (z. B. optische Elemente/Analyzer, die parallele und senkrechte Polarisation wiederherzustellen), N &amp; B präsentiert hier als eine günstige Methode, um erkennen Sie Protein Homo-Dimerisierung und Aggregation. Es kann sein, beschäftigt, sowohl in Vitro und in Vivo eine kommerzielle Einrichtung.
Anzahl und Helligkeit
N &amp; B wurde erst kürzlich überarbeitete7. Dieser Beitrag konzentriert sich auf die Anwendung der Technik in lebenden Zellen. Es lohnt sich, reproduzieren die mathematische Formalismus hier als diese Gleichungen auf die Daten angewendet werden gesammelt in Vitro. Erstens ist es notwendig, einige Begriffe und mathematische Mengen zu definieren:
<ul><li>Eine Entität ist eine Reihe von Molekülen, die miteinander verbunden sind.</li>
	<li>Die Helligkeit ε einer Entität ist die Anzahl der Photonen, die es pro Zeiteinheit (pro Frame) aussendet.</li>
	<li>
n ist die Anzahl der Elemente vorhanden.</li>
	<li>Für eines bestimmten Pixels im Laufe einer Bilderserie ist &lt; i &gt; seine mittlere Intensität und σ2 die Varianz in ihrer Intensität.</li>
</ul>Dann, mit Photon counting Detektoren und vorausgesetzt, mobile Einheiten und keinen Hintergrund,
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq2.jpg">
Dabei ist N die scheinbare Zahl und B ist die scheinbare Helligkeit. Dies führt zu
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq4.jpg">
Dalal Et al. 8 zeigte, dass mit analogem Equipment, man drei Korrektur Begriffe braucht: S-Faktor, der Hintergrund- Offsetund die Auslesen Lärm σ02. Dann wieder vorausgesetzt, mobile Einheiten,
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq6.jpg">
Geben
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq8.jpg">
Beachten Sie, dass die obige Gleichung für unterscheidet, die in Dalal Et Al. 8 und einer nachträglichen Prüfung. 7 in Dalal Et Al. S im Nenner wurde durch einen Tippfehler verzichtet und dieser Fehler wurde bei der Überprüfung reproduziert. Die obigen Gleichung ist die richtige. Anweisungen für die Messung von S, Offset und σ02 - zusammen mit einer Erläuterung ihrer Bedeutung - sind gegeben durch Dalal Et Al. 8
Die Helligkeit ε ist proportional zu den Oligomeren Zustand der diffundierende Entitäten: ε werden zweimal für Dimere so groß, wie es für Monomere, dreimal so groß für Trimere ist, wie es für Monomere, für Hexamers doppelt so groß ist wie für Trimere und so weiter. Auf diese Weise messen die Helligkeit ε kann man jede Art von Multimerization quantifizieren.
Gibt es eine Mischung aus Oligomeren Staaten vorhanden, ist Anzahl und Helligkeit nicht in der Lage erholt die Oligomeren Einzelstaaten vorhanden. Dies ist eine Einschränkung der Technik.
Detrend-Algorithmus und Nandb software
Die Bedeutung der Korrektur für Immunofluoreszenz wurde betont zuvor9. Immunofluoreszenz tritt unweigerlich während der Lichtmikroskopie Experimente im Zeitraffer-Modus; sowohl in lebenden Zellen und in Vitro. Viele Ansätze wurden in der Literatur zu korrigieren zum Bleichen7beschrieben. Die exponentielle filternde Technik mit automatischer Wahl der detrending Parameter T ist die derzeit besten. Es ist kostenlos, open Source Software Nandb9integriert. In der Tat kann Software, die die Benutzer manuell wählen ihre detrending Parameter erfordert zu falschen Ergebnissen führen, da diese Parameter Wahl wahrscheinlich willkürlich und falsch sind. Der Automatische Algorithmus prüft die Daten und bestimmt den entsprechenden Parameter, ohne die Notwendigkeit der Benutzer eingreifen9. Auch mit die beste Wahl von glättende Parameter detrending hat seine Grenzen und funktioniert auch nur mit Immunofluoreszenz Prozentsätze niedriger als 25 %, wie abgebildet, mit Simulationen9. Interessant ist, wenn Sie die automatische detrending Routine zu verwenden, die Genauigkeit ist so, dass man mit geringer Helligkeitswerten arbeiten kann (sogar B &lt; 1.01), und somit geringe Intensitäten, und immer noch präzise genug, um Homo-Dimerisierung zu quantifizieren.
Immunofluoreszenz verursacht auch ein weiteres Problem: die Anwesenheit von Photobleached Fluorophore in einem komplexen Multimer. Dies macht z. B. ein Trimer erscheinen wie ein Dimer, wenn eines der drei Geräte in das Trimer nicht fluoreszierenden ist. Hur und Mueller10 zeigte, wie man dies zu korrigieren und diese Korrektur wurde auch in einer nachträglichen Prüfung7hervorgehoben. Die Nandb-Software enthält diese Korrektur-9.
Die FKBP12 F36V System
FKBP12F36V ist ein Protein, das natürlich nicht oligomerize aber bekannt ist, auf den Zusatz von AP20187 Medikamenten (umgangssprachlich bekannt als die BB dimerizing Liganden)11,12Dimere. Dies macht es ein idealer Prüfstein für Anzahl und Helligkeit: mit beschrifteten FKBP12F36V, eine Verdoppelung der Oligomere Zustand nach Zugabe von BB beobachtet werden sollte.

<table><tbody><tr><td>RosettaTM (DE3) pLysS-Zellen</td><td>Novagen</td><td>70956-3</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Substanz-ID 329824407</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Substanz-ID: 24892250</td><td></td></tr><tr><td>LB Starterkultur</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Substance ID 329815691</td><td></td></tr><tr><td>IMAC-Puffer</td><td>Medicago</td><td>09-1010-10</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-freie Proteasehemmer&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON-Harz</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nickel-Sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 16/60 Säule</td><td>GE Healthcare Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasboden 8-Well-Beobachtungsschale</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

kalibrierung-kostenlose in-vitro- quantifizierung von protein homo-oligomerisierung mit kommerziellen instrumentierung und kostenlose open source-helligkeit-analyse-software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Anzahl und Helligkeit ist eine Kalibrierung-freie Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie (FFS) Technik zum Nachweis von Protein Homo-Oligomerisierung. Es kann eingesetzt werden, mit einem herkömmlichen confocal Mikroskop mit digitaler Detektoren ausgestattet. Ein Protokoll für den Einsatz von Technik in Vitro wird mittels einem Use Case gezeigt wo Zahl und Helligkeit zu genau den Oligomeren Stand der mVenus versehenen FKBP12F36V vor und nach der Zugabe der dimerizing Droge AP20187 quantifizieren gesehen werden kann. Die Bedeutung der Verwendung der richtigen Mikroskop Aufnahmeparameter und die korrekten Daten-Vorverarbeitung und Analyse-Methoden werden diskutiert. Insbesondere wird die Bedeutung der Wahl der Immunofluoreszenz Korrektur betont. Diese kostengünstige Methode kann verwendet werden, um Protein-Protein-Interaktionen in vielen biologischen zusammenhängen zu studieren.

Detrending und Monomeren Helligkeit
Sobald die Daten erhalten hat, kann man die Helligkeit Berechnungen durch, um festzustellen, die Oligomeren Zustand des Proteins des Interesses in der Lösung starten. Auch wenn die Wirkung der Bleiche in Lösung möglicherweise nicht so drastisch wie es sein kann, in Vivo, die Intensität-Ablaufverfolgung wird wahrscheinlich noch nicht stationäre bedeuten, möglicherweise...

Dieses Protokoll beschreibt einen Kalibrierung-freie Ansatz zur Quantifizierung der Protein Homo-Oligomerisierung in Vitro basierend auf Fluoreszenzspektroskopie Fluktuation mit kommerziellen Licht Rasterelektronenmikroskopie. Die richtige Übernahme Einstellungen und Analysemethoden werden angezeigt.

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Wirkstoffscreenings zu beantworten, wie z. B. die Aufklärung der Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren auf sehr niedrige Konzentrationen für Protein-Protein-Wechselwirkungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ohne Kalibrierung ist, in jedes konfokale Mikroskop implementiert werden kann und sehr kleine Mengen markierter Proteine verwendet. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Entwicklung von Krebsmedikamenten, niedermolekularen Inhibitoren und verschiedenen Fusionshemmern, da sie quantitative Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen liefert.Obwohl diese Methode in vitro Einblicke in Proteininteraktionen und -aggregationen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. die Dynamik lebender Zellproteine und Zell-Zell-Interaktionen. Transformieren Sie zunächst pLysS-Zellen mit einem pET-22b-Vektor, der monomerisierte humane FKBP12- und N-terminale His6- und mVenus-Tags enthält. Nachdem sich die Zellen von der Inkubation und dem Hitzeschock erholt haben, werden sie auf LB-Agar aufgebracht, der mit Antibiotika ergänzt wird.Übertragen Sie die transformierten Völker in eine 100-Milliliter-LB-Starterkultur und wachsen Sie 16 bis 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Nach der Inkubation verdünnen Sie die dichte Starterkultur um eins bis 100 in LB-Medium in zwei 500-Milliliter-Chargen. Wachsen Sie dann zwei bis drei Stunden lang auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,6 bis 0,8 Nanometern.Nach dem Abkühlen der Kulturen auf Eis die Proteinproduktion mit 250-mikromolarem IPTG induzieren. Züchten Sie die Kulturen 16 bis 20 Stunden lang bei 21 Grad Celsius und 200 U/min. Ernten Sie dann die Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 g für 20 Minuten.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 40 Millilitern IMAC-Puffer A, ergänzt mit EDTA-freien Proteaseinhibitoren. Beschallen Sie nun die Zellen mit 500 Watt, 20 Kilohertz und 40 % Amplitude bei neun Sekunden an, 11 Sekunden aus für 15 Minuten auf Eis. Nach der Beschallung wird das lösliche Material durch Zentrifugation bei 20.000 g für eine Stunde bei vier Grad Celsius geerntet.Lösliches Lysat in einen ermächtigten Kolben geben und zwei Milliliter TALON-Harz hinzufügen. Lassen Sie die Suspension eine Stunde lang mit einer Umdrehung von 105 U/min inkubieren. Ernten Sie nun das Harz und waschen Sie es mit 250 Millilitern IMAC-Puffer A, gefolgt von 500 Millilitern IMAC-Puffer B.Eluieren Sie His6-markiertes Protein unter Verwendung des IMAC-Puffers C.Injizieren Sie das Eluat auf eine voräquilibrierte Größenausschlusssäule und sammeln Sie den FKBP12-Peak, der bei etwa 87,7 Millilitern eluiert.Beurteilen Sie die Reinheit des Proteins über SDS-PAGE und bündeln und konzentrieren Sie sich nach Bedarf. Um das Multiwell-Plattenarray einzurichten, bereiten Sie zunächst eine Lösung aus 100-nanomolar gereinigtem FKBP12 in demselben Puffer her, der auch für die Größenausschlusschromatographie verwendet wird. Beschallen und zentrifugieren Sie mit einer schnellen Drehzahl von 13.000 U/min, um die Bildung von Zuschlagstoffen zu verhindern.Pipettieren Sie nun 100 bis 200 Mikroliter des verdünnten Proteins in eine Beobachtungskammer mit acht Vertiefungen und Glasboden. Geben Sie den BB-Dimerizer in Endkonzentrationen von 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 und 500 Nanomolar hinzu. Bereiten Sie als Referenz eine Lösung von 100-nanomolarer mVenus allein her, um potenzielle Aggregations- und Ausfällungseffekte zu bewerten und einen Helligkeitswert für das Monomer mit den gleichen Erfassungseinstellungen wiederherzustellen.Jedes konfokale Licht-Scanning-Mikroskop-System, das mit digitalen Detektoren oder gut charakterisierten analogen Detektoren ausgestattet ist und in der Lage ist, eine konstante Verweilzeit für jedes erfasste Pixel zu halten, kann verwendet werden. Wählen Sie das Wasserimmersionsobjektiv zur Kragenkorrektur, das für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie entwickelt wurde. Geben Sie nun einen Tropfen Wasser in das Wasserimmersionsobjektiv zur Kragenkorrektur.Montieren Sie die Beobachtungskammer mit acht Vertiefungen in die Bühne. Stellen Sie den Anregungsstrahlengang ein, indem Sie den 514-Nanometer-Laser einschalten und ihn am Ausgang des Objektivs auf 20 bis 100 Nanowatt Leistung einstellen. Schalten Sie einen HyD-Melder ein.Detektoren, die in der Lage sind, Photonen zu zählen, sind vorzuziehen. Wählen Sie das Emissionsfenster von 520 bis 560 Nanometern. Verwenden Sie für den Aufnahmemodus eine Größe von 16 x 16 Pixeln.Stellen Sie die Pixelverweilzeit so ein, dass die Framezeit länger ist als die Proteindiffusion und die Pixelverweilzeit viel kürzer ist. Dies entsprach einer Einstellung der Verweilzeit auf ca. 13 Mikrosekunden für das in dieser Demonstration verwendete System. Stellen Sie die Lochblende auf eine Airy-Einheit ein, um die entsprechende Emission von ca. 545 Nanometern zu erreichen.Wählen Sie den XY-Zeiterfassungsmodus und wählen Sie die Anzahl der Frames aus, die pro Aufnahme und Well erfasst werden sollen. Stellen Sie nun die Pixelgröße auf ca. 120 Nanometer ein. Wenn das System mit einem Hochdurchsatzmodus ausgestattet ist, geben Sie die Koordinaten jeder Vertiefung und die Anzahl der Erfassungen pro Vertiefung ein, um den Prozess zu automatisieren.Wenn das System mit einem Perfusionssystem ausgestattet ist, laden Sie die BB-Lösung und programmieren Sie die Perfusion so, dass sie direkt nach dem 5.000. Frame beginnt, um die Kinetik der Dimerisierung bei der Aufnahme von 10.000 Bildern zu bewerten. Wählen Sie die richtige Vertiefung aus, und konzentrieren Sie sich auf die Lösung. Starten Sie dann die Erfassung und speichern Sie den resultierenden Bildstapel im TIFF-Format.Es wurden Sequenzen von 20.000 Bildern von gereinigtem FKBP12 mVenus in 100-Nanometer-Lösung aufgenommen, wie im Protokollabschnitt angegeben. Die Intensität des ersten Frames wird zusammen mit dem mittleren Intensitätsprofil des trendbereinigten Bildes angezeigt. Auch die Helligkeit ohne und mit sanfter Filterung wird angezeigt.Nachdem 10.000 Frames aufgenommen worden waren, wurde der Lösung während der Akquisition das Homodimerisierungsmedikament BB zugesetzt. Jede aufeinanderfolgende Serie von 5.000 Bildern wurde analysiert. Die mittlere Helligkeit fünf Minuten nach der BB-Zugabe betrug 1,010, was einer Verdoppelung entspricht, was auf ein FKBP12-Dimer hinweist.Die Kinetik des Prozesses zeigt eine Verzögerung von etwa zwei Minuten zwischen der BB-Zugabe und der vollständigen FKBP12-Dimerisierung. Ein wichtiger Aspekt bei der Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vitro ist die Produktion und Reinigung Ihres markierten Proteins. Stellen Sie sicher, dass Sie kleine Mengen des markierten Proteins von Interesse haben und dass sich Ihr Protein gemäß Ihrer Analyse nicht aggregiert.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Oberflächenplasmonenresonanz oder die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen wie Dissoziationskonstanten oder Diffusionskoeffizienten zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biophysik, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen im Detail zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reagenzien für die Proteinreinigung äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Schutzbrillen und Handschuhe getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

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Biochemistry

Biochemie

Dieses Video zeigt Experimente mit anschließender Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch den Einsatz von Mikro-gemusterten Oberflächen. Der Ansatz bietet die Möglichkeit, Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu erkennen und verbindet hohe Durchsatz mit der Möglichkeit, quantitative Informationen zu extrahieren.

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Durch den Einsatz einer spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie-System sind auf Pixel-Ebene Karten von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Wirkungsgrade für Zellen, die Membran-Rezeptoren angenommen, dass sie homo-oligomeren Komplexen Form erhalten. Von der Effizienz Karten FRET, sind wir in der Lage, stöchiometrische Informationen über die Oligomer-Komplex unter-Studie zu schätzen.

In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

Dieses Video demonstriert die Technik der Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (FFS) zur Untersuchung der Homo-Oligomerisierung von Proteinen. Fluoreszenzmarkierte Proteine in einer Probe werden bei der Untersuchung der Proteinoligomerisierung mit FFS mit einem Wirkstoff dimerisiert. Während sich die Proteine in das kleine Beobachtungsvolumen hinein- und herausbewegen, wird mit einem konfokalen Mikroskop die Analyse der Helligkeitsschwankungen der fluoreszierenden Moleküle durchgeführt, um den...

Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Homo-Oligomerisierung

Hier berichten wir über Protokolle zum Nachweis endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen und quantifizieren diese Proteinspiegel an Zentromeren-Kinetochoren durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung durch Verwendung von Fixierung (Paraformaldehyd-, Aceton- oder Methanol-Fixierung).

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur dreifarbigen SmFRET Daten und deren Auswertung mit einem 3D-Ensemble Hidden-Markov-Modell zu erhalten. Mit diesem Ansatz können Wissenschaftler kinetische Informationen aus komplexen Protein Systeme, einschließlich der Kooperativität oder korrelierte Interaktionen extrahieren.

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Wir beschreiben einen bildgebenden Ansatz zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von mEGFP-getaggten Rezeptor-Oligomeren, die durch Ligandenbindung in der Plasmamembran lebender Zellen induziert werden. Das Protokoll basiert auf der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie in Kombination mit der Number and Brightness (N&amp;B)-Analyse.

Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

CENP-A-Ubiquitylierung ist eine wichtige Voraussetzung für die CENP-A-Ablagerung am Zentromer, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist. Hier beschreiben wir die Analyse der Massenspektrometrie, um die Ubiquitylierung des MIT EYFP markierten CENP-A-Proteins (EYFP-CENP-A) zu identifizieren.

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle zur biophysikalischen Charakterisierung der ternären Komplexbildung, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert wird, an denen die Ubiquitin-Ligasen Von-Hippel-Lindau E3-Ligase (VHL) und Cereblon (CRBN) beteiligt sind.  Zu den hier dargestellten biophysikalischen Methoden gehören die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Bioschichtinterferometrie (BLI) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC).

Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

Dieses Protokoll kombiniert Massenphotometrie mit einem neuartigen Mikrofluidik-System, um Protein-Protein-Wechselwirkungen mit geringer Affinität zu untersuchen. Dieser Ansatz basiert auf der schnellen Verdünnung hochkonzentrierter Komplexe in Lösung, was Messungen mit geringer Affinität ermöglicht und die Anwendbarkeit der Massenphotometrie erweitert.

Analyse der Proteinkomplexbildung bei mikromolaren Konzentrationen durch Kopplung von Mikrofluidik und Massenphotometrie

Erfahren Sie die kalibrierungsfreie Quantifizierung von Protein-Homo-Oligomerisierung mittels Fluoreszenz-Fluktuationsspektroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen von Protein-Protein-Interaktionen für die Arzneimittelentwicklung.

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software (Video) | JoVE Journal

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