Bioluminescent orthotopen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs Progression

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein orthotopes Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erstellen, das in vivo Biolumineszenz-Bildgebung verwendet, um die Tumorentwicklung nicht-invasiv zu überwachen. Dies wird durch eine erste Reanimation von Luciferase-markierten Krebszellen in Matrigel erreicht. Der zweite Schritt besteht darin, eine Laparotomie durchzuführen, um die Bauchhöhle zu öffnen und die Bauchspeicheldrüse zu lokalisieren und zu sichern.

Als nächstes wird eine Suspension von Tumorzellen in Matrigel in die Bauchspeicheldrüse injiziert. Der letzte Schritt besteht darin, die Bauchspeicheldrüse zu ersetzen und die Bauchhöhle mit Nähten zu verschließen. Letztendlich wird die Biolumineszenz-Bildgebung eingesetzt, um das Fortschreiten des Tumors zu überwachen und das Ansprechen auf therapeutische Eingriffe zu verfolgen.

Der Hauptvorteil dieses Modells gegenüber in vitro basierten Zellassays oder subkutanen Modellen des Bauchspeicheldrüsenkarzinoms besteht darin, dass es uns ermöglicht, die Wechselwirkungen zwischen den Pankreastumorzellen und der Pankreasmikroumgebung zu untersuchen. Die Kinetik des Krankheitsverlaufs in diesem Modell ist hochgradig reproduzierbar und tritt in einem kurzen Zeitrahmen auf, was dieses Modell für die Untersuchung neuartiger Therapeutika bei Bauchspeicheldrüsenkrebs nützlich macht. Da die Injektion von Tumorzellen vorsichtig durchgeführt werden muss, um ein Auslaufen zu verhindern, beginnt die Kultur mit diesem Verfahren.

Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, die transduziert wurden, um Luciferase zu exprimieren, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, bis sie zu 70 % konfluiert sind, dann die Zellen mit 0,05 % Trips in EDTA zu ernten und sie mit einem Hämozytometer zu zählen, sicherzustellen, dass die Lebensfähigkeit größer als 90 % istAls nächstes pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie nach der Zentrifugation fünf Minuten lang sanft bei der 200-fachen Schwerkraft zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Bauchspeicheldrüsenkrebszellen bei 20 Millionen Zellen pro Milliliter. In einer Mischung aus drei bis zwei Matrigel und gekühltem PBS die Mischung auf Eis legen. Verwenden Sie dann eine 0,3-Milliliter-Insulinspritze mit 29 Gauge.

Ziehen Sie die vorbereitete Matrigel-Zellsuspension in die Spritze auf. Um dieses Verfahren zu beginnen, betäuben Sie die Maus mit zwei bis 3 % inhaliertem Isofluran. Überprüfen Sie nach ein bis zwei Minuten die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehe der Maus vorsichtig zusammendrücken, um zu überprüfen, ob kein Pedalreflex vorhanden ist.

Tragen Sie anschließend ausreichend Gleitmittel auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen während der Operation zu verhindern. Positionieren Sie dann die Maus auf dem Rücken auf einem 37 Grad Celsius warmen Heizkissen und drehen Sie die Maus vorsichtig, um die linke Seite des Bauches anzuheben. Sobald Sie richtig ausgerichtet sind, bereiten Sie den Bauch der Maus für die Operation vor.

Machen Sie mit sterilen chirurgischen Instrumenten einen 1,5 Zentimeter langen Schnitt durch die Haut etwa zwei Millimeter links seitlich von der Mittellinie. Machen Sie dann einen 1,5 Zentimeter großen Schnitt in den darunter liegenden Bauchmuskel. Lokalisieren Sie anschließend die Milz mit einer sterilen Pinzette und entfernen Sie sie vorsichtig für die Bauchhöhle.

Befestigen Sie die Milz an einem sterilen Wattestäbchen, um die darunter liegende Bauchspeicheldrüse freizulegen. Lokalisieren Sie dann den Schwanz der Bauchspeicheldrüse neben der Milzresus. Suspendieren Sie die Matrigel-Zellsuspension und injizieren Sie nach der Injektion 20 Mikroliter in den Schwanz der Bauchspeicheldrüse.

Halten Sie die Spritze 30 bis 60 Sekunden lang an Ort und Stelle, bis das Matrigel Zeit hatte, sich zu verfestigen. Dieser wichtige Schritt minimiert das Austreten der Zellen. Nachdem die Nadel entfernt wurde, untersuchen Sie die Injektionsstelle, um sicherzustellen, dass keine Leckage aufgetreten ist. Bringen Sie dann die Milz und die Bauchspeicheldrüse wieder in die Bauchhöhle zurück.

Verschließen Sie die Bauchmuskulatur der Maus mit einer resorbierbaren, geflochtenen Vier-Auto-Naht mit einer Rundnadel mit einem durchgehenden Stich. Als nächstes verschließen Sie die Außenhaut mit einem nicht resorbierbaren Monofilament. Six aut mit einer Schneidenadel mit einem Endlosstich nähen und Betadine auftragen.

Nehmen Sie dann die Maus aus dem Inhalationsanästhetikum und injizieren Sie zwischen 0,05 und 0,1 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin subkutan. Lassen Sie die Maus als postoperatives Analgetikum in ihrem Käfig erholen, der auf einem 37 Grad Celsius warmen Heizkissen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser liegt. Überwachen Sie die Maus in den ersten Tagen nach der Operation weiterhin engmaschig.

Wenn die Maus Anzeichen von Schmerzen wie Buckeln oder eingeschränkter Beweglichkeit zeigt, kann Buprenorphin über einen Zeitraum von 36 Stunden alle 12 Stunden subkutan verabreicht werden. Nachdem die Operationsstelle in sieben bis 10 Tagen verheilt ist, betäuben Sie die Maus und entfernen Sie die äußeren Nähte. Beginn der biolumineszierenden Verfolgung der Bauchspeicheldrüsenkrebszellen.

Betäuben Sie die Maus erneut mit zwei bis 3% inhaliertem Fluor und tragen Sie Gleitmittel auf die Augen auf, um ein austrocknendes Absterben zu verhindern. Nach der Betäubung injizieren Sie 150 Milligramm pro Kilogramm Luzifer über die Schwanzveneninjektion und lassen Sie den Luzifer ein bis zwei Minuten lang zu den Zellen gelangen. Platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite im biolumineszierenden Bildgebungssystem, so dass der Tumor in Richtung Kamera zeigt.

Hier verwenden wir das Illumina Two Imaging System. Nehmen Sie dann Weißlicht- und Biolumineszenzbilder mit der Bildgebungssoftware auf, wie zuvor in anderen JOV-Artikeln beschrieben. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Maus aus dem Inhalationsanästhetikum und lassen Sie sie sich in ihrem Heimatkäfig erholen.

Wiederholen Sie diese Schritte während der gesamten Dauer des Tumorwachstums, um das Tumorwachstum zu untersuchen. Kinetik. Die Verwendung von Luciferase-markierten Zelllinien bietet eine einzigartige Möglichkeit, das Tumorwachstum zu messen. Nicht-invasiv. Hier ist eine Maus 10 Tage nach der Injektion mit einem relativ kleinen Tumor, 31 Tage nach der Injektion, bei der sich der Tumor vergrößert hat, und fünf Tage nach der Resektion des Tumors.

Die Biolumineszenz, die in diesem Bild zu sehen ist, zeigt ein Wiederauftreten des Pankreastumors fünf Tage nach der Resektion sowie Metastasen in die nahe gelegene Leber. Die hier gezeigte Grafik zeigt ähnliche Wachstumsraten für die Matrigel-Zellinjektionsmethode. In diesem Video wird eine andere Methode verglichen, bei der Pankreastumorstücke transplantiert werden.

Eine ähnliche Wachstumskinetik ist sowohl für die Pan One als auch für die Capin One zu beobachten. Zelllinien nach der Tötung, H- und D-Färbung wurden durchgeführt, um die invasive Natur der Bauchspeicheldrüsenkrebszellen in das umgebende Pankreasgewebe zu zeigen, das hier durch die gelben Sterne gekennzeichnet ist, sowie Metastasen in anderen Organen, einschließlich der hier gezeigten Leber. Einmal gemeistert, können diese Methoden in etwa 10 Minuten durchgeführt werden.

Darüber hinaus macht die biozentrische Visualisierung von metastasierten und rezidivierenden Krankheitsverläufen dieses Modell klinisch relevant, da die meisten Krebstherapeutika derzeit palliativ sind.