Eine verbesserte Crosslinking-Immunpräzipitationsmethode zur effizienten Identifizierung von proteingebundener RNA in Maushoden

Nehmen Sie einen frisch geernteten Maushoden in einem gekühlten Puffer. Entfernen Sie die Tunica albuginea, die fibröse Gewebeschicht.

Zerreiben Sie den Hoden, um Samenkanälchen freizusetzen, die Keime und Sertoli-Zellen enthalten.

Fügen Sie Puffer hinzu und setzen Sie die Tubuli UV-Strahlung aus, um eine irreversible Vernetzung der RNA mit assoziierten Proteinen zu ermöglichen, wobei Wechselwirkungen erhalten bleiben.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Resuspendieren Sie die Tubuli in einem Lysepuffer, der RNase und Proteaseinhibitoren enthält.

Beschallung des Gewebes, Freisetzung von Protein-RNA-Komplexen und anderen intrazellulären Komponenten. Die RNase- und Proteaseinhibitoren inaktivieren endogene RNasen und Proteasen.

Fügen Sie DNase hinzu, um DNA abzubauen. Führen Sie verdünnte RNase für den partiellen RNA-Verdau ein.

Der Überstand, der RNA-Protein-Komplexe enthält, wird zentrifugiert und in eine mit Antikörpern beschichtete magnetische Bead-Lösung mit hoher Spezifität für das RNA-bindende Zielprotein überführt.

Wenden Sie ein Magnetfeld an, um die beadgebundenen Protein-RNA-Komplexe zu trennen. Entsorgen Sie den Überstand.

Mit Puffer waschen. Trennen Sie die Protein-RNA-Komplexe magnetisch und verwenden Sie sie für weitere RNA-Protein-Interaktionsanalysen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, ernten Sie für jedes Immunpräzipitationsexperiment etwa 100 Milligramm Hoden von Mäusen entsprechenden Alters. Legen Sie die Taschentücher in eiskaltes PBS. Entfernen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze vorsichtig die Tunica albuginea. Geben Sie 3 Milliliter eiskaltes PBS in eine Tissue-Mühle und verwenden Sie einen losen Glasstößel, um das Gewebe mit milder mechanischer Kraft zu zerreiben. Übertragen Sie anschließend die Gewebesuspension in eine Zellkulturschale und fügen Sie eiskaltes PBS mit bis zu 6 Millilitern hinzu. Schütteln Sie den Teller schnell, so dass die Flüssigkeit den Boden der Schüssel gleichmäßig bedeckt.

Vernetzen Sie die Suspension auf Eis dreimal mit 400 Millijoule pro Zentimeter zum Quadrat bei 254 Nanometern. Stellen Sie sicher, dass Sie die Suspension zwischen jeder Bestrahlung mischen, dann sammeln Sie die Suspension in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 1.200 mal g und bei 4 Grad für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter PBS. Übertragen Sie danach die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Bei 1.000 mal g und bei 4 Grad Celsius zwei Minuten lang zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Geben Sie zunächst 125 Mikroliter magnetische Protein-A-Kügelchen pro Probe in ein frisches Zentrifugenröhrchen. Lege das Röhrchen auf den Magneten, um die Kügelchen von der Lösung zu trennen. Entfernen Sie nach 10 Sekunden den Überstand und waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 1 Milliliter eiskaltem Lysepuffer. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Kaltlysepuffer mit 10 Mikrogramm eCLIP-Antikörper. Drehen Sie die Röhrchen 45 Minuten lang bei Raumtemperatur und waschen Sie die Kügelchen dann zweimal mit 1 Milliliter eiskaltem Lysepuffer

Zu Beginn resuspendieren Sie die Gewebepellets in 1 Milliliter Kältelysepuffer, der 22 Mikroliter des 50-fachen EDTA-freien Proteininhibitor-Cocktails und 11 Mikroliter RNAse-Inhibitor enthält. Die Proben 15 Minuten lang auf Eis lysieren. Beschallung Jede Probe ist im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie als nächstes 4 Mikroliter DNAse in jedes Röhrchen und mischen Sie es gut. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie bei 1.200 U/min. Danach 10 Mikroliter verdünnte RNAse hinzufügen und gut mischen. Inkubieren Sie 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie bei 1.200 U/min.

Zentrifugieren Sie dann 20 Minuten lang bei 15.000 g und bei 4 Grad Celsius, um das Lysat zu reinigen. Den Überstand vorsichtig einsammeln. Geben Sie zunächst 1 Milliliter des Lysats zu den vorbereiteten Kügelchen und drehen Sie die Proben entweder zwei Stunden lang oder über Nacht bei 4 Grad Celsius. Sammeln Sie danach die Kügelchen mit dem Magnetständer und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 900 Mikrolitern Salzpuffer und waschen Sie die Kügelchen dann zweimal mit 900 Mikrolitern Waschpuffer.