Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Dieses Protokoll beschreibt einen Kalibrierung-freie Ansatz zur Quantifizierung der Protein Homo-Oligomerisierung in Vitro basierend auf Fluoreszenzspektroskopie Fluktuation mit kommerziellen Licht Rasterelektronenmikroskopie. Die richtige Übernahme Einstellungen und Analysemethoden werden angezeigt.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Wirkstoffscreenings zu beantworten, wie z. B. die Aufklärung der Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren auf sehr niedrige Konzentrationen für Protein-Protein-Wechselwirkungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ohne Kalibrierung ist, in jedes konfokale Mikroskop implementiert werden kann und sehr kleine Mengen markierter Proteine verwendet. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Entwicklung von Krebsmedikamenten, niedermolekularen Inhibitoren und verschiedenen Fusionshemmern, da sie quantitative Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen liefert.

Obwohl diese Methode in vitro Einblicke in Proteininteraktionen und -aggregationen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. die Dynamik lebender Zellproteine und Zell-Zell-Interaktionen. Transformieren Sie zunächst pLysS-Zellen mit einem pET-22b-Vektor, der monomerisierte humane FKBP12- und N-terminale His6- und mVenus-Tags enthält. Nachdem sich die Zellen von der Inkubation und dem Hitzeschock erholt haben, werden sie auf LB-Agar aufgebracht, der mit Antibiotika ergänzt wird.

Übertragen Sie die transformierten Völker in eine 100-Milliliter-LB-Starterkultur und wachsen Sie 16 bis 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Nach der Inkubation verdünnen Sie die dichte Starterkultur um eins bis 100 in LB-Medium in zwei 500-Milliliter-Chargen. Wachsen Sie dann zwei bis drei Stunden lang auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,6 bis 0,8 Nanometern.

Nach dem Abkühlen der Kulturen auf Eis die Proteinproduktion mit 250-mikromolarem IPTG induzieren. Züchten Sie die Kulturen 16 bis 20 Stunden lang bei 21 Grad Celsius und 200 U/min. Ernten Sie dann die Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 g für 20 Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 40 Millilitern IMAC-Puffer A, ergänzt mit EDTA-freien Proteaseinhibitoren. Beschallen Sie nun die Zellen mit 500 Watt, 20 Kilohertz und 40 % Amplitude bei neun Sekunden an, 11 Sekunden aus für 15 Minuten auf Eis. Nach der Beschallung wird das lösliche Material durch Zentrifugation bei 20.000 g für eine Stunde bei vier Grad Celsius geerntet.

Lösliches Lysat in einen ermächtigten Kolben geben und zwei Milliliter TALON-Harz hinzufügen. Lassen Sie die Suspension eine Stunde lang mit einer Umdrehung von 105 U/min inkubieren. Ernten Sie nun das Harz und waschen Sie es mit 250 Millilitern IMAC-Puffer A, gefolgt von 500 Millilitern IMAC-Puffer B.Eluieren Sie His6-markiertes Protein unter Verwendung des IMAC-Puffers C.Injizieren Sie das Eluat auf eine voräquilibrierte Größenausschlusssäule und sammeln Sie den FKBP12-Peak, der bei etwa 87,7 Millilitern eluiert.

Beurteilen Sie die Reinheit des Proteins über SDS-PAGE und bündeln und konzentrieren Sie sich nach Bedarf. Um das Multiwell-Plattenarray einzurichten, bereiten Sie zunächst eine Lösung aus 100-nanomolar gereinigtem FKBP12 in demselben Puffer her, der auch für die Größenausschlusschromatographie verwendet wird. Beschallen und zentrifugieren Sie mit einer schnellen Drehzahl von 13.000 U/min, um die Bildung von Zuschlagstoffen zu verhindern.

Pipettieren Sie nun 100 bis 200 Mikroliter des verdünnten Proteins in eine Beobachtungskammer mit acht Vertiefungen und Glasboden. Geben Sie den BB-Dimerizer in Endkonzentrationen von 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 und 500 Nanomolar hinzu. Bereiten Sie als Referenz eine Lösung von 100-nanomolarer mVenus allein her, um potenzielle Aggregations- und Ausfällungseffekte zu bewerten und einen Helligkeitswert für das Monomer mit den gleichen Erfassungseinstellungen wiederherzustellen.

Jedes konfokale Licht-Scanning-Mikroskop-System, das mit digitalen Detektoren oder gut charakterisierten analogen Detektoren ausgestattet ist und in der Lage ist, eine konstante Verweilzeit für jedes erfasste Pixel zu halten, kann verwendet werden. Wählen Sie das Wasserimmersionsobjektiv zur Kragenkorrektur, das für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie entwickelt wurde. Geben Sie nun einen Tropfen Wasser in das Wasserimmersionsobjektiv zur Kragenkorrektur.

Montieren Sie die Beobachtungskammer mit acht Vertiefungen in die Bühne. Stellen Sie den Anregungsstrahlengang ein, indem Sie den 514-Nanometer-Laser einschalten und ihn am Ausgang des Objektivs auf 20 bis 100 Nanowatt Leistung einstellen. Schalten Sie einen HyD-Melder ein.

Detektoren, die in der Lage sind, Photonen zu zählen, sind vorzuziehen. Wählen Sie das Emissionsfenster von 520 bis 560 Nanometern. Verwenden Sie für den Aufnahmemodus eine Größe von 16 x 16 Pixeln.

Stellen Sie die Pixelverweilzeit so ein, dass die Framezeit länger ist als die Proteindiffusion und die Pixelverweilzeit viel kürzer ist. Dies entsprach einer Einstellung der Verweilzeit auf ca. 13 Mikrosekunden für das in dieser Demonstration verwendete System. Stellen Sie die Lochblende auf eine Airy-Einheit ein, um die entsprechende Emission von ca. 545 Nanometern zu erreichen.

Wählen Sie den XY-Zeiterfassungsmodus und wählen Sie die Anzahl der Frames aus, die pro Aufnahme und Well erfasst werden sollen. Stellen Sie nun die Pixelgröße auf ca. 120 Nanometer ein. Wenn das System mit einem Hochdurchsatzmodus ausgestattet ist, geben Sie die Koordinaten jeder Vertiefung und die Anzahl der Erfassungen pro Vertiefung ein, um den Prozess zu automatisieren.

Wenn das System mit einem Perfusionssystem ausgestattet ist, laden Sie die BB-Lösung und programmieren Sie die Perfusion so, dass sie direkt nach dem 5.000. Frame beginnt, um die Kinetik der Dimerisierung bei der Aufnahme von 10.000 Bildern zu bewerten. Wählen Sie die richtige Vertiefung aus, und konzentrieren Sie sich auf die Lösung. Starten Sie dann die Erfassung und speichern Sie den resultierenden Bildstapel im TIFF-Format.

Es wurden Sequenzen von 20.000 Bildern von gereinigtem FKBP12 mVenus in 100-Nanometer-Lösung aufgenommen, wie im Protokollabschnitt angegeben. Die Intensität des ersten Frames wird zusammen mit dem mittleren Intensitätsprofil des trendbereinigten Bildes angezeigt. Auch die Helligkeit ohne und mit sanfter Filterung wird angezeigt.

Nachdem 10.000 Frames aufgenommen worden waren, wurde der Lösung während der Akquisition das Homodimerisierungsmedikament BB zugesetzt. Jede aufeinanderfolgende Serie von 5.000 Bildern wurde analysiert. Die mittlere Helligkeit fünf Minuten nach der BB-Zugabe betrug 1,010, was einer Verdoppelung entspricht, was auf ein FKBP12-Dimer hinweist.

Die Kinetik des Prozesses zeigt eine Verzögerung von etwa zwei Minuten zwischen der BB-Zugabe und der vollständigen FKBP12-Dimerisierung. Ein wichtiger Aspekt bei der Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vitro ist die Produktion und Reinigung Ihres markierten Proteins. Stellen Sie sicher, dass Sie kleine Mengen des markierten Proteins von Interesse haben und dass sich Ihr Protein gemäß Ihrer Analyse nicht aggregiert.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Oberflächenplasmonenresonanz oder die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen wie Dissoziationskonstanten oder Diffusionskoeffizienten zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biophysik, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen im Detail zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reagenzien für die Proteinreinigung äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Schutzbrillen und Handschuhe getroffen werden sollten.