Substrat Generation für Endonukleasen der CRISPR / Cas-Systeme

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente ist es, RNA-Substrate für die Untersuchung von Cas Endonukompaktase zu generieren, die eine entscheidende Rolle im crispr-Cass-Immunsystem spielen, das in Bakterien und ArcHa gefunden wird, um RNA-Substrate für Cas Endonukompaktase zu erhalten. Die PCR-Amplifikation einer spezifischen CRISPR-Region kann eingesetzt werden, um ein langes DNA-Template für die In-vitro-RNA-Produktion zu erhalten. Falls gewünscht.

Zwei Oligonukleotide können gekniet werden, um kürzere Templates für die Substrat-RNA-Produktion zu erzeugen. Alternativ können kurze, kundenspezifisch synthetisierte Wiederholungssequenzen in CAS-Endonuklease-Assays getestet werden. Letztendlich kann die Produktion von RNA-Transkripten und die anschließende Spaltung durch CAS-6-Endonuklease durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden.

Das Hauptziel der Presenter-Techniken ist es, Forscher in die Lage zu versetzen, die CRISPR-RNA-Verarbeitung mit RNA-Substraten unterschiedlicher Länge zu untersuchen. Daher werden verschiedene Methoden verwendet, um kleine RNAs zu erzeugen, z. B. einzelne Repeat-Elemente oder größere RNAs wie Crispr, RNA, Transkripte, die sich über mehrere Spacer erstrecken. Obwohl diese Methoden speziell Einblicke in die CRISPR-RNA-Reifung bieten, können ähnliche Template-Vorbereitungsstrategien für andere RNA-Prozessierungssysteme übernommen werden. Die Demonstration des Verfahrens wird für einen Doktoranden stummgeschaltet und den Postdoc sowohl aus einem Labor für Bakterien als auch für ArcHa CRISPR-Immunsysteme repräsentieren.

Eine virale DNA-Sequenz, die als Proto-Spacer bezeichnet wird, kann in einem Prozess, der als Adaptation bezeichnet wird, zwischen zwei sich wiederholende Elemente in einem wachsenden CRISPR-Cluster eingefügt werden. Als nächstes wird der gesamte CRISPR-Cluster transkribiert und dann durch eine Cass-Endonuklease, zum Beispiel CAS six, in kleine CRISPR-RNAs verarbeitet. Die kleinen CRISPR-RNAs werden dann in die Kaskade des CAS-Proteinkomplexes eingebaut und vermitteln die Abwehr des Wirts gegen einen wiederholten Virusangriff, wobei die Basenkomplementarität zwischen der CRISPR-RNA und dem Proto-Spacer als Signal für den viralen DNA-Abbau genutzt wird, um lange Prä-CRISPR-RNA-Substrate zu erzeugen.

Beginnen Sie mit der Entwicklung von PCR-Primern, die auf die Spacerregionen eines CRISPR-Clusters abzielen, indem Sie die T-Sieben-RNA-Polymerase-Promotorsequenz zum Vorwärtsprimer hinzufügen. Fügen Sie dann beiden Primern Restriktionsstellen hinzu, um das PCR-Produkt in einen Vektor zu klonen. Es ist zu beachten, dass die T-sieben-RNA-Polymerase einen I-Guinea-Rest für die ordnungsgemäße Initiierung der Transkription benötigt, nachdem die interessierende Prä-CRISPR-RNA-Sequenz aus der genomischen DNA durch PCR amplifiziert wurde.

Trennen Sie die PCR-Produkte, Viagra aose Gel-Elektropherese und Gel-Extrakt das Verlangen verboten, dann verdauen Sie das PCR-Produkt mit Restriktionsenzymen, um klebrige Enden zu erzeugen. Nachdem Sie Ihr PCR-Produkt mit einem PCR-Aufreinigungskit gereinigt haben, fügen Sie zur Beseitigung von Spaltnebenprodukten T vier DNA Ligase, T vier DNA Ligase Puffer und ein molares Verhältnis von drei zu eins des gespaltenen PCR-Produkts zu den vier verwandten Puck-Vektoren der DFOs mit den entsprechenden klebrigen Enden hinzu. Inkubieren Sie nun die Ligationsreaktion über Nacht bei 16 Grad Celsius und wandeln Sie das Gemisch dann in kompetente E-coli, DH fünf Alpha-Zellen nach Standardprotokollen um, wobei ein Blau-Weiß-Screening verwendet wird, um eine erfolgreiche Ligation zu identifizieren.

Isolieren Sie schließlich die Plasmide aus den weißen Kolonien mit einem Plasmidvorbereitungskit und identifizieren Sie positive Klone durch Plasmidsequenzierung, um Prä-CRISPR-RNA-Substrate mittlerer Größe zu erzeugen. Beginnen Sie mit dem Entwerfen von Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotiden mit der gewünschten CRISPR-Wiederholungsraumsequenz, die den hier gezeigten Sequenzen ähnelt. Es ist zu beachten, dass die Oligonukleotide die Sequenz eines T-Sieben-RNA-Polymerase-Promotors sowie terminale Restriktionsstellen nach Beendigung der Oligonukleotide enthalten, um sicherzustellen, dass sich klebrige Enden bilden.

Nach einem Knien inkubieren die Proben mit T-4-Polynukleotidkinase und T-4-Polynukleotidkinase-Puffer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius auf fünf Primephosphorylat, jeweils eine Anomalie von jedem der Oligonukleotide. Dann inkubieren Sie die phosphorylierten Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotide mit T-Vier-DNA-Ligase-Puffer für fünf Minuten bei 95 Grad Celsius auf einem Heizblock. Nachdem die Proben hybridisiert sind, schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie die Mischung etwa zwei bis drei Stunden abkühlen, bis sie Raumtemperatur erreicht hat.

Nun ligieren Sie die sogenannten Oligonukleotide mit einem Hybridisierungsmix, verdautem und dephosphoryliertem P-Vektor, T, vier DNA-Ligase-Puffern und einem TP bei 16 Grad Celsius über Nacht. Transformieren Sie dann die ligierten Plasmide in kompetente E-coli, DH fünf Alpha-Zellen durch Standardprotokolle unter Verwendung von Blau-Weiß-Screening, um eine erfolgreiche Ligation zu identifizieren. Isolieren Sie schließlich die Plasmide und identifizieren Sie die positiven Klone durch Verdau und anschließende Plasmidsequenzierung.

Kurze Cas-RNA-Substratsequenzen mit einfacher Wiederholung können ähnlich wie die hier gezeigten gestaltet werden. Achten Sie darauf, ein Desoxy-Ribonukleotid einzuschließen. Wenn der Ort der RNA-Spaltung bestimmt werden soll, kann eine kundenspezifische Syntheseanlage verwendet werden, um die Produktion des RNA-Oligonukleotids zu implementieren.

Nach der Isolierung der Plasmide mit dem kundenspezifischen Substrat der Wahl werden die Plasmide mit einem Maxi-Prep-Plasmidaufreinigungskit mit dem Restriktionsenzym linearisiert, das stromabwärts der klonierten Fragmente spaltet. Nachdem Sie einen vollständigen Aufschluss sichergestellt haben, reinigen Sie das linearisierte Plasmid durch Phenolchloroform-Extraktion und Ethanolfällung. Die Nukleinsäuren werden durch Reanimation zurückgewonnen, wobei das Pellet in DEPC-behandeltem sterilem Wasser suspendiert wird.

Inkubieren Sie nun die Verdauungsplasmide in einem frisch zubereiteten in vitro T sieben RNA-Polymerase-Abfluss-Transkriptionsgemisch, einschließlich A-T-P-C-T-P-G-T-P und UTP für drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Analysieren Sie schließlich die erhaltenen RNA-Transkripte auf einem denaturierenden acht molaren Harnstoff, 12%Polyacrylamid-Gel. Es ist auch möglich, die Transkripte mittels Mono-Q-Anionenaustauschchromatographie zu reinigen und dann die Transkripte durch Ethanolfällung der RNA-Fraktionen und Wiederbelebung der Pellets in DEPC-behandeltem sterilem Wasser zurückzugewinnen, um die Designsubstrate durch Endonuklease-Assays zu analysieren. Beginnen Sie mit der Visualisierung der Substratbanden durch Autoradiographie und reinigen Sie die Reaktionsprodukte durch Gelextraktion aus einem denaturierenden Harnstoff mit acht Molaren.

12%Polyacrylamid-Gel produziert und reinigt dann die gewünschten rekombinanten Cas-Proteine durch Hitzefällung, eine Nickel-NTA-Chromatographie, wie für dieses CAS-Sechs-Protein aus der Clostridium-Thermozelle gezeigt. Kombinieren Sie dann das CAS-Protein mit einem frisch zubereiteten Endonuklease-Reaktionsgemisch für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, damit die Endonuklease-Assay-Reaktion stattfinden kann. Zum Schluss wird fünf des Reaktionsgemisches auf einen acht molaren Harnstoff geladen.

12% Polyacrylamid-Gel und visualisieren Sie die Spaltprodukte nach der Elektrophorese durch Autoradiographie. Hier ist ein hineblau gefärbtes Polyacrylamid-Gel eines speziell entwickelten RNA-Oligonukleotids und zwei in vitro RNA-Transkripten dargestellt. Beachten Sie, dass die Effizienz der RNA-Produktion zwischen den Konstrukten mit kurzer, langer und mittlerer Länge variiert.

Die Untersuchung der RNA-Endonuklease-Aktivität erfordert positive Negativkontrollen sowie hochgereinigte rekombinante Cas-Proteine. In dieser Abbildung. Ein SDS-Seitengel einer CAS-Vorbereitung für sechs Proben aus einer Clostridium-Thermozelle.

Nach Hitzefällung und Nickel wird die NTA-Chromatographie zusammen mit einem Standardproteinmarker gezeigt. Eine geeignete Negativkontrollprobe sollte ein Zelllysat ohne CAS-6-Expression enthalten, aber nach dem identischen CAS-6-Aufreinigungsverfahren wurde bestimmt, dass das CAS-6-Präparat den erforderlichen hohen Reinheitsgrad aufweist. Hier kann die Spaltung eines mit fünf Primzahlen markierten Repeat-Sequenz-Substrats durch das co Clostridium thermo cell CAS sechs Protein mittels Autoradiographie sichtbar gemacht werden.

Jede Spur enthält radioaktiv markiertes Substrat, RNA nach Inkubation mit ca. sechs Proteinen, wie durch die Pluszeichen angezeigt, oder mit einem Puffer als Negativkontrolle, wie durch die Minuszeichen gekennzeichnet, lange Substrate oder kurze Substrate mit oder ohne Zusatz des Desoxy-Ribonukleotids. An Position minus neun wurden verwendet, um die Endonuklease-Reaktion zu erleichtern. Beachten Sie, dass die kurzen Substrate nicht gespalten wurden, wenn das Desoxy-Ribonukleotid in das RNA-Molekül aufgenommen wurde. Nach diesem Verfahren.

CAS six Nukleasen können auch als Werkzeug zur Erzeugung reifer, knackiger RNAs verwendet werden. Diese RNAs können in Kaskadenkomplexe eingebaut werden, um Einblicke in die Beteiligung an der Interferenz von Virusangriffen zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CRISPR-es-Substrate für Cas und Nukleasen entwirft und herstellt.

Diese unterschiedlichen Substrate sind nützlich, um Fragen zur Reifung und Verwertung von crispr E zu beantworten.