Substrat Generation für Endonukleasen der CRISPR / Cas-Systeme

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente besteht darin, RNA-Substrate für die Untersuchung von Cas-Endonukleasen zu erzeugen, die entscheidende Rollen in den bei Bakterien und Archaeen vorkommenden CRISPR-Cas-Immunsystemen spielen, um RNA-Substrate für die Cas-Endonuklease zu erhalten. Die PCR-Amplifikation einer spezifischen CRISPR-Region kann verwendet werden, um eine lange DNA-Vorlage für die in-vitro-RNA-Produktion zu erhalten. Falls gewünscht.

Zwei Oligonukleotide können verwendet werden, um kürzere Vorlagen für die Herstellung von Substrat-RNA zu erzeugen. Alternativ können kurze, maßgeschneiderte, synthetisierte Wiederholungssequenzen anschließend in CAS-Endonuklease-Assays getestet werden. Letztendlich können die Produktion von RNA-Transkripten und der anschließende Schnitt durch die CAS-sechs-Endonuklease mittels Autoradiographie sichtbar gemacht werden.

Das Hauptziel der Presenter-Techniken besteht darin, Forschern die Untersuchung der CRISPR-RNA-Prozessierung mit RNA-Substraten unterschiedlicher Länge zu ermöglichen. Daher werden verschiedene Methoden zur Erzeugung kleiner RNAs eingesetzt, beispielsweise einzelne Wiederholungselemente oder größere RNAs wie crispr-RNA-Transkripte, die mehrere Spacer umfassen. Obwohl diese Methoden spezifische Einblicke in die Reifung von CRISPR-RNAs ermöglichen, können ähnliche Strategien zur Vorlagepräparation auch auf andere RNA-Prozessierungssysteme übertragen werden. Den Ablauf demonstrieren Muted Surface, eine Doktorandin, und Repl, der Postdoktorand, beide aus einem Labor für bakterielle und archaeelle CRISPR-Immunsysteme.

Eine virale DNA-Sequenz, die als Protospacer bezeichnet wird, kann zwischen zwei Wiederholungselementen in einem wachsenden CRISPR-Cluster in einem Prozess namens Adaptation eingefügt werden. Anschließend wird der gesamte CRISPR-Cluster transkribiert und dann durch eine Cas-Endonuklease, beispielsweise Cas6, zu kleinen CRISPR-RNAs verarbeitet. Die kleinen CRISPR-RNAs werden daraufhin in den CAS-Proteinkomplex-Cascade eingebaut und vermitteln die Wirtsabwehr gegen einen erneuten Virusangriff, wobei die Basenkomplementarität zwischen der CRISPR-RNA und dem Protospacer als Signal für den Abbau der viralen DNA dient, um lange Vorstufen von CRISPR-RNA-Substraten zu erzeugen.

Beginnen Sie mit dem Design von PCR-Primern, die auf die Spacer-Regionen eines CRISPR-Clusters abzielen, indem Sie die T-sieben-RNA-Polymerase-Promotorsequenz zum Vorwärtsprimer hinzufügen. Fügen Sie anschließend Restriktionsstellen an beide Primer hinzu, um das PCR-Produkt in einen Vektor klonen zu können. Beachten Sie, dass die T-sieben-RNA-Polymerase eine I-Guanin-Base für die korrekte Initiation der Transkription benötigt, nachdem die gewünschte prä-CRISPR-RNA-Sequenz mittels PCR aus der genomischen DNA amplifiziert wurde.

Trennen Sie die PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese und isolieren Sie das gewünschte Band aus dem Gel. Verdauen Sie anschließend das PCR-Produkt mit Restriktionsenzymen, um klebrige Enden zu erzeugen. Danach, nach der Reinigung Ihres PCR-Produkts mit einem PCR-Reinigungs-Kit, um eventuelle Spaltungsnebenprodukte zu entfernen, fügen Sie T4-DNA-Ligase, T4-DNA-Ligase-Puffer und ein molares Verhältnis von drei zu eins des gespaltenen PCR-Produkts zum DFOs4-verwandten Puck-Vektor mit den entsprechenden klebrigen Enden hinzu. Inkubieren Sie nun die Ligationsreaktion über Nacht bei 16 Grad Celsius und transformieren Sie danach das Gemisch mittels Standardprotokollen in kompetente E. coli-DH5α-Zellen, wobei Sie eine Blau-Weiß-Screening-Methode verwenden, um erfolgreiche Ligationen zu identifizieren.

Schließlich die Plasmide aus den weißen Kolonien mittels eines Plasmid-Präparationskits isolieren und positive Klone durch Plasmidsequenzierung identifizieren, um intermediäre prä-CRISPR-RNA-Substrate zu erzeugen. Beginnen Sie damit, Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotide mit der gewünschten CRISPR-Wiederholungssequenz zu entwerfen, ähnlich den hier gezeigten Sequenzen. Beachten Sie, dass die Oligonukleotide die Sequenz eines T7-RNA-Polymerase-Promotors sowie terminale Restriktionsschnittstellen nach der Terminierung der Oligonukleotide enthalten, um sicherzustellen, dass sticky ends entstehen.

Knien Sie sich hin, inkubieren Sie die Proben mit T4-Polynukleotidkinase und T4-Polynukleotidkinase-Puffer eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um die 5'-Enden jedes der Oligonukleotide zu phosphorylieren. Anschließend inkubieren Sie die phosphorylierten sense- und antisense-Oligonukleotide mit T4-DNA-Ligase-Puffer fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius auf einem Heizblock. Nachdem die Proben hybridisiert haben, schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Gemisch etwa zwei bis drei Stunden lang abkühlen, bis Raumtemperatur erreicht ist.

Ligieren Sie nun die synthetisierten Oligonukleotide mit einer Hybridisierungsmischung, die mit P-Vektor T4-DNA-Ligase-Puffer und einem TP bei 16 Grad Celsius über Nacht verdaut und dephosphoryliert wurde. Anschließend transformieren Sie die ligierten Plasmide mittels standardisierter Protokolle in kompetente E. coli-DH5α-Zellen, wobei mittels Blau-Weiß-Screening erfolgreiche Ligationen identifiziert werden. Schließlich isolieren Sie die Plasmide und identifizieren die positiven Klone durch Verdauung und anschließende Plasmidsequenzierung.

Kurze einzelne Wiederholungs-cas-RNA-Substratsequenzen können ähnlich wie die hier gezeigten entworfen werden. Stellen Sie sicher, dass ein Desoxyribonukleotid enthalten ist. Falls die Spaltstelle der RNA bestimmt werden soll, kann anschließend eine spezialisierte Synthese-Einrichtung zur Herstellung des RNA-Oligonukleotids genutzt werden.

Nach der Isolierung der Plasmide mit dem gewünschten, angepassten Substrat linearisieren Sie die Plasmide mithilfe eines Restriktionsenzyms, das stromabwärts der geklonten Fragmente schneidet, unter Verwendung eines Maxi-Präp-Plasmidreinigungs-Kits. Danach, nach Überprüfung des vollständigen Verdauens, reinigen Sie das linearisierte Plasmid durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. Gewinnen Sie die Nukleinsäuren durch Resuspension des Pellets in DEPC-behandeltem sterilem Wasser zurück.

Incubieren Sie nun die Verdauungsplasmide drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer frisch zubereiteten In-vitro-T7-RNA-Polymerase-Rundlauftranskriptionsmischung, die A-T-P, C-T-P, G-T-P und UTP enthält. Analysieren Sie anschließend die erhaltenen RNA-Transkripte in einem denaturierenden achtmolaren Harnstoff-12%-Polyacrylamidgel. Es ist außerdem möglich, die Transkripte mittels Mono-Q-Anionenaustauschchromatographie zu reinigen und anschließend durch Ethanolpräzipitation der RNA-Fraktionen wiederzugewinnen sowie die Pellets in mit DEPC behandeltem sterilem Wasser resuspendieren, um die Designsubstrate durch Endonuklease-Assays zu analysieren. Beginnen Sie dazu mit der Visualisierung der Substratbänder mittels Autoradiographie und reinigen Sie die Reaktionsprodukte durch Gelextraktion aus einem denaturierenden achtmolaren Harnstoff.

Ein 12 %iges Polyacrylamidgel, anschließend Herstellung und Reinigung der gewünschten rekombinanten Cas-Proteine über Hitzefällung und Nickel-NTA-Chromatographie, wie hier für das CAS6-Protein aus Clostridium thermocellum gezeigt. Danach das CAS-Protein 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit einer frisch hergestellten Endonuklease-Reaktionsmischung inkubieren, um die Endonuklease-Assay-Reaktion zu ermöglichen. Schließlich fünf Mikroliter der Reaktionsmischung auf ein acht molares Harnstoffgel laden.

12 %ige Polyacrylamidgel und Visualisierung der Spaltprodukte nach Elektrophorese mittels Autoradiographie. Hier ist ein mit Hine-Blau gefärbtes Polyacrylamidgel eines maßgeschneiderten RNA-Oligonukleotids sowie zweier in-vitro-RNA-Transkripte dargestellt. Beachten Sie, dass die Effizienz der RNA-Produktion zwischen den kurzen, langen und mittellangen Konstrukten variiert.

Die Untersuchung der RNA-Endonuklease-Aktivität erfordert positive und negative Kontrollen sowie hochreine rekombinante Cas-Proteine. In dieser Abbildung: Ein SDS-PAGE-Gel einer CAS6-Probenpräparation aus Clostridium thermocellum.

Nach der Wärmepräzipitation und Nickel-NTA-Chromatographie, die parallel zu einem Standard-Proteinkalibrator durchgeführt wurde, zeigt sich, dass eine geeignete negative Kontrollprobe ein Zelllysat ohne CAS-sechs-Expression enthalten sollte. Nach dem identischen CAS-sechs-Reinigungsverfahren wurde festgestellt, dass die CAS-sechs-Präparation den erforderlichen hohen Reinheitsgrad aufweist. Hier kann der Schnitt einer 5′-terminallabelierten Wiederholungssequenz-Substrat durch das Clostridium-thermocellulolyticum-CAS-sechs-Protein mittels Autoradiographie sichtbar gemacht werden.

Jede Spur enthält radioaktiv markiertes Substrat, RNA nach Inkubation mit dem ca-sechs Protein, wie durch die Pluszeichen angegeben, oder mit einem Puffer als negativer Kontrolle, wie durch die Minuszeichen gekennzeichnet, lange Substrate oder kurze Substrate mit oder ohne Zugabe des Desoxyribonukleotids. An der Position minus neun wurden Desoxyribonukleotide verwendet, um die Endonuklease-Reaktion zu erleichtern. Beachten Sie das Fehlen einer Spaltung der kurzen Substrate, wenn das Desoxyribonukleotid in das RNA-Molekül eingebaut wurde, nach diesem Verfahren.

CAS-sechs-Nukleasen können auch als Werkzeug zur Erzeugung reifer, knapper RNAs verwendet werden. Diese RNAs können in Kaskadenkomplexe eingebaut werden, um Erkenntnisse über ihre Beteiligung an der Abwehr von Virusangriffen zu gewinnen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CRISPR-es-Substrate für Cas und Nukleasen entwirft und herstellt.

Diese verschiedenen Substrate sind nützlich, um Fragen zur Reifung und Nutzung von CRISPR-Systemen zu beantworten.