Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieser Versuchsreihe ist es, den phakosomalen pH-Wert in lebenden Zellen mit Hilfe der ratiometrischen Fluoreszenzmikroskopie zu messen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Fressozytenbiologie zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung von Schlüsselmolekülen in Erregerinteraktionen oder die Wirkung von genetischen Störungen oder Medikamenten auf die Phagozytose. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass im Gegensatz zu populationsbasierten Methoden wie Fakten oder Spektroskopie Effekte, wie z.B. Veränderungen in der Partikelbindungsmigration, oder in der Heterogenität der einzelnen Phagosomen detektiert werden können.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf unsere Therapien gegen pathogene chemische Organismen, da viele dieser Mikroorganismen den Fragoso-pH-Wert verändern können, um eine Ablenkung innerhalb der Phagosomen zu vermeiden. Um diesen Vorgang zu starten, fügen Sie 20 Milligramm getrocknetes Xan zu 10 Millilitern sterilem PBS-Wirbel hinzu und erhitzen Sie es 10 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad. Dann abkühlen lassen und fünf Minuten lang bei 2000 g zentrifugieren.

Entfernen Sie danach den Überstand und resuspendieren Sie das Xan in einem Milliliter PBS. Beschallen Sie es 10 Minuten lang in einem Wasserbad. Anschließend werden 500 Mikroliter des resuspendierten Xans in zwei 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 11.000 g zentrifugiert.

Wiederholen Sie die Wäsche mit 500 Mikrolitern PBS. Waschen Sie das Xan dann zweimal in 500 Mikrolitern frisch zubereiteter 0,1 molare Natriumcarbonatlösung bei pH 9,3 und RESUSPENDIERT in 490 Mikrolitern Natriumcarbonatlösung nach der letzten Wäsche. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter in DMSO gelöstes FZ in einer Menge von 10 Milligramm pro Milliliter in den Xan-Wirbel

Mit Folie abdecken und unter Rühren vier Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Um das ungebundene Auge zu entfernen, waschen Sie zuerst mit 0,5 Millilitern DMSO plus 150 Mikroliter PBS, einschließlich Beschallung zwischen den Waschschritten. Anschließend mit 0,5 Millilitern DMSO plus 300 Mikroliter PBS waschen, dann mit 0,5 Millilitern DMSO plus 450 Mikroliter PBS waschen, gefolgt von PBS allein. Fügen Sie danach einen Mikroliter Xan zu 500 Mikrolitern PBS hinzu und wirbeln Sie ihn auf.

Geben Sie dann 10 Mikroliter verdünnten XMA-Sand an den Rand der Hämozytometerkammer, wo er auf das Deckglas trifft, und montieren Sie das Hämozytometer auf ein Hellfeldmikroskop, das mit einem 20-fach-Objektiv ausgestattet ist. Fokussieren Sie sich auf die obere linke Ecke mit 16 Quadraten und zählen Sie alle Weihnachtssandpartikel in diesem Bereich. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Handstrichzähler in der unteren rechten Ecke.

Berechnen Sie dann die Xan-Konzentration mit dieser Gleichung. Anschließend wird das markierte Xan mit dem tollwütigen Anti-Xan-Antikörper bei einem Verdünnungswirbel von 1 bis 100 opsonisiert und die Probe eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubiert. Zählen Sie anschließend den Weihnachtssand mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie ihn auf 100 mal 10 bis sechs Partikel pro Milliliter.

Nachdem Sie die primären Maus-Neutrophilen isoliert haben, geben Sie zweimal 10 bis 10 Neutrophile in die Mitte einer 35-Millimeter-Glasbodenschale. Verteilen Sie dann den Tropfen, indem Sie 50 Mikroliter Medium hinzufügen und fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit die Zellen haften können. Fügen Sie anschließend einen Milliliter HBSS warm auf 37 Grad Celsius hinzu, das einen Myeloperoxidase-Hemmer enthält.

Montieren Sie die Schüssel auf ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 37-Grad-Celsius-Heizsystem und einem 40-fach-Ölobjektiv ausgestattet ist. Inkubieren Sie die Zellen ohne Bildgebung für 10 Minuten, damit sich die Zellen und Geräte ausgleichen können. Passen Sie anschließend die Mikroskopeinstellungen an, um alle 30 Sekunden ein Hellfeld-Transmissionsbild mit 440 Nanometern oder 490 Nanometern Anregung und 535 Nanometern Emission aufzunehmen.

Geben Sie nach zwei Minuten 10 mal 10 zu dem sechs ized fitzy zy sand in die Mitte der Schale und fahren Sie mit der Bildgebung für 30 Minuten fort. Stoppen Sie nach 30 Minuten die Zeitrafferaufnahme und starten Sie einen Timer. Verschieben Sie den Tisch und nehmen Sie innerhalb von fünf Minuten 10 oder mehr Schnappschüsse in verschiedenen Sichtfeldern auf, um andere Vaga-Zonen abzubilden.

Bei diesem Verfahren werden die Kalibrierlösungen aufgetaut und in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius erwärmt. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät und zeichnen Sie ihn auf. Montieren Sie dann vor der Bildaufnahme eine Peristaltikpumpe auf der Glasbodenschale.

Führen Sie dann am Ende der 30-minütigen Aufnahmezeit eine Live-Videomikroskopie durch. Schalten Sie die Pumpe ein, um die Lösung aus der Schale zu entfernen. Fügen Sie anschließend einen Milliliter der ersten Kalibrierlösung hinzu und stoppen Sie die Pumpe.

Warten Sie fünf Minuten, bis sich das Signal stabilisiert hat. Wiederholen Sie den Vorgang mit jeder Kalibrierlösung. Um die Zeitrafferfilme und Phagosomen-Schnappschüsse zu analysieren, öffnen Sie die Bilder mit dem Bild J.Subtrahieren Sie den Hintergrund im 490-Kanal, indem Sie ein kleines quadratisches ROI in einem Bereich ohne Zellen zeichnen.

Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug für quadratische Polygone und klicken Sie auf Plugins. Danach die BG-Subtraktion. Laden Sie den gleichen ROI auf den 440-Kanal hoch, indem Sie auf Bearbeiten klicken.

Dann die Auswahl, gefolgt von der Wiederherstellung der Auswahl und der Wiederholung des Hintergrundsubtraktionsvorgangs. Erstellen Sie ein Bild des 490-Kanals mit einem 32-Bit-Verhältnis, dividiert durch den 440-Kanal, indem Sie zuerst auf den Vorgang klicken. Dann Bildrechner.

Wählen Sie danach die entsprechenden Bilder in den Dropdown-Menüs Bild eins und Bild zwei aus. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Operation" die Option "Dividieren" und aktivieren Sie das Kontrollkästchen "32-Bit-Ergebnis". Ändern Sie danach die Nachschlagetabelle für die Farbcodierung in eine mit dem Verhältnis kompatible Farbcodierung, indem Sie auf Bild und dann auf Tabellen nach oben klicken.

Dann Regenbogen-RGB. Legen Sie einen Schwellenwert für das Verhältnisbild fest, um Null- und Unendlichkeitspixel zu eliminieren, indem Sie auf Bild klicken. Passen Sie dann den Schwellenwert an.

Passen Sie die Bildlaufleisten so an, dass Xan rot angezeigt wird, und klicken Sie auf Übernehmen, und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Hintergrundpixel auf nan festlegen aktiviert ist. Wenn Hintergrund- und Xan-Signalwerte sehr ähnliche Verhältniswerte erzeugen, was zu einem verrauschten Verhältnisbild führt, fügen Sie dem Kanal 440 eine kleine Menge Hintergrund wieder hinzu, indem Sie auf "Verarbeiten" klicken. Dann Mathe.

Fügen Sie dann das Verhältnisbild hinzu und erstellen Sie es neu, um ein saubereres Ergebnis zu erzielen. Alternativ können Sie die 440-Kanal-Hintergrundsubtraktion weglassen. Kombinieren Sie als Nächstes diesen Verhältnisstapel mit einem Hellfeldkanal zu einem Mehrkanal-Composite, indem Sie auf Bildfarbe klicken.

dann Kanäle zusammen. Wählen Sie das Hellfeldbild im Dropdown-Menü des Graukanals und das Verhältnisbild im Dropdown-Menü des Grünkanals aus. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen Quellbilder beibehalten.

Scannen Sie anschließend die Zeitrafferfilme oder Schnappschüsse, indem Sie die Hellfeld- und Verhältniskanäle vergleichen, um zu bestimmen, welche Phagosomen analysiert werden sollen, zeichnen Sie mit dem Auswahlwerkzeug für ovale Polygone einen ROI um die Phagosomen und fügen Sie sie dem ROI-Manager hinzu, indem Sie auf Analysewerkzeuge klicken. Dann ROI-Manager, gefolgt von Hinzufügen, messen Sie anschließend ihr Xan-Intensitätsverhältnis, indem Sie auf Mehrfachmessen klicken und das Kontrollkästchen Eine Zeile pro Slice deaktivieren. Für Zeitrafferfilme.

Verfolgen Sie die FGA-Zonen nacheinander, indem Sie ein ROI-Steuerelement M zeichnen, um jeden Zeitpunkt zu messen und den ROI bei Bedarf zu verschieben, um die Intensitätswerte im Laufe der Zeit zu verfolgen. Kopieren Sie dann die Messungen aus dem Ergebnisfenster in eine Tabelle, um die Fluoreszenz in pH-Werte umzuwandeln. Nachdem Sie das Verhältnis von 490 zu 440 für Phagosomen in den Kalibrierungs-Zeitrafferfilmen in einer Tabelle gemessen haben, stellen Sie die Verhältniswerte im Zeitverlauf dar.

Berechnen Sie dann die durchschnittlichen Verhältniswerte für alle Phagosomen innerhalb des Sichtfelds zu fünf Zeitpunkten innerhalb der Mitte des Zeitraums, der jeder pH-Kalibrierlösung entspricht. Stellen Sie diese durchschnittlichen Verhältniswerte von 490 bis 440 gegen den tatsächlich gemessenen pH-Wert dar, indem Sie mindestens drei unabhängige Kalibrierungen in einem einzigen Diagramm kombinieren. Führen Sie dann eine nichtlineare Regressionsanalyse durch, um eine Gleichung zu erhalten, mit der die Verhältniswerte in den pH-Wert transformiert

Diese Abbildung zeigt, wie die Phagosomen und das aufgenommene Xan unterschieden werden. Das linke Feld zeigt ein zusammengeführtes Hellfeldbild und ein Verhältnis von 490 bis 440 Fitz zy und Ratio. Während das rechte Panel nur das Hellfeldbild zeigt.

Phagosomen können von den externen Partikeln unterschieden werden, die entweder nicht mit Zellen kolokalisieren oder deren Fluoreszenz nicht mit einem dunklen Zentrum übereinstimmt, das von einem helleren Ring umgeben ist, der für Phagosomen charakteristisch ist. Hier sind die typischen Zeitverläufe von Wildtyp- und HV CN-Ein-Knockout-Neutrophilen FGA omalem pH-Wert in den Wildtyp-Neutrophilen, die pH-Werte sind neu neutral oder leicht alkalisch zu frühen Zeitpunkten. Nach der Einnahme können die Phagosomen von HV CN mit einem Knockout-Neutrophilen entweder alkalisch oder sauer kompilieren. Schnappschüsse, die 30 bis 35 Minuten nach der Zugabe von Targets aufgenommen wurden, ermöglichen die Berechnung des durchschnittlichen kleinen pH-Werts der Population aus einer großen Anzahl von Phagosomen in den Histogrammen der hier gezeigten Fitz-Xan-Verhältnisse.

Wir konnten die Unterschiede im kleinen pH-Wert zwischen Wildtyp- und HVCN-Ein-Knockout-Neutrophilen sehen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs Stunden durchgeführt werden. Beginnend mit dem Optimierungsschritt beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Bildgebungsbedingungen zu optimieren. Erstens kann auch die Optimierung der Antikörperkonzentration für den Optimierungsschritt hilfreich sein, um eine robuste Phagozytose nach diesem Verfahren zu gewährleisten.

Andere Methoden wie die Messung der Ross-Produktion oder die Messung der bakteriellen Abtötung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob der geringe Ross oder die Fähigkeit des Phagosoms, Bakterien abzutöten, zusammen mit dem pH-Wert nach seiner Entwicklung verändert wird. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Phagozytenbiologie den Weg, um zu untersuchen, welche Faktoren die Fähigkeit von Phagozytenzellen beeinflussen, die aufgenommenen Materialien abzutöten oder zu verarbeiten, um weitere Immunreaktionen hervorzurufen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man geometrische Fluoreszenzmikroskopie durchführt, um physiologische Parameter von Phagosomen in Echtzeit in lebenden Zellen zu messen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit UNIFOR-Inhibitoren und lebenden Zellen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.