Phosphopeptid Analyse der Nebenhoden Nagetier Spermien

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Phosphopeptidveränderungen zu quantifizieren, die während der Spermienreifung in den Spermien auftreten. Dies wird erreicht, indem der Nebenhoden aus der Maus entfernt, die Samenzellen retrograd zurückgespült und die Zellen in einem Mikrokapillarröhrchen gesammelt werden. Als nächstes werden die Samenzellen in eine ausgewogene Salzlösung schwimmen gelassen, die die Entfernung von kontaminierenden Proteinen ermöglicht, und dann werden sie gewaschen, liegen und ausgefällt, um kontaminierende Salze und Fette zu entfernen.

Die Gularproteine werden mit Trypsin verdaut und dann mit Titandioxid angereichert, um sie für Phosphopeptide anzureichern. Die Ergebnisse zeigen quantitative Veränderungen des Phosphorylierungsstatus von Proteinen auf der Grundlage der Flüssigkeitschromatographie und der Massenspektrometrie. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Reproduktionsbiologie zu beantworten, z. B. welche phosphoproteomischen Veränderungen auftreten, wenn die Spermien die EPIs durchlaufen oder während der Kapazitation.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Biologie der Spermien gegeben hat, kann sie auch auf Modellorganismen, Krankheitsstudien wie Krebs, neurologische Pathologien und allgemeine Signaltransduktionswege angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist, die Anatomie der Bereiche zu bestimmen, in denen die EPIs manipuliert werden. Beginnen Sie mit der Herstellung von 200 Millilitern Biggers, Whitten and Whitten oder BWW Arbeitsstiellösung, indem Sie Folgendes zu einem Liter Milli Q Wasser hinzufügen, um eine Kanüle herzustellen.

Verwendung von Polyethylenschläuchen mit Innen- und Außendurchmessern von 0,4 Millimetern bzw. 1,1 Millimetern. Halten Sie es bei schwacher Hitze, bis der Schlauch zu schmelzen beginnt. Ziehen Sie sofort die Enden des Schlauchs nach außen, um ihn zu dehnen und so den Außendurchmesser zu verringern.

Schneiden Sie den Schlauch so ab, dass eine Verengung an einem Ende entsteht, was eine leichtere Kanülierung der S deens ermöglicht. Schneide das gegenüberliegende Ende auf ca. 15 Zentimeter ab. Führen Sie dann eine 30-Gauge-Nadel in das stumpfe Ende ein und befestigen Sie eine vollständig eingezogene Drei-Milliliter-Spritze daran.

Stellen Sie ein Saugmundstück her, indem Sie einen 20 Zentimeter langen PE-Schlauch abschneiden und in ein Ende der Kanüle einführen. Setzen Sie den Mikrokapillar-Glasrohrhalter und die Glas-Mikrokapillare ein. Nachdem Sie eine Maus gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert haben, machen Sie einen kleinen Schnitt im Hodensack, um den Epi freizulegen.

Dann beauftragen Sie ein Paar Uhrmacher. Nummer fünf Zange, um den Hoden und den Nebenhoden aus der Höhle zu ziehen. Schneiden, um bis auf etwa ein bis zwei Zentimeter alles von der enormen Ehrerbietung aus dem Kata Nebenhoden zu entfernen.

Schneiden Sie dann, um die proximalen EENT-Kanäle und das Gewebe, das den Nebenhoden mit dem Hoden verbindet, zu entfernen, und entfernen Sie die gesamte männliche Fortpflanzungsspur unter einem Präpariermikroskop mit fünf- bis 40-facher Vergrößerung. Legen Sie ein bis zwei Zentimeter des verengten Endes der Kanüle in das Sichtfeld und befestigen Sie sie mit Klebeband mit Nummer fünf, der Uhrmacherzange. Fassen Sie vorsichtig jede Seite der riesigen Ehrerbietung und ziehen Sie sie über den sichtbaren Teil der Kanüle.

Binden Sie dann mit nicht resorbierbarer, schwarzer, geflochtener, behandelter Seide mit Hilfe von Uhrmachern einen sicheren Knoten um das kanülierte Gewebe. Nummer fünf Pinzetten. Fassen Sie das distale Ende der Kata epi ides und entfernen Sie die Tunika Eugenia.

Um einen einzelnen epidermalen Tubulus freizulegen, legen Sie den Tubulus vorsichtig frei und ziehen Sie ihn auseinander, um eine Öffnung für die Freisetzung der Spermien zu schaffen. Drücken Sie dann vorsichtig auf den Kolben der Spritze, um Luft in die weite Ehrerbietung zu stoßen. Der Druck führt dazu, dass die Spermien aus dem gebrochenen Tubulus austreten.

Saugen Sie dann das Mundstück an, um die Spermien in die Glaskapillare zu ziehen. Blasen Sie vorsichtig in das Mundstück oder setzen Sie eine Spritze auf und stoßen Sie die Spermien aus der Glaskapillare in einen Milliliter Vorkriegslösung B WW aus. Und verwenden Sie die Lösung, um die Zellen dreimal zu waschen, um alle kontaminierenden Proteine zu entfernen.

Nachdem Sie die letzte Wäsche entfernt haben, frieren Sie das Sperma für die spätere Verwendung ein oder verwenden Sie 4%Chaps, zwei molare Thio-Harnstoffe und 50 Millimolare Tris pH 7,4, um die Proteine zu solulisieren, die eine Stunde lang mit intermittierendem Vortexen inkubieren. Dann zentrifugieren Sie die Lösung 20 Minuten lang bei 10.000 GS und überführen den Überstand in ein neues Röhrchen, um die Disulfidbindungen zu reduzieren, und alkylieren Sie die Proteine bei DTT in einer Endkonzentration von 10 Millimolar zur Proteinlösung. Vortexen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Geben Sie dann 50 Millimolar IO-Acetamid in den Lysat-Wirbel und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Um die Proteine auszufällen, kombinieren Sie ein Volumen Lysat, ein Volumen Methanol und 0,5 Volumen Chloroform. Nachdem Sie die Probe vortexiert haben, drehen Sie sie zwei Minuten lang bei 10.000 gs, sammeln Sie die oberste Schicht und lassen Sie etwa zwei Millimeter übrig, um ein Ansaugen der Grenzfläche zu vermeiden.

Nachdem Sie ein Volumen Methanol hinzugefügt haben, drehen Sie das Rohr vorsichtig um und drehen Sie es erneut. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet drei bis vier Minuten lang an der Luft, um Trypsin, Verdauung und Phosphopeptidanreicherung durchzuführen. Beginnen Sie mit der Verwendung von 25 millimolaren Ammoniumbicarbonat, das einen molaren Harnstoff enthält.

Um das Trypsin zu rekonstituieren, wird F 50 zu einem Gewichtsverhältnis von Protein zu Trypsin kombiniert und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 700 U/min in einem Thermomischer inkubiert. Nach dem Schleudern zum Pelletieren des unverdauten Materials wird der Überstand in ein neues Rohr überführt. Unter Verwendung eines DHB-Puffers, der gemäß dem Textprotokoll hergestellt wurde, verdünnen Sie die versuchten Peptide zehnfach und tragen Sie ihn auf 200 Mikrogramm trockene Titandioxidkügelchen auf. Inkubieren Sie nach der Inkubation eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Verwenden Sie den DHB-Puffer, um die Probe erneut zu waschen, bevor Sie einen Waschpuffer verwenden, der aus 80 %A CN und 2 %TFA besteht, um die Probe nach der abschließenden Zentrifugation dreimal zu waschen. Zugabe von 2,5 % Ammoniumhydroxid unmittelbar nach dem Schleudern und Auffangen des Überstands.

Verwenden Sie 0,3 Mikroliter Ameisensäure, um die Probe anzusäuern, wie hier zu sehen. Ein Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass die Spermien isoliert werden. Im Ruhezustand verklumpen viele Zellen kurz nach der Austreibung in das B-WW-Medium.

Nach 10 Minuten werden sie jedoch modal und die Lösung wird homogen. Das in diesem Video beschriebene Präparat produziert typischerweise 200 mal 10 bis sechs Zoen. Diese Abbildung zeigt die Reinheit der Spermien der AR-Ratte Cota epididymus.

Ein wichtiges Problem bei der Probenvorbereitung ist die Ausbeute aus Trips und Aufschluss. Im Gegensatz zur TCA-Fällung, bei der häufig der pH-Wert der Probe angepasst werden muss, erfolgt die Phenol-Chloroform-Fällung schnell und säuert nicht an. Die hier gezeigte Probe ist das Proteinpellet, das typischerweise aus 100 Mikrogramm Probe zwischen der unteren und oberen Grenzfläche gesehen wird. Hier ist die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls.

Die blauen Streifen, die im Laufe der Zeit erscheinen, sind Peptide, die auf eine C18-Nanosäule anspielen. Wenn die Konzentration von Acetonitril in der Modalpopulation zunimmt, gibt es bei etwa 651,5 Dalton einen Peptidcluster, der im Nicht-Bereich völlig fehlt. Einmal ist das Phosphatpeptidanreicherungsprotokoll eine effiziente Technik.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Probenvorbereitung ein Schlüsselaspekt ist, um reproduzierbare Ergebnisse für die Proteomik zu erhalten. Diese Methode kann angepasst werden, um Glykoproteine zu isolieren, mit denen zusätzliche Fragen beantwortet werden können, z. B. welche Proteine eine Veränderung des Sicsäuregehalts ihres Proteoms erfahren.