Name: Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Lernen Sie die bilaminäre Co-Kultur primärer Ratten-kortikaler Neuronen mit Gliazellen. Diese Methode ermöglicht die Isolierung reifer Neuronen für elektrophysiologische und bildgebende Studien.

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Die Autoren danken früheren Labor Mitglieder, die Verfeinerung des Protokolls und der NIH für die Unterstützung im Laufe der Jahre (DA19808 und DA15014 zu OM) beigetragen. Anna Abt 1 ist ein Fellow des &quot;Interdisciplinary und Translational Research Training in NeuroAIDS&quot; (T32-MH078795); damit dieser Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health unter Ruth L. Kirschstein National Research Service Award 5T32MH079785 unterstützt.

1. Glia Dissection (~ 2 Wochen vor dem Ausplattieren Neuronen) <ol><li> Zur Vorbereitung auf die Dissektion statt sterile Instrumente in 70% Ethanol, 4 ml kalte Dissektion mittel-bis 60 mm Schalen (ein Gericht pro Kopf), und legen um 2,5% Trypsin und DNase auf Eis zu tauen (siehe Details über chirurgische Instrumente in der Tabelle VI ). </li><li> Verwenden Sie große Schere auf 2-4 Tage alte Jungtiere und Ort Köpfe in einem 100 mm sterile Schüssel zu enthaupten. </li><li> Verwenden Sie Medium Schere zu einer Mittellinie Schnitt durch die Haut machen und ziehen Sie die Haut an den Schädel freizulegen. Verwenden einer gebogenen Schere zu einer Mittellinie geschnitten und zwei seitliche Schnitte durch den Schädel zu machen, ohne dabei das Hirngewebe darunter. Entfernen Sie die obere Schädel das Gehirn freizulegen. </li><li> Auszug des Gehirns und legen Sie sie in eine eigene 60 mm Schale mit 4 ml kalte Dissektion Medium (siehe Tabelle I für Komposition). Die Schale unter einem Stereomikroskop (Leica ZOOM 2000, Zoom-Steuerung: 7-30) und die Nutzung No.5 Pinzette auf die Halbkugeln zu trennen, entfernen Sie das Mittelhirn, und schälen off der Hirnhäute. </li><li> Sammeln Sie alle seziert zerebralen Kortex in ein frisches 60 mm Schale mit kalter Sezierung mittel-und Hackfleisch, das Gewebe mit einer gebogenen Schere. </li><li> Übertragen Sie die zerkleinerte Gewebe in eine sterile 15-ml-Tube. Bringen Sie das Volumen auf 4,5 ml mit kaltem Dissektion mittel-und fügen Sie 500 ul von 2,5% Trypsin. Wickeln Sie den Schlauch in Parafilm und Schwimmer in einem 37 ° C Wasserbad für 15 Minuten, Mischen durch Umdrehen alle 5 Minuten. (Anmerkung: hier haben wir das Protokoll wir in der Regel bei der Verwendung von bis zu 5 Gehirn beschreiben, wenn mehr Jungen verwendet werden, Volumina können müssen entsprechend angepasst werden) </li><li> Transfer des Gewebes auf ein neues 15-ml-Tube, die Minimierung der Menge von Trypsin-haltigen Präparation Medium über. Bringen Sie die Lautstärke auf 4.8mL mit frischen Dissektion Medium und mit 200 ul DNase zu einer Endkonzentration von 60 ug / mL (Stammlösung: 3 mg DNase und 5 mg MgSO4 in 2 ml Medium Dissektion) zu erreichen. Man reibt vorsichtig ~ 20 Mal mit einer sterilen 5 ml Pipettete, dann fügen Sie 10 ml Glia Plating-Medium (siehe Tabelle II für Komposition). </li><li> Lassen Sie große Stücke von Gewebe für 4-5 Minuten absetzen, dann überweisen Sie den oberen 80% der Zellsuspension auf eine 50 ml Tube. Wiederholen Sie das Gewebe Verreiben mit einer zusätzlichen 2-3 ml Glia Plating Medium (und mit einem kleineren Pipette falls erforderlich); wieder, damit die Gewebe zu regeln, und fügen Sie die Top 80% auf den vorherigen Erhebung. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 20 ml mit Glia plating mittel-und Zentrifuge für 15 Minuten bei 280 g (oder 1300 rpm in einer IEC Centra CL2 Zentrifuge). </li><li> Saugen Sie den Überstand und Zellpellet in Glia Plating Medium (etwa mit 5-7 ml je nach Anzahl der Welpen verwendet werden), dann fügen Sie zusätzliche Beschichtung Medium, um 10 ml für jedes Gehirn seziert haben. Gut mischen und Platte 10 ml Zellsuspension in je 75 cm 2-Kolben (dh ein Gehirn pro Flasche). </li><li> Bewegen Kulturflaschen in einen Inkubator eingestellt bei 37 ° C (5 bis 10% CO2, proportional zu den Natrium-bicarbonate Inhalt des Mediums). Ändern Kulturmedium nach 24-48 Stunden, dann alle 3-4 Tage. </li></ol> 2. Sekundäre Glia (48 Stunden vor dem Ausplattieren Neuronen) <ol><li> Bereiten Thermanox Deckgläser (wenn Neuronen auf dem Geschirr wird vergoldet werden) durch Zugabe von 3 kleinen Tropfen von geschmolzenem Wachs Paraplast um den Umfang der jeweils gewaschen und autoklaviert Thermanox. Die Zellen werden auf dieser Seite des Thermanox beschichtet werden. Unsere Thermanox sind handgefertigt wiederverwendbare ~ 60 mm Einsätze aus Kunststoff (siehe Tabelle VI von Reagenzien) mit ~ 50 2 mm Löcher gebohrt durchtrennt, obwohl im Handel erhältlich Kultur und fügt stattdessen verwendet werden können. </li><li> Waschen Sie die primären Gliazellen mit PBS zweimal kräftig geschüttelt jedem Kolben keine ungebundene Zellen zu entfernen. Jeder Kolben mit konfluenten primären Gliazellen liefert rund 10 Millionen Astroglia, weshalb wir regelmäßig 2-4 Flaschen pro Experiment. </li><li> Lösen Sie die Zellen mit 0,05% tryspin-EDTA (1 mL10X 0,5% Trypsin-EDTA-Stammlösung in 9 ml PBS verdünnt). Combine der Zellen, die aus 2 Flaschen in einem 50 ml konischen Röhrchen und füge eine gleiche Menge an Glia Plating-Medium (siehe Tabelle II von Reagenzien). Zentrifuge für 15 Minuten bei 280 g. Saugen Sie den Überstand und die Auflösung der Glia Pellet in wenigen mL Glia Plating Medium. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer und verdünnen die Zellsuspension nach Bedarf (~ 1x10 6 Zellen / ml); Platte die Zellen entweder auf 60mm Gerichte (wenn Neuronen auf Deckgläsern wird vergoldet werden), oder auf Thermanox Deckgläser (wenn Neuronen wird vergoldet werden 60 mm Platten). Die Zellen sollten auf 500.000 Zellen pro Schale oder Thermanox mit Glia plating ausplattiert werden. Im Falle der Thermanox Deckgläser, Platte 600 ul der Zellen in einem tropfenweise, dann nach 2 Stunden Flip Thermanox und tauchen Zellen in Glia Plating Medium. </li><li> Wenn der Vorbereitung 60 mm Gerichte der sekundären Glia für die neuronale Deckgläser, ändern mittel-bis N2.1 am Abend vor dem neuronalen Dissektion. </li></ol> 3. Neuronale Dissectionund Kultur <ol><li> Bereiten Sie Deckgläschen (15 mm Durchmesser) durch Zugabe von 3 kleinen Tropfen von geschmolzenem Wachs Paraplast um den Umfang der jeweils sterile Deckgläschen, um die physikalische Trennung der Zellschichten und verhindern, dass Zellen Schaben. Die Zellen werden auf dieser Seite des Deckglases beschichtet werden. </li><li> Coat Platten oder Deckgläser mit 0,5 mg / mL Polylysin (entweder Poly-L-Lysin oder Poly-D-Lysin in Borat-Puffer, siehe Tabelle VI) für 2 Stunden oder über Nacht. Waschen mit sterilem Wasser 2-3 mal und vollständig trocknen lassen. Hinweis: Deckgläser sind in eine hydrophobe Petrischale gelegt, damit kein / Verbreitung der Lösungen während der Beschichtung mit Poly-Lysin oder Zelle Beschichtung, die leicht auftreten können, wenn die Deckgläser in Gewebekulturschalen platziert werden. </li><li> Bereiten Sie sich auf die neuronalen Dissektion wie für die Glia Dissektion (Schritt 1.1). Euthanize eine 17-tägige trächtigen Ratten, Spray das Fell mit 70% Ethanol, und schneiden medial durch die Haut in die Gebärmutter freizulegen. Entfernen Sie alle Föten und legen Sie sie in einemsterile 100 mm Schale. </li><li> Schnell kostenlos analysieren und zu enthaupten jeden Fetus, indem jeder Kopf in seine eigene 60 mm Schale mit kalter Sezierung Medium (4 ml). Wir normalerweise sezieren 4-5 Feten pro Experiment etwa 20 Millionen Neuronen aus jedem E17 Fötus stammen. Wenn mehr Embryonen benötigt werden, stellen Sie sicher, dass das gesamte Verfahren (aus Schritt von 3,4 bis 3,12) nicht länger als 90-100 Minuten. </li><li> Mit einem Stereomikroskop und No.1/No.5 Pinzette isolieren den zerebralen Kortex durch Ziehen öffnen Sie die Haut und Schädel, Extrahieren des Gehirns, die Trennung der Hemisphären, und das Entfernen des Mittelhirns und der Hirnhäute. </li><li> Sammeln Sie alle seziert Kortex in ein frisches 60 mm Schale mit kalter Sezierung mittel-und Hackfleisch, das Gewebe mit einer gebogenen Schere in ca. 1 mm große Stücke. </li><li> Übertragen Sie die zerkleinerte Gewebe in eine sterile 15-ml-Tube. Bringen Sie das Volumen auf 4,5 ml mit kaltem Dissektion mittel-und fügen Sie 500 ul von 2,5% Trypsin. Wickeln Sie den Schlauch in Parafilm und Schwimmer in einem 36 ° C Wasserbad für 15 Minutes, Mischen durch Umdrehen alle 5 Minuten. </li><li> Transfer des Gewebes auf ein neues 15-ml-Tube, die Minimierung der Menge von Trypsin-haltigen Präparation Medium über. Bringt auf 4,8 mL mit frischen Dissektion Medium und mit 200 ul DNase zu einer Endkonzentration von 60 ug / mL zu erreichen. Man reibt etwa 10-mal mit einer sterilen 5 oder 2 ml-Pipette, wiederholen Sie diesen Schritt nach Bedarf mit einem feuerpolierte (kalt) Pasteurpipette auf die meisten Gewebe zu distanzieren. Dann lassen restlichen Stücke des Gewebes (in der Regel nur sehr wenige, wenn überhaupt) für 4-5 Minuten absetzen können. </li><li> Entfernen Sie die obere Ein-Zell-Suspension während hinterlassen angesiedelt Gewebestücke, und legen Sie diese Lösung in ein neues Röhrchen mit dem gleichen Volumen von Neuron Plating-Medium (siehe Tabelle III). Gut mischen, aber sanft, dann zählen die Zellen; Platte auf 15 mm Deckgläser (35.000 Zellen in jeweils 200 ul) oder 60 mm Schalen (1x10 6 Zellen jeweils in 3 mL) nach Bedarf. Transfer-Zellen in den Inkubator (36,5 ° C, 5-10% CO2). </li><li> Nach 3-4 Stunden Combine das Neuron-Schicht und der sekundären Glia wie folgt. Für Neuronen auf 60 mm Geschirr, waschen Sie die Zellen mit warmem DMEM, ändern Sie die mittel-bis 4 ml serumfreiem Medium (N2, siehe Tabelle IV), und fügen Sie eine Thermanox mit Glia zu jeder Platte (Gliazellen sollte nach den Neuronen). Für neuronale Deckgläser, Transfer von 3 bis 5 Deckgläser zu je 60 mm-Schale von sekundären Glia, mit den Neuronen nach unten. </li><li> 24 Stunden nach dem Ausplattieren der Neurone, fügen Sie 10 uM von Cytosin-β-D-arabinofuranosid zu jedem Gericht, um Glia-Proliferation zu verhindern. Wir bereiten 4 mM Stammlösungen verdünnt 1:10 mit N2-Medium, und 25 uL / ​​ml verdünnte Lösung zu jedem Gericht. </li><li> Die Zellen sind in der Regel für Experimente nach 7-10 Tagen in Kultur verwendet, obwohl genaue Zeit hängt von der gewünschten Differenzierung der Bühne, sie wurden für bis zu 4 Wochen ohne eine signifikante Abnahme der Überlebensrate gestiegen. Nach der ersten Woche, ist es empfehlenswert, eine halbe Volumen von Medien ersetzt jede Woche. </li></ol> Ein paar Stunden nach Neuronen an das Substrat gebunden, fangen sie an lamelliopodia verlängern. Prozesse weiter zu verlängern (Abb. 2A) und polarisieren über mehrere Tage in Kultur, und erweitert Axone und Dendriten sind deutlich sichtbar (Abb. 2B; MAP2-Färbung). Als Neuronen reifen dendritischen Dornen werden aufwendiger und entwickeln sie synaptische Kontakte, etwa 2-3 Wochen nach dem Ausplattieren viele dendritischen Dornen sichtbar sind (Abb. 2C) 11. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3257/3257fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Flussdiagramm des Verfahrens zur Kultivierung von Ratten kortikalen Neuronen zusammen mit einer glialen Feeder-Schicht (sekundäre Glia). Zuerst 11 Tage vor dem neuronalen Dissektion, ist eine primäre Glia Kultur von neugeborenen Ratten (P2-4) vorbereitet. Wenn die Zellen konfluent sind (ca. 9 Tage nach dem Ausplattieren der primären Gliazellen und zwei Tage vor der neuronalen Dissektion), sind Astrozyten mechanically von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und Mikrogliazellen und verchromt entweder auf dem Geschirr oder Thermanox (sekundäre Glia) getrennt. Neuronen sind dann aus dem Kortex von E17 Embryonen und vergoldet entweder auf Deckgläsern oder Gerichten (mit Poly-Lysin) erhalten. Vier Stunden nach dem Ausplattieren, ist die neuronale Ebene auf die sekundären Gliazellen aufgenommen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3257/3257fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 Beispiele für Kulturen in verschiedenen Stadien (zB 5 Stunden, 12 DIV, 21 DIV).. Die Zahlen sind repräsentativ Bilder von kortikalen Neuronen auf Deckgläsern zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Nach Neuronen zu befestigen das Substrat Neuronen beginnen lamelliopodia verlängern. Phasenkontrast-Bild zeigt ein paar längere Neuriten 5 Stunden nach dem Ausplattieren (A). Das Bild in der Mitte (B, von Cook et al. 2010, mit freundlicher Genehmigung) zeigt 12 DIV kortikalen Neuronen fixiert und immunhistochemisch mit dem neuronalen dendritischen Marker MAP2. Hoechst-Färbung wurde als counterstai verwendetNing. Als Neuronen reifen dendritischen Dornen auch sichtbar werden (C). Maßstab: A, B = 25 um, C = 10 pm.

<ol><li>Cook, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+chemokines%3A+regulation+of+fractalkine%2FCX3CL1+homeostasis+by+SDF%2FCXCL12+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interactions between chemokines: regulation of fractalkine/CX3CL1 homeostasis by SDF/CXCL12 in cortical neurons.</a> J. Biol. Chem. 285, 10563-10563 (2010).</li>
<li>Nicolai, J., Burbassi, S., Rubin, J., Meucci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL12+inhibits+expression+of+the+NMDA+receptor%27s+NR2B+subunit+through+a+histone+deacetylase-dependent+pathway+contributing+to+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Death.+Dis%22%5BJournal%5D)">CXCL12 inhibits expression of the NMDA receptor's NR2B subunit through a histone deacetylase-dependent pathway contributing to neuronal survival.</a> Cell. Death. Dis. 1, e33-e33 (2010).</li>
<li>Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+increases+brain+levels+of+ferritin+heavy+chain+leading+to+inhibition+of+CXCR4-mediated+survival+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphine increases brain levels of ferritin heavy chain leading to inhibition of CXCR4-mediated survival signaling in neurons.</a> J. Neurosci. 29, 2534-2544 (2009).</li>
<li>Meucci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+regulate+hippocampal+neuronal+signaling+and+gp120+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14500-14500 (1998).</li>
<li>Khan, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuronal+P53+activity+by+CXCR+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuronal P53 activity by CXCR 4.</a> Mol. Cell. Neurosci. 30, 58-66 (2005).</li>
<li>Patel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+neuronal+CXCR4+by+the+micro-opioid+agonist+DAMGO%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Modulation of neuronal CXCR4 by the micro-opioid agonist DAMGO.</a> J. Neurovirol. 12, 492-500 (2006).</li>
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<li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 8, 1454-1468 (1988).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Goslin, K., Banker, G. , Second Edition, The MIT Press. 339-370 (1998).</li>
<li>D'Ambrosio, J., Fatatis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblasts+modulate+Ca2%2B+signaling+in+bone-metastatic+prostate+and+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Osteoblasts modulate Ca2+ signaling in bone-metastatic prostate and breast cancer cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 955-964 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll sieht ein Verfahren zur Kultivierung Ratte primären kortikalen Neuronen in Gegenwart von Gliazellen, während gleichzeitig die Neuronen auf einfache Weise für die experimentelle Analyse isoliert werden. Die Glia-Unterstützung Entwicklung eines gesunden neuronalen Phänotyp, während auch modulierende neuronale Reaktionen auf experimentelle Behandlungen in einem physiologisch relevanten Art und Weise. Zusätzlich kann durch die Passage der primären Gliazellen vor Kultivierung mit Neuronen dieser Zellpopulati...

bilaminäre co-kultur von primären ratten-kortikalen neuronen und glia

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Dieses Video wird Sie durch den Prozess der Kultivierung Ratte kortikalen Neuronen in der Gegenwart eines Glia-Feeder-Schicht, ein System als zweischichtige oder Co-Kultur-Modell bekannt zu führen. Dieses System eignet sich für eine Vielzahl von experimentellen Anforderungen erfordern entweder ein Glas oder Kunststoff Aufwachssubstrats und kann auch für die Kultur des anderen Typen von Neuronen verwendet werden. Rat kortikalen Neuronen aus dem späten Embryonalstadium (E17) gewonnen werden, auf Deckgläser oder Gewebekulturschalen vor einer Feeder-Schicht von Gliazellen auf dem Geschirr oder Kunststoff Deckgläser (bekannt als Thermanox) gewachsen, bzw. vergoldet. Die Wahl zwischen den beiden Konfigurationen hängt von den spezifischen experimentellen Technik verwendet, die gegebenenfalls verlangen, oder nicht, sind die Neuronen auf Glas (z. B. Calcium-Imaging im Vergleich zu Western-Blot) gewachsen. Die Glia-Feeder-Schicht, eine Astroglia angereicherte sekundäre Kultur des gemischten Glia, getrennt von den Rinden der neugeborenen Ratte Welpen (P2-4), die vor der neuronalenDissektion. Ein großer Vorteil dieser Kultur-System als eine Kultur der Neuronen im Vergleich nur die Unterstützung der neuronalen Wachstum, Überleben und die Differenzierung von trophischen Faktoren aus der Glia-Feeder-Schicht, die genauer ähnelt das Gehirn Umwelt in vivo sezerniert zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus kann die Co-Kultur verwendet werden, um neuronal-glialen Interaktionen 1-Studie sein. Zur gleichen Zeit ist Glia Kontamination in der neuronalen Ebene mit unterschiedlichen Mitteln (low density Kultur, Zugabe von Mitosehemmer, Mangel an Serum und die Verwendung von optimierten Kulturmedium) führen zu einem nahezu reinen neuronalen Ebene, vergleichbar mit anderen etablierten Methoden 1 verhindert -3. Neuronen können leicht von den Gliazellen Schicht jederzeit getrennt während der Kultur und für verschiedene experimentelle Anwendungen von Elektrophysiologie 4, Zell-und Molekularbiologie 5-8, Biochemie 5, Bildgebung und microscopy 4,6,7,9,10. Der primäre Neuronen verlängern Axone und Dendriten bilden funktionelle Synapsen 11, ein Vorgang, der nicht in neuronalen Zelllinien beobachtet wird, obwohl einige Zelllinien Prozesse erstrecken. Ein detailliertes Protokoll der Kultivierung Ratte Hippocampus-Neuronen mit dieser Co-Kultur-System wurde zuvor 4,12,13 beschrieben. Hier haben wir ausführlich ein modifiziertes Protokoll für kortikale Neuronen geeignet. Wie etwa 20x10 6 Zellen voneinander Rattenembryo zurückgewonnen werden, ist diese Methode besonders nützlich für Experimente erfordern eine große Anzahl von Neuronen (nicht aber über ein sehr homogenes neuronalen betroffene Bevölkerung). Die Aufstellung von Neuronen und Gliazellen muss in einer Zeit-spezifischen Art und Weise geplant werden. Wir werden die Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Kultivierung Ratte kortikalen Neuronen sowie Kultivierung Gliazellen um die Neuronen zu unterstützen.

Hier bieten wir Ihnen ein Protokoll für die Kultivierung von Ratten kortikalen Neuronen in der Gegenwart eines Glia-Feeder-Schicht. Die kultivierten Neuronen zu etablieren Polarität und erstellen Synapsen, und kann von der Glia für den Einsatz in verschiedenen Anwendungen, wie zB Elektrophysiologie, Kalzium-Imaging, das Überleben der Zelle Assays, Immunzytochemie und RNA / DNA / Protein-Isolierung getrennt werden.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

Dieses Video führt Sie durch den Prozess der Kultivierung von kortikalen Rattenneuronen in Gegenwart einer glialen Feeder-Schicht, einem System, das als bilaminär oder ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, primäre Neuronen in Gegenwart einer Gliazellschicht zu kultivieren, die ihr Wachstum unterstützt. Diese Neuronen können später als reine Neuronenpopulation zur Analyse isoliert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst die primären Gliazellen kultiviert werden.Der zweite Schritt besteht darin, die Gliazellen auf eine Oberfläche umzupflanzen, die den kultivierten Neuronen gegenüberliegt. Anschließend werden die neuronalen und glialen Zellschichten zu einem stabilen Kokultursystem vereint. Letztendlich zeigt die cytochemische Analyse die Entwicklung einer reinen Schicht aus reifen Neuronen.Hallo, mein Name ist Anna T und ich bin Studentin im Labor von Dr. Olympia Muci an der Drexel University. Hier zeigen wir Ihnen, wie man kortikale Neuronen in Gegenwart einer Gliazell-Fütterungsschicht kultiviert. Diese Technik wurde ursprünglich von Gary Banker und Kollegen entwickelt und anschließend im Labor von Dr. Muci und Richard Miller an der University of Chicago erlernt, wo wir sie dann an unsere experimentellen Anforderungen angepasst haben.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber einer reinen neuronalen Kultur liegt darin, dass die von Gliazell

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Dissektion und das Wachstum der Zellen von einem einzelnen Bereich des Gehirns erleichtert Untersuchung zellulärer und physiologischer Parameter. Wir beschreiben ein Verfahren zur Primär-Zellkultur, die Neuron-angereicherten Kulturen produziert in einem Serum-freien Umgebung.

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A-Protokolle für eine embryonale Rattenhirn Aggregat-Kultur-System beschrieben wird. Multipotente Vorläuferzellen in die Aggregate entwickeln können und differenzieren sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten.

Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregate Kulturen für Neuron und Glia Development Studies

Wir entwickelten eine neuartige Multi-Kompartiment-Neuron Co-Kultur Mikrosystem-Plattform für in-vitro-ZNS-Axon-Glia-Interaktionen Forschung. Die Plattform ist in der Lage die Durchführung von bis zu sechs unabhängigen Experimenten parallel und wurde unter Verwendung eines neu entwickelten Makro / micro hybrid Herstellungsverfahren.

Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

Isolieren primären Mikroglia aus der zellulären Heterogenität des Gehirns ist wichtig, um deren Rolle bei physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt eine mechanische Isolation und gemischten Zellkultur-Technik, die eine hohe Ausbeute und hoher Reinheit liefert, lebensfähigen primären Mikrogliazellen...

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

Das Video zeigt eine Technik zur Kultivierung primärer Astrozyten aus der Rattenrinde. Die Hirnrinde wird mechanisch dissoziiert, um eine homogene Gliazellsuspension zu erhalten, die dann auf Polypeptid-beschichteten Platten plattiert wird, um die selektive Proliferation von Astrozyten zu fördern. Anschließend werden die Astrozyten enzymatisch von den Platten dissoziiert und auf frische Medien überführt, was die Kultivierung reiner Astrozyten ermöglicht.

Generierung einer Primärkultur von Astrozyten aus dem Gehirn eines Rattenwelpen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Etablierung einer dreidimensionalen Kultur von Gliazellen. Gliazellen aus dem Rattengehirn sind in einer photovernetzbaren Polymermatrix eingekapselt, die extrazelluläre Matrixkomponenten enthält. Nach der Inkubation in einem Wachstumsmedium vermehren sich die Gliazellen innerhalb der Stützmatrix, um eine dreidimensionale Kultur zu bilden.

Etablierung einer dreidimensionalen Kultur von Gliazellen aus dem Rattengehirn

Wir beschreiben Verfahren für die Kennzeichnung und Genotypisierung neugeborenen Mäusen und Erzeugung primären neuronalen Kulturen von ihnen. Die Genotypisierung ist schnell, effizient und zuverlässig und ermöglicht die automatisierte Nukleinsäureextraktion. Dies ist besonders nützlich für neonatal letale Mäusen und Kulturen, die vor Abschluss der Genotypisierung erfordern.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Kultivierung niedriger Dichte primären hippocampalen Neuronen wachsen auf Glasdeckgläschen über einen einschichtigen glial invertiert. Das Neuron und Glia-Schichten werden durch Paraffinwachsperlen abgetrennt. Die Neuronen durch diese Verfahren gezüchtet sind geeignet für hochauflösende optische Bildgebung und funktionelle Assays.

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

Hier präsentieren wir einen einfachen Ansatz mit spezifischen Kulturmedien, die die Etablierung von neuron- und astrozytenangereicherten Kulturen oder neuronglia-Kulturen aus dem embryonalen Kortex mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit ermöglichen.

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Wir präsentieren hier ein Protokoll zur Vorbereitung von Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus Rattenkortices für die Zeitraffer-Videobildgebung von intrazellulärem Ca2+ für die Erforschung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose im hSOD1G93A-Rattenmodell .

Primärkulturen von Rattenastrozyten und Mikroglia und ihre Verwendung bei der Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroglia-neuronale Co-Kultur, die aus primären neuronalen Zellen hergestellt wurde, die an den Embryonaltagen 15-16 aus Mausembryonen isoliert wurden, und aus primären Mikroglia, die aus den Gehirnen von neugeborenen Mäusen an den postnatalen Tagen 1-2 erzeugt wurden.

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Lernen Sie die bilaminäre Co-Kultur primärer Ratten-kortikaler Neuronen mit Gliazellen. Diese Methode ermöglicht die Isolierung reifer Neuronen für elektrophysiologische und bildgebende Studien.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

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