FSL Konstrukte: Eine einfache Methode für das Ändern von Cell / Virion Oberflächen mit einer Reihe von biologischen Markern, ohne die Durchführung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Oberflächen von lebenden Zellen oder S harmlos und schnell mit bioaktiven Konstrukten zu markieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Funktionsspacer-, Lipid- oder FSL-Konstruktlösung hergestellt wird. Als nächstes wird ein gleicher Teil der Konstruktlösung mit einem gleichen Teil der Lösung von Zellen oder VIRs gemischt.

In einem dritten Schritt wird die Mischung 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Der letzte Schritt besteht darin, die modifizierten Zellen oder Zyten oder modifizierten VIRs oder VIRs zu waschen und wie gewohnt experimentell zu verwenden. Letztendlich können oberflächenmodifizierte lebende Zellen oder S durch alle routinemäßigen experimentellen Analysetechniken wie Durchflusszytometrie, Mikroskopie und Agglutination sichtbar gemacht werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der kovalenten Markierung besteht darin, dass sie schnell, robust und flexibel ist und die Vitalität der modifizierten Zelle oder Varian nicht beeinträchtigt. Um die FSL-Konstrukt-Stammlösung herzustellen, fügen Sie zuerst einen Milliliter Verdünnungsmittel zur Produktakte hinzu, um das trockene FSL-Produkt zu rekonstituieren, wodurch eine Stammlösung von einem Milligramm pro Milliliter entsteht. Beschallen Sie das Fläschchen 30 Sekunden lang, aliquotieren Sie den Fond in sterile 100-Mikroliter-Behälter und lagern Sie die Behälter bis zu einer Woche lang bei zwei bis acht Grad Celsius.

Um funktionierende FSL-Konstruktlösungen für die Insertion kurz vor der Verwendung vorzubereiten, beschallen Sie die Lösung erneut für 30 Sekunden, um alle Fehlzellen zu homogenisieren, verdünnen Sie dann das FSL-Konstrukt und puffern Sie auf die erforderliche Konzentration. Lagern Sie die Arbeitslösung bis zu einer Woche nach der Resus-Suspension in lipidfreien Medien oder PBS-Zentrifuge bei zwei bis acht Grad Celsius und zentrifugieren Sie die Zellen für die FSL-Modifikation frei von ungebundenen Lipiden. Dann verpacken Sie die Zellen in 100 Mikroliter Verdünnungsmittel, waschen Sie die Zellen für die Kontrollen unter den gleichen Bedingungen auf 100 Mikroliter unmodifizierte Zellen.

Fügen Sie nach Belieben 100 Mikroliter einer geeigneten Verdünnung der FSL-Lösung hinzu. Erstellen Sie parallel dazu auch Negativkontrollen mit nicht verwandten FSL-Lösungen und/oder PBS. Inkubieren Sie dann alle Zelluntergruppen nach der Inkubation eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie alle Zellen zweimal mit lipidfreien Medien oder PBS, um alle freien FSL-Konstrukte zu entfernen, und bereiten Sie eine geeignete Suspension in lipidfreien Medien vor. Ist der FSL-Modifikationsprozess abgeschlossen, können die Coys wie eine Blume bei vier bis acht Grad Celsius gelagert werden. FSL-Konstrukte bestehen aus drei Hauptkomponenten, dem funktionellen Kopf oder F, bei dem es sich um eine Vielzahl biologisch funktioneller Gruppen handeln kann.

Der Spacer RS ist so konzipiert, dass er einen Abstand des Funktionskopfes von der Membran weg induziert, um die Wasserdispergität zu verbessern und nicht mit menschlichem Serum und dem DAL-Lipid oder L zu reagieren, was es dem Konstrukt ermöglicht, sich spontan in die Oberflächen vier einzubauen. Repräsentative FSL-Gruppen sind in den folgenden fünf Bildern dargestellt. Lebende murine Embryonen wurden direkt mit FSL-Fluorescein markiert, indem sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in serumfreien Zellkulturmedien gewaschen und dann unter Fluoreszenzmikroskopie betrachtet wurden.

Auf diesem ersten Bild ist ein zop palita freier Embryo mit zwei Zellen zu sehen. Die intensive Färbung in der Mitte des Embryos ist repräsentativ für eine klassische Polkörperfärbung. In den nächsten beiden Bildern sind Zop Palita-freie vierzellige und achtzellige Embryonen zu sehen, die eine schattenhafte Färbung der Zellen aufweisen, die sich außerhalb des Mikroskops P des Fokus befinden.

In der nächsten Bilderserie ist ein Bild eines 16-zelligen zop palita-freien Embryos zu sehen, der mit FSL-Fluorescein markiert wurde, lebende Spiegelembryonen, vier bis fünf Tage alte, intakte Spiegelblasten-Embryonen, bei denen sowohl der Embryo als auch der Zop LUCITA markiert sind. Die FSL-Fluoreszein-Markierung von Zebrafischen ist dargestellt. Dieses erste Bild zeigt eine Mikroangiographie einer Zebrafischlarve 52 Stunden nach der Befruchtung, bei der FSL-Fluorescein direkt in den Blutkreislauf injiziert wurde.

Hier ist eine Verfärbung des Zebrafisch-Gefäßsystems zu beobachten. FSL-Fluorescein, heterogene Zebrafisch-Nierengewebszellen oder ZK-Zyten wurden exvivo erzeugt und dann 52 Stunden nach der Befruchtung in vivo in den Kreislauf eines Empfänger-Zebrafisches mikroinjiziert. Beobachtungen der ZK-Cyten wurden zwei Stunden nach der Injektion durch Bildgebung des Gefäßsystems unter Fluoreszenz mit Zeitraffermikroskopie durchgeführt. die aufgrund ihrer Bewegung verschwommen erschienen, die mit grünen Pfeilen gekennzeichnet waren. In diesem Bild ist die FSL-Fluorescein-Markierung durch orale Aufnahme des Konstrukts zu sehen, die durch das Eintauchen von Zebrafischembryonen und FSL-Fluorescein-haltigen Medien für bis zu fünf Tage erreicht wird.

Die Hellfeldmikroskopie des FSL-Fluoreszein-behandelten Zebrafisches auf der linken Seite entspricht dem nebenstehenden Fluoreszenzbild auf der rechten Seite. Die Fluoreszenz befand sich bevorzugt im Darmtrakt. Bei den hier gezeigten unbehandelten Kontrollembryonen wurde keine Färbung beobachtet.

Hier vesikuläres Stomatitis-Virus oder VSV, das zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius direkt mit 10 Mikrogramm pro Milliliter FSL-Fluorescein markiert wird, gefolgt von einer Fixierung mit 4%Paraform-Aldehyd und dann einer Analyse durch einen Faktenscan wird keine Reinigung des VSV-Fluoresceins gezeigt. Eine Post-FSL-Etikettierung war erforderlich. Dieses Histogramm zeigt Hodenzellen von Schweinen, die mit humanen A Puerto Rico 8, 19, 34 oder H one N one VIRs infiziert sind, die mit FSL-Fluorescein markiert sind.

Nicht fluoreszierende, nicht infizierte Zellen sind durch die schwarze Linie dargestellt, während die Fusion des H one N one Coron mit den Schweinezellen, die zur Fluoreszenz führte, durch die rote Linie angezeigt wird. In der nächsten Bildserie wurden die Zellen zunächst eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit FSL-Biotin markiert, dann gewaschen und mit Fluor 4-markiertem Avadon reagiert und dann gewaschen und nass für die Fluoreszenzmikroskopie montiert. Das erste Bild zeigt ein kompiliertes konfokales Bild eines murinen Embryos, und diese Abbildung zeigt einen zentralen konfokalen Schnitt des Embryos aus dem vorhergehenden Bild.

Hier sind lebende bewegliche Menschen Dauerwellenzoa. Die Unschärfe tritt als Folge ihrer Bewegung auf. Ein deutlicheres repräsentatives Bild von menschlichen Spermien, die nach dem Einsetzen in 4%Paraformaldehyd fixiert sind, ist in dieser Abbildung hier zu sehen.

FSL-Biotin-markierte humane Erythrozyten zeigen, dass die Fixierung mit 4%Paraformaldehyd-Pres-Insertion die FSL-Markierung nicht beeinflusst, wie in den folgenden beiden Abbildungen dargestellt: Hier können 4%parmale fixierte RL 95 endometriale humane Karzinomzellen beobachtet werden. In diesem Bild sind die Endometriumkarzinomzellen des Menschen RL 95 nicht fixiert. Es sind praktisch keine Unterschiede in der Beschriftung zwischen den beiden Bildern mit oder ohne Fixierung zu beobachten.

FSL-Biotin-markierte Erythrozyten-Zyten, die in einer Blutprobe beobachtet wurden, die zwei Stunden nach der intravenösen Infusion der Zyten entnommen wurde, sind hier links dargestellt, die Zellen wurden unter Lichtmikroskopie betrachtet auf der rechten Seite, das gleiche Zellfeld wurde unter Fluoreszenz betrachtet, und die beiden vorhandenen Zyten sind in grün zu identifizieren. Die Berechnung des Verhältnisses der Zyten zu unmarkierten Zellen kann als Indikator für das Überleben verwendet werden. Dieses letzte FSL-Biotin-markierte Zellbild zeigt lebende humane endometriale Biotin-Zyten, die durch Bindung an abgebildete Kügelchen sichtbar gemacht wurden.

Diese letzte Bilderserie zeigt die Wechselwirkungen von FSL-Konstrukten mit Blutgruppenmarkern. Das erste Bild zeigt menschliche GLI-Zyten der roten Blutkörperchen, die mit einer Konzentration von 500 Mikrogramm pro Milliliter FSLG beschichtet sind, getestet gegen Verdünnungen von menschlichem Serum. Menschliche rote Blutkörperchen reagieren von Natur aus nicht mit dem Xena-Antigen GALI-Antigen.

Als solche können Zyten verwendet werden, um den Antikörperspiegel im Serum zu quantifizieren. In diesem Beispiel wurde bestimmt, dass der Patient einen Antiga-Titer von eins bis 32 hatte, indem er Zyten mit abnehmenden FSL-Spiegeln erzeugte. Ähnlich wie bei der Erstellung eines Antigentiters kann ein optimaler Antigenspiegel zum Nachweis von Antikörpern bestimmt werden, Zellen können so erzeugt werden, dass sie nur dann ein positives Ergebnis liefern, wenn der Antikörperspiegel einen bestimmten Titer überschreitet.

Der Gehalt an FSL-Antigen, der erforderlich ist, um ein positives Ergebnis zu erzielen, hängt von der Qualität und dem Gehalt des nachgewiesenen Antikörpers ab. Typischerweise für Kohlenhydratantigene führt eine FSL-Lösung von 100 Mikrogramm pro Milliliter zu einer starken positiven Reaktion. Menschliche rote Blutkörperchen der Gruppe O sind so modifiziert, dass sie ein bestimmtes Niveau eines Antigens aufweisen oder sogenannt standardisiert sind.

A-Zyten werden verwendet, um Antia im menschlichen Serum genau und reproduzierbar zu quantifizieren. In diesem Beispiel wurden die Zyten aus den eigenen roten Blutkörperchen des Spenders hergestellt, und der Antia-Spiegel im getesteten Serum der Gruppe O lag bei eins zu 32. Hier im sechsten Röhrchen gezeigt, wurden die Antigene der Blutgruppe A und B, die gleichzeitig in eine einzelne Rote Blutkörperchenprobe der Gruppe O eingefügt wurden, verwendet, um Zyten für eine Woche, B und eine Woche zu erzeugen.

Diese Zyten können für eine VO-Qualitätskontrolle verwendet werden. Die Analyse des spezifisch formulierten Zytes für eine Woche, eine Woche, eine Woche, das gegen Antia- und Anti-B-Reagenzien getestet wurde, ergab die erwarteten schwachen Reaktionen, wie in dieser Abbildung mit den Reaktionen im mittleren unteren Bereich der Röhrchen belegt. Diese einfache Technik kann in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.