Eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Visualisierung von Büschelzellen in Jejunum-Kryosektionen

Beginnen Sie mit einer Kulturschale mit formalinfixierten, mit Gelatine gefüllten Maus-Jejunum-Kryosektionen mit Büschelzellen mit apikalen Mikrovilli und spulenförmigem Soma.

Mit einem waschmittelhaltigen Puffer waschen, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.

Fügen Sie eine alkalische Antigen-Rückgewinnungslösung hinzu. Inkubieren, um fixierungsinduzierte Proteinvernetzungen aufzubrechen und die Proteine für die Färbung freizulegen.

Tragen Sie eine Blockierungslösung auf, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Overlay mit primären Antikörpern, die auf ein Aktin-bindendes Protein abzielen, das spezifisch in Büschelzellen phosphoryliert ist.

Entfernen Sie ungebundene Antikörper. Einführung einer Mischung aus Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, DNA-bindendem Farbstoff und Phalloidin-Fluoreszenz-Farbstoff-Konjugat.

Die Sekundärantikörper binden an Primärantikörper, das Phalloidin-Fluoreszenzfarbstoff-Konjugat markiert Aktin und der DNA-bindende Farbstoff markiert Zellkerne.

Entfernen Sie ungebundene Bestandteile und fügen Sie einen reinigungsmittelfreien Puffer hinzu.

Übertragen Sie den Abschnitt auf einen mit Klebstoff beschichteten Glasobjektträger und befestigen Sie ihn mit einem Medium.

Unter einem konfokalen Mikroskop deuten grüne spulenförmige Zellen mit verstärkter Fluoreszenz an der luminalen Spitze und einer ausgedehnten roten Wurzelmasse auf das Vorhandensein von Büschelzellen hin.

Um Jejunumabschnitte vorzubereiten, stellen Sie zunächst sowohl die Temperatur der Kryostatkammer als auch die Objekttemperatur auf minus 22 Grad Celsius ein. Legen Sie den gefrorenen Gewebeblock für mindestens 15 Minuten in eine Kryoform in der Kryostatkammer. Schneiden Sie den Block nach 15 Minuten mit einer Rasierklinge in zwei Hälften, um den Querschnitt des Jejunums freizulegen. Montieren Sie eine Hälfte des Blocks auf einen Kryostat-Adapter. Schneiden Sie das mit Gelatine gefüllte Jejunum in 30 Mikrometer dicke Abschnitte. Übertragen Sie die Schnitte mit einer gefrorenen Pinzette vorsichtig in eine 35-Millimeter-Kulturschale mit 3 Millilitern PBS.

Nachdem Sie die Schnitte dreimal für jeweils 5 Minuten mit 3 Millilitern PBS-T gewaschen haben, geben Sie 3 Milliliter frisch zubereitete Antigen-Rückgewinnungslösung in die Schale mit den frei schwebenden Abschnitten. Schließen Sie dann den Deckel, verschließen Sie den Spalt zwischen der Schale und dem Deckel mit einem Streifen Vinylband und inkubieren Sie drei Stunden lang bei 50 Grad Celsius in einem Hybridisierungsinkubator ohne Schütteln.

Nach der Immunfärbung wird die Schale mit den gefärbten Schnitten in PBS in ein stereoskopisches Mikroskop übertragen. Geben Sie 200 Mikroliter PBS in einem Tropfen auf die Mitte eines AMS-beschichteten Objektträgers aus weißem Glas. Übertragen Sie dann mit einer P200-Pipettenspitze einen Jejunumabschnitt aus der Schale in das Tröpfchen.

Nachdem Sie die Schnittausrichtung angepasst haben, saugen Sie alle verbleibenden PBS an, die den Schnitt umgeben. Fügen Sie 20 Mikroliter wässriges Eindeckmedium hinzu und legen Sie ein Deckglas auf das Medium. Versiegeln Sie die Deckglaskanten sofort mit Eindeckmedien auf Xylolbasis und lassen Sie sie zwei bis drei Stunden trocknen, bevor Sie mit der konfokalen Mikroskopie beginnen.