Name: Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines Hochdurchsatz-Screenings für Mycobacterium abscessus mit doppelten Reporterstämmen. Diese Methode beschleunigt die Arzneimittelforschung gegen resistente Bakterien erheblich.

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<meta charset="utf8"></head><body>Hochdurchsatz-Screening-Assay für Mycobacterium abscessus mit Dual-Reportern

<ol><li>Victoria, L., Gupta, A., Gomez, J. L., Robledo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+complex%3A+A+review+of+recent+developments+in+an+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus complex: A review of recent developments in an emerging pathogen.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 659997(2021).</li>
<li>Luthra, S., Rominski, A., Sander, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antibiotic-target-modifying+and+antibiotic-modifying+enzymes+in+Mycobacterium+abscessus+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of antibiotic-target-modifying and antibiotic-modifying enzymes in Mycobacterium abscessus drug resistance.</a> Front Microbiol. 9, 2179(2018).</li>
<li>Nathavitharana, R. R., Strnad, L., Lederer, P. A., Shah, M., Hurtado, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+questions+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+M.+abscessus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Top questions in the diagnosis and treatment of pulmonary M. abscessus disease.</a> Open Forum Infect Dis. 6 (7), ofz221(2019).</li>
<li>Cristancho-Rojas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Mycobacterium abscessus.</a> Clin Microbiol Infect. 30 (6), 712-717 (2024).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+repositioning%3A+Progress+and+challenges+in+drug+discovery+for+various+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug repositioning: Progress and challenges in drug discovery for various diseases.</a> Eur J Med Chem. 234, 114239(2022).</li>
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<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+antibacterial+drug+screening+methods%3A+Current+prospects+for+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Evolution of antibacterial drug screening methods: Current prospects for mycobacteria.</a> Microorganisms. 9 (12), 2562(2021).</li>
<li>Attene-Ramos, M. S., Austin, C. P., Xia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Encycl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">High throughput screening.</a> Encycl Toxicol. 3, 916-917 (2014).</li>
<li>Gupta, R., Netherton, M., Byrd, T. F., Rohde, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter-based+assays+for+high-throughput+drug+screening+against+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reporter-based assays for high-throughput drug screening against Mycobacterium abscessus.</a> Front Microbiol. 8, 2204(2017).</li>
<li>Bento Clara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+double-reporter+strains+of+Mycobacterium+abscessus+for+drug+discovery%3A+A+study+in+mScarlet%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel double-reporter strains of Mycobacterium abscessus for drug discovery: A study in mScarlet.</a> Microbiol Spectr. , e0036224(2024).</li>
<li>Kolbe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+optimization+of+chromosomally-integrated+fluorescent+Mycobacterium+tuberculosis+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and optimization of chromosomally-integrated fluorescent Mycobacterium tuberculosis reporter constructs.</a> Front Microbiol. 11, 591866(2020).</li>
<li>Lopez-Roa, P., Esteban, J., Munoz-Egea, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+review+on+the+mechanisms+of+pathogenicity+in+Mycobacterium+abscessus%2C+a+rapidly+growing+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Updated review on the mechanisms of pathogenicity in Mycobacterium abscessus, a rapidly growing emerging pathogen.</a> Microorganisms. 11 (1), 90(2022).</li>
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<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CLSI+document+M07-A10%22">CLSI document M07-A10</a>. , 10th ed, Wayne, PA. (2015).</li>
<li>Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferricin+peptides+increase+macrophages%27+capacity+to+kill+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Lactoferricin peptides increase macrophages' capacity to kill Mycobacterium avium.</a> mSphere. 2 (4), e00301-e00317 (2017).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+beyond+typical+treatments+for+atypical+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Looking beyond typical treatments for atypical mycobacteria.</a> Antibiotics (Basel). 9 (1), 18(2020).</li>
<li>Spizek, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lincosamides%3A+Chemical+structure%2C+biosynthesis%2C+mechanism+of+action%2C+resistance%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Lincosamides: Chemical structure, biosynthesis, mechanism of action, resistance, and applications.</a> Biochem Pharmacol. 133, 20-28 (2017).</li>
<li>Hurst-Hess, K. R., Rudra, P., Ghosh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+protection+as+a+mechanism+of+lincosamide+resistance+in+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ribosome protection as a mechanism of lincosamide resistance in Mycobacterium abscessus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (11), e0118421(2021).</li>
<li>Kang, J. K., Kang, H. K., Hyun, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+effects+of+spiramycin+in+lps-activated+raw+264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory effects of spiramycin in lps-activated raw 264.7 macrophages.</a> Molecules. 27 (10), 3202(2022).</li>
<li>Zimmermann, P., Ziesenitz, V. C., Curtis, N., Ritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+effects+of+macrolides-a+systematic+review+of+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory effects of macrolides-a systematic review of the underlying mechanisms.</a> Front Immunol. 9, 302(2018).</li>
<li>Pradhan, S., Madke, B., Kabra, P., Singh, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+effects+of+antibiotics+and+their+use+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of antibiotics and their use in dermatology.</a> Indian J Dermatol. 61 (5), 469-481 (2016).</li>
<li>Volochnyuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+commercially+available+compounds+for+hts%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Evolution of commercially available compounds for hts.</a> Drug Discov Today. 24 (2), 390-402 (2019).</li>
<li>Sritharan, S., Sivalingam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+on+time-tested+anticancer+drug+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review on time-tested anticancer drug doxorubicin.</a> Life Sci. 278, 119527(2021).</li>
<li>Arwanih, E. Y., Louisa, M., Rinaldi, I., Wanandi, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+mechanism+of+acute+myeloid+leukemia+cells+against+daunorubicin+and+cytarabine%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Resistance mechanism of acute myeloid leukemia cells against daunorubicin and cytarabine: A literature review.</a> Cureus. 14 (12), e33165(2022).</li>
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<li>Schultz, C. W., Nevler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrvinium+pamoate%3A+Past%2C+present%2C+and+future+as+an+anti-cancer+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Pyrvinium pamoate: Past, present, and future as an anti-cancer drug.</a> Biomedicines. 10 (12), 3249(2022).</li>
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<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton%3A+A+novel+therapeutic+drug+candidate+for+Mycobacterium+abscessus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton: A novel therapeutic drug candidate for Mycobacterium abscessus infection.</a> Molecules. 24 (24), 4511(2019).</li>
<li>Perry, C. M., Scott, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cefdinir%3A+A+review+of+its+use+in+the+management+of+mild-to-moderate+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Cefdinir: A review of its use in the management of mild-to-moderate bacterial infections.</a> Drugs. 64 (13), 1433-1464 (2004).</li>
<li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+clinically+approved+cephalosporins+for+tuberculosis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Repurposing clinically approved cephalosporins for tuberculosis therapy.</a> Sci Rep. 6, 34293(2016).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+l%2Cd-transpeptidases+are+susceptible+to+inactivation+by+carbapenems+and+cephalosporins+but+not+penicillins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus l,d-transpeptidases are susceptible to inactivation by carbapenems and cephalosporins but not penicillins.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (10), e00866-e00917 (2017).</li>
<li>Alvirez-Freites, E. J., Carter, J. L., Cynamon, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+activities+of+gatifloxacin+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1022-1025 (2002).</li>
<li>Braback, M., Riesbeck, K., Forsgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibilities+of+Mycobacterium+marinum+to+gatifloxacin%2C+gemifloxacin%2C+levofloxacin%2C+linezolid%2C+moxifloxacin%2C+telithromycin%2C+and+quinupristin-dalfopristin+%28synercid%29+compared+to+its+susceptibilities+to+reference+macrolides+and+quinolones%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibilities of Mycobacterium marinum to gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, telithromycin, and quinupristin-dalfopristin (synercid) compared to its susceptibilities to reference macrolides and quinolones.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1114-1116 (2002).</li>
</ol>

Mycobacterium abscessus (Mab) ist ein opportunistischer Erreger, der für Lungeninfektionen verantwortlich ist, insbesondere bei Menschen mit Mukoviszidose und anderen Lungenerkrankungen. Infektionen, die durch Mab verursacht werden, sind aufgrund ihrer exquisiten intrinsischen Arzneimittelresistenz, vergleichbar mit der multiresistenten Tuberkulose, berüchtigt schwierig zu behandeln1. Die verfügbaren Medikamente sind aufgrund der hochundurchlässigen mykobakteriellen Zellhülle und eines Genoms, das für mehrere Enzyme kodiert, die Antibiotika deaktivieren, weitgehend wirkungslos2. So umfasst die Behandlung die Kombination mehrerer Medikamente, die Monate bis Jahre dauert. Dieses anspruchsvolle Multi-Drug-Schema in Kombination mit der geringen Compliance der Patienten führt zu einer durchschnittlichen Heilungsrate von 30 % bis 50 %3. Darüber hinaus hat die Prävalenz von Lungeninfektionen, die durch nicht-tuberkulöse Mykobakterien verursacht werden, in den letzten Jahrzehnten zugenommen, einschließlich derjenigen, die durch Mabverursacht werden 1,4. Daher arbeitet die wissenschaftliche Gemeinschaft an einem Wettlauf um die Entwicklung neuer Wirkstoffe zur Behandlung von Mab-Infektionen.
Eine der Strategien, die zu diesem Zweck verfolgt werden, ist das Drug Repurposing - der Prozess der Identifizierung neuer therapeutischer Möglichkeiten für bestehende Medikamente. Dadurch wird die größte Herausforderung umgangen, die mit der Entdeckungs- und Entwicklungspipeline eines neuen Medikaments einhergeht - Zeit5. Dieses einfache Konzept nutzt die bereits etablierten pharmakokinetischen und Sicherheitsprofile mehrerer Medikamente, um die Entwicklungskosten zu senken und die Zeitspanne zu verkürzen, die benötigt wird, um ein Medikament vom Labortisch bis zum Krankenbett zu bringen6. So wurden Bibliotheken zusammengestellt, die Hunderte bis Tausende solcher Verbindungen kombinieren, die es den Forschern ermöglichen, schnell die Möglichkeit der Wiederverwendung von Medikamenten gegen ihren Erreger von Interesse zu testen.
Die meisten Studien zur Arzneimittelentwicklung gegen Mab basieren auf einem Goldstandard, der die In-vitro-Aktivität eines Wirkstoffs gegen Mykobakterien bewertet - koloniebildende Einheiten, die7 zählen. Trotz seiner Genauigkeit ist dieses Verfahren extrem zeitaufwändig und wird schnell undurchführbar, wenn jemand Bibliotheken mit Tausenden von Verbindungen testen möchte. Zu diesem Zweck wurden Hochdurchsatz-Screenings (HTS) in die Arzneimittelentwicklung integriert - robuste Assays, die die Vorteile von Robotik und Liquid-Handling-Geräten nutzen und es ermöglichen, Tausende von Verbindungen schnell parallel zu screenen8. Dies geschieht in der Regel durch das Testen einer einzelnen Konzentration zunächst unter Verwendung von Mikrotiterplatten in den Formaten 96, 384, 1536 oder 3456 Wells, die als Ausgangspunkt für die Identifizierung von Treffern und deren weitere Optimierung in der Pipeline für den klinischen Einsatz dienen.
Reporterbasierte Assays bieten aufgrund ihrer Einfachheit und Sensitivität im Vergleich zu anderen farbstoff- und absorptionsbasierten Assays einen signifikanten Vorteil für die Robustheit von HTS 7,9. Unseres Wissens nach haben jedoch nur wenige Studien ein Hochdurchsatz-Screening gegen Mab9 optimiert.
Vor kurzem hat unser Labor Doppelreporterstämme entwickelt, die in der Lage sind, gleichzeitig Lumineszenz und Fluoreszenz10 zu emittieren. Mab operon_mScarlet ist eine dieser Sorten. Es ist autolumineszierend aufgrund der Expression des LuxABCDE-Operons , das eine bakterielle Luciferase (durch Expression der luxAB-Gene ) und ein langkettiges Aldehydsubstrat (durch Expression der luxCDE-Gene ) umfasst. Auf der anderen Seite wird die Fluoreszenzauslesung durch die Expression eines kürzlich entwickelten rot fluoreszierenden Proteins, mScarlet, erreicht, das die typischerweise verwendeten eGFP- und mCherry-Proteine übertrifft und ein stärkeres Signal liefert11. Die Verwendung dieses Stammes ermöglicht es uns, die Lebensfähigkeit von Bakterien in Flüssigkulturen zu beurteilen, indem wir das Lumineszenzsignal in einem Mikroplatten-Reader messen, ohne Reagenzien hinzuzufügen oder zusätzliche Schritte durchzuführen. Was die Detektion betrifft, so ermöglicht die intrinsische Fluoreszenz die mikroskopische Visualisierung in lebenden oder fixierten Zellen ohne den Einsatz von Farbstoffen oder Antikörpern. Die Tatsache, dass ein einziger Stamm mit beiden Messwerten vorhanden ist, bietet Forschern einen erheblichen Vorteil bei der Verwendung in HTS-Assays - die geringere Variabilität zwischen Assays mit unterschiedlichen Messwerten, da es nicht erforderlich ist, Stämme basierend auf der Art des Assays auszutauschen.
Daher wurde in dieser Arbeit ein Hochdurchsatz-Assay gegen Mab unter Verwendung eines selbst entwickelten Doppelreporterstamms entwickelt (Abbildung 1). Dies ermöglichte eine schnelle Bewertung der In-vitro-Aktivität 1280 Arzneimittel, die für die Wiederverwendung bestimmt waren, mit Hilfe einer kommerziellen Bibliothek (siehe Materialtabelle). Zum einen wurden die Aktivitäten in einem Bouillonkultur-Assay mittels Lumineszenz bewertet, zum anderen durch die Verwendung von Mab-infizierten Makrophagen, die sich das Fluoreszenzsignal zunutze machten, um den in vivo beobachteten Infektionsprozess besser zu emulieren 12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Grafische Zusammenfassung des etablierten Protokolls. Der Hauptakteur in diesem Screening ist ein selbst entwickelter Doppelreporter-Mykobakterienstamm, der in allen Experimenten verwendet wird. Zunächst wird mit einem Reagenzienspender und planktonischen Bakterien ein erstes Screening durchgeführt, indem die Verbindungen in einer einzigen Konzentration getestet werden. Die identifizierten Treffer werden in den Validierungsassay übernommen, bei dem drei verschiedene Konzentrationen getestet werden. Beide Experimente werden mit Hilfe der Lumineszenzanzeige durchgeführt. Die validierten Treffer werden in den Infektionstest übertragen, wo ebenfalls drei verschiedene Konzentrationen getestet werden und aus dem Knochenmark stammende Makrophagen bei MOI 1 infiziert werden. Ein High-Content-Bildgebungssystem erfasst das bakterielle Fluoreszenzsignal, und eine Analysesoftware wird verwendet, um die intrazelluläre Last anhand der Mycoload-Formel zu beurteilen. Die Anzahl der Verbindungen nimmt mit zunehmender Komplexität des Assays ab. Erstellt mit BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>10% neutrales gepuffertes Formalin</td><td>Bio Optica</td><td>05-01005Q</td><td>Fixierlösung</td></tr><tr><td>384-Well, schwarzes Polypropylen mit rundem Boden, unbehandelte Mikroplatte</td><td>Corning</td><td>3658</td><td>Weiße Mikrotiterplatten können verwendet werden; Polystyrol kann verwendet werden</td></tr><tr><td>50 TS Waschmaschine</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy Dichtungsmembran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Zelle:: explorer</td><td>Revvity</td><td></td><td>Equipment Handling Roboter</td></tr><tr><td>Clarithromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3487-100MG</td><td>Gelöst in DMSO auf die gewünschte Konzentration</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/4121/PB15</td><td>In flüssigem Wachstumsmedium auf die gewünschte Konzentration verdünnen</td></tr><tr><td>Harmony 5.1</td><td>Drehzahlanalysesoftware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 Inkubator, 165 L</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Zellinkubator</td></tr><tr><td>JANUS mit 4 Spitzenarmen und MDT Arm</td><td>Revvity</td><td></td><td>Liquid Handler</td></tr><tr><td>KB 8182</td><td>Termaks</td><td></td><td>Inkubator mit Rührwerk</td></tr><tr><td>Libra S4+</td><td>Biochrom Multidrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kombi-Reagenzienspender</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opera Phenix Plus</td><td>Revvity</td><td></td><td>Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>PhenoPlate</td><td>Revvity</td><td>6055302</td><td>Notwendig für High-Content-Mikroskope</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) 1x</td><td>NA</td><td></td><td>NA Waschlösung</td></tr><tr><td>Prestwick Chemische Bibliotheken&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Kommerzielle chemische Bibliothek für die Wiederverwendung von Arzneimitteln</td></tr><tr><td>Schüttel-Inkubator 3031</td><td>GFL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VICTOR Nivo</td><td>Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturmedium:</td><td></td><td></td><td>Bei Bedarf 10% des Nahrungsergänzungsmittels</td></tr><tr><td>hinzufügen DMEM</td><td>Gibco</td><td>10938-025</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Pufferlösung (1 m)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>LCCM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Konditioniertes Medium aus der L929-Zelllinie, das den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) freisetzt; Ergänzung des Zellkulturmediums</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat 100 mM (100X)</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Infection Waschlösung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apirogenes Wasser</td><td></td><td></td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution 10x</td><td>Gibco</td><td>14060-040</td><td>Verdünnen auf 1x mit apirogenes Wasser</td></tr><tr><td><stark>Permeabilisierende Lösung</td><td></td><td></td><td>PBS mit 0,1% Triton X100</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Andere Hersteller verfügbar</td></tr><tr><td>Färbelösung</td><td></td><td></td><td>PBS mit DAPI (500 ng/mL) und HCS Far Red (10 ng/mL)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>HCS Far Red&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>H32721</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar</td></tr><tr><td><stark>Flüssiges Wachstumsmedium</stark></td><td></td><td></td><td>Bei Bedarf 10% Zusatz hinzufügen</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Bouillon</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td>0,05% Endkonzentration. Andere Lieferanten verfügbar</td></tr><tr><td><stark>Flüssiges Wachstumsmedium Ergänzung:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose wasserfrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0450/60</td><td></td></tr></tbody></table>

assay-entwicklung für das hochdurchsatz-wirkstoffscreening gegen mykobakterien

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Bewertung des Faktors Z' Abbildung 2 zeigt die Daten von einem von zwei Experimenten, die zur Berechnung des Z'-Faktors durchgeführt wurden. Die Positivkontrolle war Clarithromycin mit 4 μg/ml. Beide Experimente ergaben Z'-Faktoren von 0,64 und 0,62, was bedeutet, dass die Bedingungen und Messwerte, die für diesen Assay verwendet wurden, auf den folgenden Screening-Assay angewendet werden können (Z' &gt; 0,5). Nichtsdestotrotz wurde der Z'-Faktor für alle verbleibenden Experimente berechnet (Infektionsassay), um die Leistung jedes Experiments zu kontrollieren.
Als Proof of Concept des entwickelten HTS-Assays wurde eine Bibliothek von Verbindungen getestet, die für die Wiederverwendung von Medikamenten bestimmt sind. Es besteht aus 1280 verschiedenen und kleinen Molekülen, von denen 95 % sowohl von der FDA als auch von der EMA zugelassene Medikamente sind. Diese Moleküle bieten eine hohe chemische und pharmakologische Diversität.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig02.jpg"> Abbildung 2: Ergebnisse der Z'-Faktorenbewertung. Mab bei 2,5 x 105 KBE/ml wurde mit und ohne Clarithromycin bei 4 μg/ml für 48 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde die Lumineszenz gemessen, um die Lebensfähigkeit der Mykobakterien zu bewerten. Die Grafik zeigt die individuellen Lumineszenzwerte von behandelten und unbehandelten lebensfähigen Mykobakterien in einem unabhängigen Experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Bibliotheks-Screening auf Treffer Alle Verbindungen wurden bei 6,66 μM gegen Mab getestet. Aufgrund der Größe der Bibliothek wurden die Verbindungen in vier verschiedene Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen aufgeteilt (Abbildung 3A-D). Die Ergebnisse wurden sowohl für das Lösungsmittel als auch für den verifizierten Kanteneffekt normalisiert.
In diesem Screening-Assay wurden dreiunddreißig Treffer identifiziert, von denen dreißig die Lumineszenzemission signifikant verringerten, was die Lebensfähigkeit der Mykobakterien verringerte (Abbildung 3). Interessanterweise führten drei Verbindungen zu einer höheren Lumineszenzemission, die möglicherweise mit einem erhöhten bakteriellen Stoffwechsel oder einer erhöhten bakteriellen Proliferation zusammenhängt (Abbildung 3). Alle 33 Treffer wurden in den Validierungsassay übertragen, einschließlich der drei Verbindungen, die die Lumineszenz erhöhten, um zu testen, ob dieses Profil beibehalten werden würde.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig03.jpg"> Abbildung 3: Ergebnisse des Bibliotheksscreenings. (A-D) Mab bei 2,5 x 105 KBE/ml wurde mit 1280 Verbindungen bei 6,66 μM für 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Lumineszenz gemessen, um die Lebensfähigkeit der Mykobakterien zu bewerten. Die Diagramme zeigen die RLU eines unabhängigen Experiments, dargestellt als beliebige Einheiten nach der Normalisierung des Lösungsmittels und des Kanteneffekts. Die AVG RLU und die entsprechende SD wurden für jede Platte berechnet, um einen Schwellenwert (in grau; AVG ± 3SD). Runde Symbole stellen eine getestete Verbindung dar. In Blau wird jede Verbindung außerhalb dieses Schwellenwerts als Treffer gewertet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Hit-Validierungs-Assay Die für diesen Assay verwendeten Konzentrationen betrugen 13,3 μM, 6,66 μM und 3,3 μM. Jede Verbindung wurde doppelt getestet, um die Robustheit zu erhöhen.
Wichtig ist, dass die Verbindungen 30, 31 und 32, die zuvor mit einer höheren RLU assoziiert waren (Abbildung 3A, C), dieses Profil beibehielten, wobei mehr als 200 % der mykobakteriellen Lebensfähigkeit in Vertiefungen erreicht wurden, die mit Verbindung 32 behandelt wurden (Abbildung 4).
Die Verbindungen 20 und 33 wurden als inaktiv eingestuft, da die Lebensfähigkeit der Mykobakterien in allen getesteten Konzentrationen bei nahezu 100 % liegt (Abbildung 4).
Die Verbindungen 9 und 21 zeigten bei den beiden niedrigsten Konzentrationen eine ähnliche Inaktivität; Im Gegensatz zu 20 bleiben sie jedoch bei der höchsten Konzentration von 13,3 μM aktiv, wobei die Verbindung 21 eine höhere Wirksamkeit aufweist (Abbildung 4).
Verbindung 3 zeigt ebenfalls Inaktivität bei der niedrigsten Konzentration und einen Aktivitätsverlust bei 6,66 μM, wenn auch weniger als Verbindung 21 (Abbildung 4). Nur in der niedrigsten Konzentration zeigten die Verbindungen 2, 7, 8, 10, 16, 18, 24 und 28 ein geringeres therapeutisches Potenzial. 2, 10 und 28 führen jedoch immer noch zu &lt;50 % der Lebensfähigkeit der Mykobakterien.
Weltweit waren die restlichen vierzehn Verbindungen in allen getesteten Konzentrationen aktiv.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig04.jpg"> Abbildung 4: Ergebnisse des Hit-Validierungsassays. Mab bei 2,5 x 105 KBE/ml wurde inkubiert, wobei jeder zuvor identifizierte Treffer bei 13,3 μM, 6,66 μM und 3,3 μM (1,3 %, 0,7 % bzw. 0,3 % des DMSO) für 48 Stunden bei 37 °C erfolgte. Nach der Inkubationszeit wurde die Lumineszenz gemessen, um die Lebensfähigkeit der Mykobakterien zu bewerten. Das Diagramm zeigt den prozentualen Anteil der behandelten lebensfähigen Mykobakterien im Vergleich zu den unbehandelten Mykobakterien eines unabhängigen Experiments, wobei jede Verbindung in doppelter Ausführung getestet wurde. Runde Symbole stellen die Duplikate für jede Verbindung dar. Balken stellen den Durchschnitt dieser Duplikate dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Infektions-Assay Von dreiunddreißig getesteten Verbindungen wurden achtundzwanzig für den Infektionstest ausgewählt (Abbildung 4). Die Verbindungen 7, 8, 9, 20 und 33 wurden für diesen Assay nicht ausgewählt. Während 9, 20 und 33 bei der Validierung aufgrund ihrer Inaktivität nicht berücksichtigt wurden (Abbildung 4), wurden die ersten beiden aus technischen Gründen nicht berücksichtigt. Nichtsdestotrotz wurden diese Verbindungen als Rifampicin und Linezolid identifiziert, Antibiotika, die bereits zur Behandlung von Mab-Infektionen eingesetzt werden12. Alle im Infektionstest getesteten Verbindungen wurden identifiziert und sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die antimikrobielle Aktivität der Verbindungen gegen Mab-infizierte Makrophagen wurde anhand der intrinsischen Fluoreszenz der Bakterien bewertet.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Verbindung</td>
			<td>Name</td>
			<td>Verbindung</td>
			<td>Name</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Sulfathiazol</td>
			<td>18</td>
			<td>Cefuroxim</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>19</td>
			<td>Rifaximin</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>Cefotaxim</td>
			<td>21</td>
			<td>Cefdinir</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>22</td>
			<td>Clarithromycin</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>23</td>
			<td>Besifloxacin</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>Thiostrepton</td>
			<td>24</td>
			<td>Levofloxacin</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>Amikacin</td>
			<td>25</td>
			<td>Rifabutin</td>
		</tr><tr><td>11</td>
			<td>Moxalactam</td>
			<td>26</td>
			<td>Gatifloxacin</td>
		</tr><tr><td>12</td>
			<td>Sulfamethizol</td>
			<td>27</td>
			<td>Epirubicin</td>
		</tr><tr><td>13</td>
			<td>Sulfamonomethoxin</td>
			<td>28</td>
			<td>Pyrvinium-Pamoat</td>
		</tr><tr><td>14</td>
			<td>Cefoxitin</td>
			<td>29</td>
			<td>Moxifloxacin</td>
		</tr><tr><td>15</td>
			<td>Novobiocin</td>
			<td>30</td>
			<td>Troleandomycin</td>
		</tr><tr><td>16</td>
			<td>Cefmetazol</td>
			<td>31</td>
			<td>Lincomycin</td>
		</tr><tr><td>17</td>
			<td>Roxithromycin</td>
			<td>32</td>
			<td>Spiramycin</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Liste der im Infektionstest getesteten Verbindungen. Die in Schritt 4 validierten Verbindungen wurden im Infektionsassay (Schritt 5) getestet.
Die Toxizität der Verbindungen gegenüber Mab-infizierten Makrophagen war der erste Parameter, der bewertet wurde. Der Schwellenwert, um eine Verbindung als toxisch oder nicht toxisch einzustufen, lag bei 85 % der lebensfähigen Makrophagen (Abbildung 5). Von den achtundzwanzig getesteten Verbindungen wurden 4, 5, 6, 27 und 28 als giftig eingestuft. (Abbildung 5). Daher wurden diese fünf Verbindungen von der folgenden Bewertung der intramakrophagischen Aktivität ausgeschlossen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig05.jpg"> Abbildung 5: Toxizität der Treffer gegenüber Mab-infizierten Makrophagen. BALB/c-Mäuse BMMs wurden mit Mab (MOI=1) infiziert und mit jedem zuvor identifizierten Treffer bei 13,3 μM, 6,66 μM und 3,3 μM (1,3 %, 0,7 % bzw. 0,3 % DMSO) für 48 Stunden bei 37 °C mit 7 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden in einem High-Content-Screening-Fluoreszenzmikroskop abgebildet, wobei die Anzahl der Kerne (mit DAPI gefärbt) verwendet wurde, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen. Die Grafik zeigt den prozentualen Anteil lebensfähiger behandelter infizierter Makrophagen im Verhältnis zu den lebensfähigen, unbehandelten infizierten Makrophagen von zwei unabhängigen Experimenten. Runde Symbole stellen die Lebensfähigkeit der Zelle für jeden Assay dar. Die Balken stellen den Durchschnitt von zwei unabhängigen Experimenten dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um die intramakrophagische Aktivität der verbleibenden dreiundzwanzig Verbindungen gegen intrazellulären Mab (Abbildung 6) abzuleiten, wurde die Mycoload-Formel (zuvor in Schritt 6 erläutert) verwendet, um den Prozentsatz der mykobakteriellen Lebensfähigkeit zu erhalten, der auf unbehandelte infizierte Makrophagen normalisiert wurde. Die meisten Verbindungen verloren ihr therapeutisches Potenzial gegen internalisierte Mykobakterien (Abbildung 6) im Vergleich zum Hit-Validierungsassay (Abbildung 4), da die Anzahl der Treffer bei der höchsten getesteten Konzentration von fünfundzwanzig auf sechs reduziert wurde. Auffallend ist, dass alle drei Verbindungen, die die Lebensfähigkeit von planktonischem Mab im Vergleich zu unbehandelten Bakterien erhöhten (30, 31 und 32; Abbildung 3 und Abbildung 4) zeigten eine antimykobakterielle Aktivität gegen intrazelluläres Mab, wobei die Verbindungen 30 und 32 einen signifikanten statistischen Unterschied im Vergleich zu DMSO darstellten, selbst bei 3,3 μM im Fall von Verbindung 32 (Abbildung 6). Mykobakterien, die mit den Verbindungen 11 und 23 behandelt wurden, zeigten bei 13,3 μM eine Lebensfähigkeit von &lt;50 %; dies unterschied sich jedoch nicht signifikant von der DMSO-Kontrolle (Abbildung 6). Die Verbindungen 21, 26 und 29 waren bei 13,3 μM stark genug, um einen signifikanten statistischen Unterschied zu rechtfertigen, wobei 29 am aktivsten war (Abbildung 6). Schließlich waren die Verbindungen 17, 22 und 25 in allen getesteten Konzentrationen extrem wirksam gegen internalisierte Mykobakterien. Diese wurden als Roxithromycin, Clarithromycin bzw. Rifabutin identifiziert (Tabelle 1). Von den drei Verbindungen war Clarithromycin am aktivsten gegen Mab, wobei die Lebensfähigkeit der Mykobakterien nie über 10 % stieg und in allen getesteten Konzentrationen einen p-Wert von &lt;0,0001 im Vergleich zu DMSO darstellte (Abbildung 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig06.jpg"> Abbildung 6: Intramakrophagische Aktivität der Treffer gegen Mab-infizierte Makrophagen. BALB/c-Mäuse BMMs wurden mit Mab (MOI=1) infiziert und mit jedem zuvor identifizierten Treffer bei 13,3, 6,66 bzw. 3,3 μM (1,3, 0,7 bzw. 0,3 % DMSO) für 48 Stunden bei 37 °C mit 7 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden in einem High-Content-Screening-Fluoreszenzmikroskop abgebildet und das Fluoreszenzsignal zur Berechnung des Mycoload verwendet (siehe Schritt 6). Die Grafik zeigt den prozentualen Anteil der Mycoload, die in behandelten infizierten Makrophagen gefunden wurde, im Vergleich zu unbehandelten infizierten Makrophagen in zwei unabhängigen Experimenten. Die Statistik wurde unter Verwendung einer bidirektionalen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnet durchgeführt. *, S. &lt; 0,05; **, S. &lt; 0,01; , S. &lt; 0,001; , p &lt; 0,0001 im Vergleich zu DMSO (Solvent Control). Sternchen folgen für jede Konzentration dem gleichen Farbcode wie die Legende des Diagramms. Runde Symbole stellen das Mycoload für jeden Assay dar. Die Balken stellen den Durchschnitt von zwei unabhängigen Experimenten dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Beispiel für ein 384-Well-Plattenlayout, das bei der Z'-Faktor-Bewertung verwendet wird. Weiß - Blank Wells (nur flüssiges Wachstumsmedium); gelb - Positivkontrolle (Bakterien, die mit einem Antibiotikum behandelt wurden); Rot - Negativkontrolle (unbehandelte Bakterien). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Beispiel für ein 384-Well-Plattenlayout, das im Bibliotheksscreening verwendet wird. Weiß - Blank Wells (nur flüssiges Wachstumsmedium); grün - Lösungsmittelkontrolle; rot - Negativkontrolle (unbehandelte Bakterien); blau - Verbindungen, die gesiebt werden sollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 3: Beispiel für ein 384-Well-Plattenlayout, das für die Treffervalidierung verwendet wird. Weiß - Blank Wells (nur flüssiges Wachstumsmedium); grün - Lösungsmittelkontrolle (in Duplikaten); rot - Negativkontrolle (unbehandelte Bakterien); blau - Verbindungen, die gesiebt werden sollen (in Duplikaten). Verblasste Farben stellen serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:2 dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 4: Beispiel für ein 96-Well-Plattenlayout, das für einen Infektionsassay verwendet wird. Weiß - leere Vertiefungen (Wasser, um Verdunstung zu verhindern); rot - Negativkontrolle (unbehandelte Makrophagen); gelb - Positivkontrolle (Makrophagen, die mit einem Antibiotikum behandelt wurden); grün - Lösungsmittelkontrolle; blau - zu prüfende Verbindungen. Verblasste Farben stellen serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:2 dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 5: Bildanalyseprotokoll. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll der Bildanalyse verwendet, das an Open-Source-Software angepasst werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%205.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

assay-development-for-high-throughput-drug-screening-against

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt einen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Infektionen. Es wird ein in vitro Infektionsmodell mit Mtb/Makrophagen-Aggregaten erstellt, das eine in vivo Infektion nachahmt. Bei der Einführung geeigneter Antibiotika wird deren Wirksamkeit mittels Resuzarin-Assay getestet, um das Überleben von Bakterien mit steigenden Wirkstoffkonzentrationen zu überwachen.

Ein Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen ein Mycobacterium tuberculosis-Infektionsmodell

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Neue Modelle und Assays, die den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente der nächsten Generation verbessern würden, sind sehr wünschenswert. Hier beschreiben wir einen schnellen, kostengünstigen und BSL-2-kompatiblen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis, der leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden kann.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Drei Assays, einschließlich des zytopathischen Effekts (CPE)-basierte Assays, Dosis-Wirkungs-Assay und Time-of-Addition (TOA)-Assay entwickelt, optimiert, validiert und genutzt, um neue antivirale Mittel gegen Blauzungenvirus (BTV) zu identifizieren, sowie um den möglichen Mechanismus-of-Aktion (MoA) für neu identifizierten antiviralen Medikamenten zu bestimmen.

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

In-vitro-Assays zur Messung der Virusreplikation wurde durch die Entwicklung von rekombinanten RNA-Viren Luciferase oder andere Enzyme, die Biolumineszenz exprimieren verbessert. Hier werden wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die solche rekombinante Stämme von Masern-und Chikungunya-Viren, um Breitspektrum antiviralen Medikamenten aus chemischen Bibliotheken zu isolieren verbindet.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

Hier beschreiben wir zelluläre Zytotoxizität und einzigen Runde Infektiosität Assays, die für die schnelle und genaue Überprüfung von Verbindungen zu erlauben, ihre zelluläre Zytotoxizität (CC 50) zu ermitteln und IC 50-Werte gegen WT-und arzneimittelresistente HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-qRT-PCR-Assay für die Analyse von Typ I und III IFN-Expressionssignaturen. Der Assay unterscheidet Unterschiede zwischen einzelnen Basenpaaren zwischen den sehr ähnlichen Transkripten dieser Gene. Durch die Chargenmontage und das robotergestützte Pipettieren sind die Assays konsistent und reproduzierbar.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Erfahren Sie die Entwicklung eines Hochdurchsatz-Screenings für Mycobacterium abscessus mit doppelten Reporterstämmen. Diese Methode beschleunigt die Arzneimittelforschung gegen resistente Bakterien erheblich.

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

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