Name: Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Lernen Sie die zuverlässige Detektion von IgE-produzierenden Maus-B-Zellen durch Trypsin-Behandlung und intrazelluläre Färbung. Diese Methode ermöglicht präzise Durchflusszytometrie-Analysen.

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DRW wird durch NIH Zuschüsse AI089972 und AI113217 und durch die Mukosaimmunologie Studies-Team unterstützt, und hat einen Career Award für medizinische Wissenschaftler der Burroughs Wellcome Fund.

HINWEIS: Alle hier beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien und von Tierforschung Kinderkrankenhaus (ARCH), Boston, Mass zugelassen. 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> 1,000x IL-4 Stock: Verdünnen IL-4 Cytokins an 20 ug / ml in H 2 O oder 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). Dispense in 200 ul Aliquots in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C. </li><li> 1,000x anti-CD40: Beziehen des Herstellers bei 1,0 mg / ml, Lagerung bei 4 ° C. </li><li> B-Zell-Stimulation Mittel: Auf 425 ml RPMI-1640-Medium, fügen Sie 75 ml frisch aufgetauten fötalem Kälberserum (FCS), 10 ml 1,0 M HEPES-Puffer, 5 ml L-Glutamin Lager, 5 ml Penicillin: Streptomycin Lager, 5 ml Minimum Essential Medium nicht essentiellen Aminosäuren (MEM-NEAA) und 3,5 ul 2-Mercaptoethanol. Lagern Sie Druckmaterial bei 4 ° C für bis zu einer Woche. Hinzufügen IL-4 (20 ng / ml) und Anti-CD40 (1.0 ug / ml) unmittelbar vor der Anwendungnur auf das Volumen des benötigten Medien. </li><li> 2% FCS-FACS-Puffer: 10 ml FCS bis 490 ml 1x PBS. Halten bei 4 ° C. </li><li> 2x Trypsin-EDTA-Lösung: 5 ml der 10fach Trypsin-EDTA-Stammlösung (5,0 g Trypsin, 2,0 g EDTA pro Liter) in 20 ml 1 × PBS. Speicher Trypsin-EDTA in 2x Arbeits Aliquots bei 4 ° C. Ermöglichen, sich auf Raumtemperatur gebracht werden. </li><li> Fötalem Kälberserum: Halten aufgetauten FCS bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen. Zeigen auf Eis 15 min vor der zytoplasmatischen Färbungsverfahren. </li><li> Neutral-Formalin: Eine 10% ige Formalin-Lösung (3,7% Paraformaldehyd). Formalin ist giftig und daher behandeln es unter einem Laborabzug beim Tragen geeigneter PSA. Shop Formalin bei Raumtemperatur in einer chemischen Speicherschrank. </li><li> Methanol: Shop absolutem Methanol (100%) bei -20 ° C, bis die Zellen bereit sind, durchlässig gemacht werden. Beachten Sie, dass Methanol ist brennbar und sollte in einem angemessenen Gefrierschrank gelagert werden. </li></ol> 2.Reinigung und Aktivierung von B-Zellen <ol><li> Von einem frisch geerntet Mäusemilz, bereiten eine Einzelzellsuspension durch leichtes Eindrücken der Orgel durch eine 70 um Zellsieb mit dem Kolben eines 3-ml-Spritze. In ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen sammeln Zellen in 10 ml 1x PBS und Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren Sie den Überstand und Pellet in 1 ml Rotes Blutkörperchen Lysepuffer für 5 min. Neutralisieren mit 13,5 ml 1 × PBS und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. </li><li> (Optional) magnetisches Trennen der B-Zellen mit anti-CD45R (B220) -markierten Kügelchen nach der MACS Reinigungsprotokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Stimulieren gereinigte B-Zellen mit 1,0 × 10 6 Zellen / ml in erwärmt B-Zell-Stimulation Medien, die IL-4 (20 ng / ml) und Anti-CD40 (1.0 ug / ml) für 5 Tage bei 37 ° C. Beginnen Sie mit 8 ml der Kultur in 2 Vertiefungen einer 6-Well-Kulturplatte (je 4 ml) aufgeteilt. </li><li> Überprüfen cultuWieder täglich mit 1,0 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten. Die Konzentration ist anzupassen durch Aufteilen in andere Vertiefungen und mit B-Zell-Stimulationsmittel mit frischem IL-4 und anti-CD40 Verdünnen der Kultur. </li></ol> 3. Trypsinisierung, Fixierung und Permeabilisierung <ol><li> Trypsinierung <ol><li> Sammeln von bis zu 1,0 x 10 7 kultivierten Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen, Zentrifuge bei 300 × g für 5 Minuten und dekantiert den Überstand. </li><li> Waschen mit 10 ml PBS, um die Rest Proteins aus der Zelle Mappen Medien zu entfernen. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und dekantiert die überstehende. </li><li> Zellpellet in dem Restvolumen nach dem Dekantieren (etwa 100 ul). </li><li> 800 ul der Raumtemperatur 0,1% (2x) Trypsin-EDTA sorgfältig in den Zellen. Verzichtet werden langsam in einem Winkel von 45 ° an der Seite des konischen Rohrs. </li><li> Die Tube und vorsichtig durch Kippen des Rohrs, so dass die Flüssigkeit entlang der Länge des Rohres 5-6 Zeit abläufts. Eine fadenziehende, weiße Niederschlag in der Lösung zu bilden. Begrenzen Sie die Zeit, um Trypsinisierung unter min. </li><li> Quenche die Trypsinisierung Reaktion mit 1 ml kaltem FCS. Verdünne das FCS sofort durch Zugabe von 10 ml kaltem PBS gewaschen. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C, dann dekantiert und die Röhrchen zurück zu Eis. </li></ol></li><li> Fixierung <ol><li> Resuspendieren der Zellen in dem Restvolumen nach dem Dekantieren. Falls erforderlich, bringen Volumen von bis zu 100 &amp; mgr; l mit kaltem PBS. </li><li> In einer Abzugshaube, fügen Sie 800 ul von 10% neutral gepuffertem Formalin-Lösung zu den Zellen und pipettieren auf und ab. Das Rohr wird durch die Zugabe von Formalin zu erwärmen. Bei 37 ° C für 10 min. </li></ol></li><li> Permeabilisierung <ol><li> Richten Sie eine Tisch Vortex-Mischer in einem leichtem Schütteln Geschwindigkeit. </li><li> Zeichnen 9 ml kaltem (-20 ° C) Methanol in einen 10 ml serologische Pipette. </li><li> Halten Sie das Röhrchen mit den Zellen über die Vortex-Mischer und sanft starten Shaking die Zellen. </li><li> Kaltes Methanol zu dem Rohr so ​​dass es auf den Zellen tropfenweise fällt, während das Rohr noch Schütteln, so dass das Methanol kontinuierlich gemischt. Nach den ersten 2 ml Methanol kann die Abgabegeschwindigkeit zu einem langsamen Strom erhöht werden. </li><li> Lassen Sie den Schlauch sitzen auf Eis für 30 min, um die Permeabilisierung abzuschließen. Alternativ können die Zellen bei -20 ° C für bis zu einem Monat gelagert werden. </li></ol></li></ol> 4. Fluoreszenzfärbung für IgG1 und IgE Class Switching <ol><li> Centrifuge Probe bei 300 xg für 5 min und dekantiert die Methanollösung. Ein weißer Niederschlag kann mit den Zellen zu pelletieren. </li><li> 10 ml Raumtemperatur 1x PBS und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min, um Zellen zu waschen. Wiederholen Sie einmal. Hinweis: Das Waschen des Pellets mit Raumtemperatur PBS löst zusätzliche Niederschlag, der nach dem Schritt 4.1 bilden kann. </li><li> Führen Sie eine weitere Waschung mit 10 ml 2% FCS-FACS-Puffer. </li><li> Verteilen Proben in eine 96-Well-Rundbodenplatteund Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Dekantieren und stellte den Teller auf dem Eis. </li><li> Stain in 60 ul 2% FCS-FACS-Puffer pro Vertiefung mit folgenden Antikörperverdünnungen: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200 Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE-FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220), PerCP-Cy5.5, 1: 200 </li><li> Nach 5 min Färbung, waschen der Platte mit 150 ul 2% FCS-FACS-Puffer und Zentrifuge 5 min bei 300 x g. </li><li> Resuspendieren in 400 ul 2% FCS-FACS-Puffer und Pipette durch ein 40 um Nylon Zellsieb in ein 5 ml FACS-Röhrchen. </li></ol> 5. Verwenden Sie die folgenden Gating-Strategie: <ol><li> Isolieren CD45R (B220) positive Zellen aus dem Spreng Lymphozyten-Population auf der FSC / SSC Plot (Abbildung 1) befindet. </li><li> Von der B220-positiven Zellen, verwenden Sie die IgE und IgG1 Grundstück, um die entsprechenden Populationen zu offenbaren. </li></ol>

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<li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE%28%2B%29+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li>
<li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE%28%2B%29+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren machen keine Angaben.

Stimulation von Maus-Milz-B-Zellen in Kultur mit Anti-CD40 und IL-4 wird T-Helfer Typ 2 (TH 2) Wechselwirkungen, ermutigend Klassenumschaltzeit IgG1 und IgE 5 simulieren. B-Zellen können für CSR im Rahmen der Gesamt Splenozyten 12 oder als gereinigte Milz-B-Zellen, 11 aktiviert werden. Wie in dem Protokoll (Schritt 2.3) angemerkt, ist B-Zell-Anreicherung optional, und liegt im Ermessen des Experimentators, ob es von Vorteil, zu ermitteln. Positive magnetische Trennung von B-Ze...

Während der schweren Immunglobulinkette (IgH) Klassenwechsel-Rekombination (CSR) in Mäusen und Menschen, μ die IgH Exons der konstanten Region (C &amp; mgr;) gelöscht und durch eine von mehreren Sätzen von nachgeschalteten Exons der konstanten Region (C H s) (z Cy ersetzt, C &amp; egr; und C &amp; alpha;), was zu einem Wechsel von der Herstellung von IgM auf die Herstellung von anderen Ig-Klassen (beispielsweise IgG, IgE oder IgA). CSR tritt innerhalb Schalter (S) Regionen, die 1-10 kb-Sequenzen, die 5 &#39;an jeden Satz von C H s 1 sind. Die Aktivierungs-induzierte Cytidindeaminase (AID) Enzym initiiert CSR über Cytidin Desaminierung Aktivität. IgE ist ein wichtiger Mediator der allergischen Erkrankung 2 und ein besseres Verständnis dafür, wie IgE produziert und reguliert kann Türen zu neuen Therapieansätzen zu atopischen Erkrankung zu öffnen. In Mäusen und Menschen, ist die IgE streng reguliert Ig Isotyp. IgE wird normalerweise in Mengen Tausende von tim erkanntes weniger als andere IgH Isotypen 3, kann jedoch stark bei Krankheitszuständen 4 erhöht werden. Jedoch CSR an IgE ist nicht vollständig verstanden. In vitro-Aktivierung von B-Zellen mit IL-4 in Kombination mit entweder Anti-CD40 oder LPS induziert CSR sowohl IgG1 und IgE 5. Aktivierte B-Zellen exprimieren den niedrigen affinen IgE-Rezeptors FcεRII / CD23 2,6, die die lösliche IgE in Kultur nach CSR abgesondert bindet. Deshalb bei der Analyse mit Durchflusszytometrie, B-Zellen mit rezeptorgebundenen IgE-Färbung ähnlich wie Zellen endogen exprimierenden IgE 7b. Obwohl bekannt ist, dass die Maus-B-Zellen das geringe Affinität IgG-Rezeptor FcγRIIB1 (CD32) 8, in unserer Erfahrung ist es offenbar nicht mit der Messung der Klassenwechsel zu IgG1 stören. Allerdings, wenn die Messung IgE Schalt nach B-Zell-Aktivierung in der Kultur, nicht spezifische oberflächengebundene IgE kann die Analyse verschleiern. Mit gemeinsamen Färbeverfahren, Fleck nicht IgE-exprimierenden Zellen positiv für IgE. Hier skizziert ist eine Strategie, die verwendet worden ist, um CSR-Tests von Mäusen 9 durchführen und erkennen wahre IgE-exprimierenden Zellen, B - 11. Behandlung von aktivierten B-Zellen mit Trypsin, einem gemeinsamen Labor-Reagens, um Protein zu verdauen, entfernt sowohl cytophylic und Membran-gebundenen Oberfläche IgE. Nachfolgende Permeabilisierung und Färbung für zytoplasmatische IgE zeigt somit die wahren IgE-produzierenden Zellen.

<table><tbody><tr><td>Anti-Maus IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553415</td><td>Klon R35-72</td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550083</td><td>Klon A85-1</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>Falcon Zellsieb 40 &micro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 70 &micro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu/Mo CD45R (B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>Klon RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-Maus/Ratte CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>Klon HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) Mikrokügelchen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>MACS Aufreinigungssäule</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Rekonstitution in Wasser oder 0,1% BSA</td></tr><tr><td>Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Lösung (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5,0 g Trypsin, 2,0 g EDTA&#8226; 4 Na pro Liter 0,9 % NaCl</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10.000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x)</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Erythrozytenlysepuffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>Klon 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Calf Serum</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>B-Zell-Stimulationsmedien</td><td></td><td></td><td>B-Zell-Stimulationsmedien bestehen aus RPMI mit fötalem Kälberserum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-Glutamin, &nbsp; 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 & Mikro; g/ml), Beta-Mercaptoethanol (7 & Mikro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) und Anti-CD40 (1 & Mikro; g/ml)</td></tr></tbody></table>

der nachweis von ige-wahre exprimierenden maus b lineage cells

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B-Lymphozyten-Immunglobulin schwere Kette (IgH) Klassenwechsel-Rekombination (CSR) ist ein Verfahren, bei dem zunächst ausgedrückt IgM schaltet auf andere IgH Isotypen, wie IgA, IgE und IgG. Messung der IgH CSR in vitro ist ein Schlüsselverfahren für die Untersuchung einer Reihe von biologischen Prozessen, die von DNA-Rekombination und Reparatur, um Aspekte der molekularen und zellulären Immunologie. In vitro CSR Assay das durchflusszytometrische Meßfläche Ig-Expression auf aktivierten B-Zellen. Während Messung des IgA- und IgG-Subklassen ist einfach, ist die Messung von IgE durch dieses Verfahren problematisch aufgrund löslichen IgE-Bindung an FcεRII / CD23, das auf der Oberfläche von aktivierten B-Zellen. Hier beschreiben wir ein einzigartiges Verfahren für die genaue Messung von IgE-produzierende Maus-B-Zellen, die CSR in Kultur erfahren haben. Das Verfahren basiert auf Trypsin-vermittelten Spaltung von IgE-CD23-Komplexen auf der Zelloberfläche gehalten und erlaubt die Detektion von IgE-produzierenden B-Linie Zellen durch cytoplasmic Färbung. Dieses Verfahren bietet eine komfortable Lösung für die durchflusszytometrische Analyse von CSR an IgE.

Dieses Verfahren wurde erfolgreich durchgeführt, um CSR an IgE in Maus-B-Zellen zu untersuchen. Um die Effizienz bei der Messung CSR demonstrieren angeregt wir Maus Milz-B-Zellen mit anti-CD40 und IL-4, wie zuvor beschrieben 11. Nach fünf Tagen der Stimulation wurden die Zellen gesammelt und mit dem vorstehend beschriebenen und mit fluoreszierend markierten IgM, IgG1, IgE und B220 (CD45R) Antikörpern gefärbt Protokoll verarbeitet. An Strahl Lymphozyten (1), eine klare Population von IgE + Zel...

Die In-vitro-Analyse der Klassenschalter-Rekombination bei Mäusen ist aufgrund zytophiler IgE-Moleküle, die an Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche von B-Zellen gebunden sind, eine Herausforderung. Wir beschreiben eine Methode zur IgE-Detektion unter Verwendung der Trypsin-vermittelten Spaltung von oberflächengebundenem IgE vor der Fixierung und Permeabilisierung für die zytoplasmatische Fluoreszenzfärbung.

Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, echte IgE-exprimierende B-Zellen von B-Zellen zu unterscheiden, wobei andere IgE-Isotypen exprimierendes IgE exprimieren. Während des In-vitro-Klassenwechsels binden Assays an B-Zell-Oberflächenproteine, was die Fähigkeit verschleiert, den Klassenwechsel zu IgE zu messen. Das Ziel wird erreicht, indem zunächst rezeptorgebundene IgE-Moleküle vor der Analyse mit Hilfe von Trypsin entfernt werden, das Zelloberflächenproteine nicht spezifisch spaltet, während endogen produzierte intrazelluläre Immunglobulinmoleküle intakt bleiben.Zweitens werden intrazelluläre Proteine freigelegt, indem die B-Zellen mit Formin fixiert und die Zellen mit Methanol permiert werden. Anschließend werden die Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gefärbt, um intrazelluläre Immunglobuline freizulegen. Die Ergebnisse zeigen eine ausgeprägte IgE-positive B-Zell-Population.Wenn Trypsin auf der Grundlage einer durchflusszytometrischen Analyse verwendet wird, waren die Studien zur IgE-Biologie aufgrund der Schwierigkeit, IgE-produzierende Zellen nachzuweisen, begrenzt. Diese Methode bietet eine zugängliche Lösung, die Labore leicht übernehmen können, um unser Verständnis dieses interessanten Moleküls zu beschleunigen. Diese Technik ist vorteilhaft gegenüber bestehenden Methoden, um die Wirkung von rezeptorgebundenem IgE zu eliminieren.Zum Beispiel ist es kostengünstiger als das Blockieren von Oberflächen-IgE mit Anti-IgE-Antikörpern und fehlerverzeihender als eine Säurewaschbehandlung. Obwohl diese Methode Einblicke in die Analyse der B-Zell-Klasse der Maus geben kann, könnte die Umstellung auf eine IgE-Behandlung mit Trypsin vor der Faktenfärbung auch auf andere Protokolle angewendet werden, die die Entfernung von Oberflächenproteinen aus einer frisch geernteten Mausmilz erfordern. Bereiten Sie eine einzellige Suspension vor.Drücken Sie das Organ vorsichtig mit dem Kolben einer Drei-Milliliter-Spritze durch ein 70-Mikron-Zellsieb. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das 10 Milliliter eines XPBS enthält. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Dekantieren Sie das Supra-Nativmittel und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Lysierungspuffer für rote Blutkörperchen. Lassen Sie die Lysingreaktion fünf Minuten lang laufen, bevor Sie sie mit 13,5 Millilitern eines XPBS neutralisieren. Dann zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 300 G für fünf Minuten und suspendieren das Pellet im Restvolumen.Geben Sie nun warme B-Zell-Stimulationsmedien mit IL vier und Anti-CD 40 in die Zellen. Beginnen Sie mit einer Acht-Milliliter-Kultur, aufgeteilt in zwei Vertiefungen einer Sechs-Well-Kulturplatte, und stimulieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius über fünf Tage. Überprüfen Sie die Kultur täglich, um die Zellen bei 1 Million pro Milliliter zu halten.Passen Sie eine Konzentration an, indem Sie die Kulturen in andere Vertiefungen aufteilen und mit B-Zell-Stimulation verdünnen. Datenträger, die frisches IL four und Anti CD 40 enthalten. Beginnen Sie mit der Entnahme von bis zu 10 Millionen der stimulierten B-Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.Dann zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300 g und dekantieren den Überstand, um das restliche Protein aus dem Zellsammelmedium zu entfernen. Waschen Sie die B-Zellen mit 10 Millilitern PBS, gefolgt von einer weiteren Zentrifugation und Dekantierung der Snat. Nach dem Dekantieren suspendieren Sie das Zellpellet wieder in das Restvolumen von etwa 100 Mikrolitern und fügen Sie vorsichtig 800 Mikroliter Raumtemperatur 0,1%-Trips in EDTA hinzu. Gib die Lösung langsam entlang der Seitenwand des Schlauchs.Fügen Sie eine Steigung hinzu, verschließen Sie dann das Röhrchen und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie die Flüssigkeit über die Länge des Röhrchens laufen lassen. Fünf- bis sechsmal kann sich innerhalb einer Minute ein fadenförmiger weißer Niederschlag in der Lösung bilden. Quischen Sie die Reaktion mit einem Milliliter kaltem FCS ab.Halten Sie die Zellen auf Eis. Jetzt sind sie noch am Leben und können neue Oberflächenproteine exprimieren. Verdünnen Sie das FCS sofort, indem Sie 10 Milliliter kaltes PBS hinzufügen.Entfernen Sie alle schwimmenden Ablagerungen mit einer Pipette. Schleudern Sie die Zellen bei vier Grad Celsius herunter. Dekantieren Sie die Snat sofort und suspendieren Sie die Zellen wieder im Restvolumen.Falls erforderlich, bringen Sie das Volumen auf 100 Mikroliter mit kaltem PBS, gehen Sie schnell in einem Abzug bei 800 Mikrolitern 10% neutral gepufferter Forminpipette vor. Die Mischung beginnt sich auf und ab des Röhrchens zu erwärmen, sobald sie gemischt ist. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Fixiermittel. Stellen Sie in der Zwischenzeit einen Tisch-Wirbelmischer mit sanfter Schüttelgeschwindigkeit auf und bereiten Sie Methanol auf minus 20 Grad Celsius für den Gebrauch vor. Wenn die Zellen mit der Inkubation fertig sind.Ziehen Sie neun Milliliter Methanol in eine serologische Pipette. Dann den Deckel lösen, das Röhrchen vorsichtig durchwirbeln, während das Methanol tropfenweise hinzugefügt wird. Nach der Abgabe von zwei Millilitern Methanol wird ein langsamer Strom abtropfenweise beschleunigt.Lassen Sie die Röhre nun 30 Minuten auf Eis stehen, um die Zellen zu permieren. Alternativ können die Zellen bis zu einem Monat bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Beginnen Sie den Färbevorgang, indem Sie zuerst die Permezellen zentrifugieren und das Methanol dekantieren.Ein weißer Niederschlag kann mit den Zellen pelletieren. Waschen Sie dann die Zellen, indem Sie 10 Milliliter bei Raumtemperatur einmischen, ein XPBS-Zentrifugieren und -Dekantieren. Führen Sie diesen Waschschritt zweimal durch.Führen Sie anschließend eine zusätzliche Wäsche mit 10 Millilitern 2%FCS-Fax durch, puffern Sie es und resuspendieren Sie es. Das Pellet im Restvolumen wird die Probe in eine Vertiefung einer runden Bodenplatte mit 96 Vertiefungen geladen. Viele Proben werden in der Regel parallel verarbeitet.Laden Sie 20 bis 50 Mikroliter mit einem Plattenspinner und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g. Dann die Schlinge dekantieren und den Teller auf Eis legen. Färben Sie nun die Zellen in jede Vertiefung und fügen Sie 60 Mikroliter 2%FCS-Faxpuffer hinzu, der vier verschiedene Antikörper enthält.Lassen Sie die Zellen nach der Färbung fünf Minuten lang in der Färbung inkubieren. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 150 Mikroliter 2%FCS-Faxpufferfell hinzufügen. Zentrifugieren Sie dann die Platte wie zuvor, gefolgt von dem Dekantieren der Lösung und der Wiederbelebung der Zellen.Verwenden Sie 400 Mikroliter 2%FCS-Faxpuffer. Pipettieren Sie nun die Zellen durch ein 40-Mikron-Nylon-Zellsieb in ein Fünf-Milliliter-Faxrohr für das Fax-Gate. Die Zellen isolierten zunächst CD 45 R-positive Zellen, auch bekannt als B zwei 20 positive Zellen aus der blastenden Lymphozytenpopulation auf dem F-S-C-S-S-C-Plot und dann von den B zwei 20 positiven Zellen.Verwenden Sie das Diagramm IgE und IgG eins, um die entsprechenden Populationen mit diesem Verfahren anzuzeigen. Die Rekombination des Klassenschalters zu IgE wurde in B-Zellen der Maus unter Verwendung einer Gating-Strategie untersucht, die auf den blastenden Lymphozyten basiert. Eine klare Population von IgE-positiven Zellen konnte ohne das Trypsin der Zellen nicht sauber unterschieden werden, wobei das Trypsin vor der Fixierung und Permeation die Trennung der IgE-produzierenden Zellen aufgrund der Entfernung von oberflächengebundenem IgE ermöglichte.Diese Färbetechnik kann in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Die Arbeit mit Formalin und Methanol kann gefährlich sein. Daher sollte bei der Durchführung dieses Verfahrens immer ein Fuma verwendet werden und es sollte immer die richtige persönliche Schutzausrüstung verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Detektion und Isolation von lebensfähigen Maus IL-17-sezernierenden T-Zellen

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Entwirren Key Player der humoralen Immunität: erweiterte und optimierte Lymphozyten isoliert Protokoll von Murine Peyer Patches

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