Eine verbesserte Crosslinking-Immunpräzipitationsmethode zur effizienten Identifizierung von proteingebundener RNA in Maushoden

Nehmen Sie einen frisch geernteten Maushoden in einem gekühlten Puffer. Entfernen Sie die Tunica albuginea, die fibröse Gewebeschicht.

Zerreiben Sie den Hoden, um Samenkanälchen freizusetzen, die Keime und Sertoli-Zellen enthalten.

Fügen Sie Puffer hinzu und setzen Sie die Tubuli UV-Strahlung aus, um eine irreversible Vernetzung der RNA mit assoziierten Proteinen zu ermöglichen, wobei Wechselwirkungen erhalten bleiben.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Resuspendieren Sie die Tubuli in einem Lysepuffer, der RNase und Proteaseinhibitoren enthält.

Beschallung des Gewebes, Freisetzung von Protein-RNA-Komplexen und anderen intrazellulären Komponenten. Die RNase- und Proteaseinhibitoren inaktivieren endogene RNasen und Proteasen.

Fügen Sie DNase hinzu, um DNA abzubauen. Führen Sie verdünnte RNase für den partiellen RNA-Verdau ein.

Der Überstand, der RNA-Protein-Komplexe enthält, wird zentrifugiert und in eine mit Antikörpern beschichtete magnetische Bead-Lösung mit hoher Spezifität für das RNA-bindende Zielprotein überführt.

Wenden Sie ein Magnetfeld an, um die beadgebundenen Protein-RNA-Komplexe zu trennen. Entsorgen Sie den Überstand.

Mit Puffer waschen. Trennen Sie die Prote