Name: Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Lernen Sie die ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie zur Messung des Phagosomen-pH in lebenden Phagozyten. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von pH-Änderungen und liefert Einblicke in die Phagosomenreifung sowie Pathogen-Interaktionen.

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Die Autoren werden finanziell unterstützt vom Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung Nr. 31003A-149566 (an N.D.) und vom Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust durch eine Subvention für junge Forscher (an P.N.).

Ethik Hinweise: Alle Tier Manipulationen wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierforschungsausschuss der Universität Genf durchgeführt. 1. Herstellung von Phagozytische Ziele <ol><li> Werden 20 mg getrocknetes Zymosan bis 10 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Wirbel und in einem kochenden Wasserbad für 10 min. Kühl und Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand resuspendieren in 1 ml PBS und beschallen für 10 Minuten in einem Wasserbad Ultraschallgerät. Übertragen Sie 500 ul zu zwei 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifugieren bei 11.000 xg für 5 min. </li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 500 ul PBS. Die gekochten Zymosan kann aliquotiert werden, eingefroren und bei -20 ° C gelagert. </li><li> Zweimal waschen Zymosan in 500 ul frisch hergestellte 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3, wie oben beschrieben (Schritt 1.2). </li><li> Resuspendieren in 490 &amp; mgr; l nach dem letzten Waschen. Zugabe von 10 ul 10 mg / ml FITC in Dimethylsulfoxid gelöst sulfoxide (DMSO), Wirbel, mit Folie abdecken, und Inkubation unter Rühren 4 Stunden bei RT. </li><li> Um ungebundene Farbe zu entfernen, wie oben (Schritt 1.2) waschen, zuerst mit 0,5 ml DMSO + 150 &amp; mgr; l PBS, dann 0,5 ml DMSO + 300 &amp; mgr; l PBS, dann 0,5 ml DMSO + 450 &amp; mgr; l PBS, dann PBS alleine. </li><li> Graf Zymosan mit einem Hämocytometer. 1 ul Zymosan zu 500 ul PBS, Wirbel, dann werden 10 &amp; mgr; l an den Rand des Hämocytometer Kammer, wo es das Deckglas über das zentrale Netz platziert erfüllt. Montieren Sie das Hämocytometer auf einer Hellfeld-Mikroskop mit einem 20x-Objektiv ausgestattet. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der oberen linken Ecke, die 16 Plätze und zählt alle Zymosan Partikel in diesem Bereich mit einem Handtallykostenzähler. Wiederholen Sie mit der rechten unteren Ecke. Berechnen die Zymosan-Konzentration unter Verwendung der folgenden Gleichung: Zymosan Konzentration = Count / 2 x 500 x 10 4 Zymosan / ml. Markierten Zymosan kann aliquotiert werden, eingefroren und bei -20 ° C gelagert. </li><li> Opsonisieren das markierte Zymosan with ein Kaninchen-Anti-Zymosan Antikörper bei 1: 100 Verdünnung. Vortex und Inkubation für 1 Stunde in einem 37 ° C Wasserbad. Mit 500 &amp; mgr; l PBS waschen, wie oben beschrieben (Schritt 1.2). Hinweis: Die Beschallung ist sehr zu empfehlen, vor allem nach Opsonisierung, wie Zymosan neigt dazu, Klumpen, die später auf der Analyse erschweren kann bilden. Opsonisierung mit 65% v / v Ratten- oder Humanserum kann als Alternative verwendet werden. </li><li> Zählen Zymosan mit einem Hämocytometer wie in den Schritten 1.7-1.8 beschrieben, und mit Wasser auf 100 x 10 &amp; sup6; Teilchen / ml. Opsonisierung mit anderen phagozytischen Stimulatoren wie Komplement oder keinen Opsonierung kann alternativ durchgeführt werden. </li></ol> 2. Live Video-Mikroskopie <ol><li> Isolieren primäre Maus Neutrophilen, wie an anderer Stelle ausführlich beschrieben 38. <ol><li> Alternativ können Sie jede phagozytischen Zelltyp. Halten Neutrophilen auf Eis in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 5% fötalem Kälberserum (v / v), 200 U Penicillin / streptomyci ergänztn, in einer Konzentration von 10 x 10 6 Zellen / ml bis zur Verwendung. Andere Zelltypen kann 1-4 Tage vor ausgesät werden. </li></ol></li><li> In 2 × 10 5 (20 ul) von Neutrophilen an der Mitte einer 35 mm Glasbodenschale, verbreiten sie den Tropfen durch Zugabe von 50 ul Medium und bei 37 ° C für 5 Minuten, damit Zellen zu haften. </li><li> 1 ml ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) bis 37 ° C, die die spezielle MPO-Inhibitor 4-Amino-hydrazid (4-ABH, 10 &amp; mgr; M) erwärmt. Unspezifische MPO-Inhibitoren, wie Natriumazid (5 mM), können ebenfalls verwendet werden, jedoch wurden kürzlich vorgeschlagen, um zusätzliche nicht-spezifischen Effekte auf pH 39 auszuüben. </li><li> Montieren Sie den Teller auf einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit einem 37 ° C Heizungsanlage und einem 40X Öl-Objektiv ausgestattet. Inkubieren Zellen ohne Bildgebung für 10 Minuten, damit Zellen und Anlagen ins Gleichgewicht. </li><li> Passen Sie die Mikroskopeinstellungen, um eine TEM-Hellfeldbild zu erwerben [phase oder Differentialinterferenzkontrast (DIC), falls verfügbar] mit 440 nm oder 490 nm Anregungs- und 535 nm Emissions alle 30 sec. </li><li> Die Belichtungszeit und die Erfassungsfrequenz entsprechend dem Mikroskopsystem zu viel Photobleichen und Phototoxizität und in Abhängigkeit von den experimentellen Fragen gestellt vermeiden. Start der Bildaufnahme. </li><li> Nach 2 min, fügen Sie 10 x 10 6 (50 ul) opsonisiertes FITC-Zymosan in die Mitte der Schale. Einstellen target: Zellverhältnissen in Abhängigkeit von der Art von Phagozyten und Ziel verwendet. </li><li> Weiterhin Bildgebung für 30 min. Nach 30 Minuten beenden Sie den Zeitraffer-Akquisition und starten Sie einen Timer. Bewegen Sie die Bühne und erfassen 10 oder mehr Snapshots in unterschiedlichen Sicht für Bild in anderen Phagosomen, alle innerhalb von 5 min. </li></ol> 3. Kalibrierung und Kontrollexperimente <ol><li> Vorbereitung der pH Kalibrierlösungen (Rezepturen sind in Tabelle 1 beschrieben) vor dem Tag des Experiments und gefrier in 10 ml-Aliquots.Tauen die Kalibrierungslösungen und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. Den pH-Wert mit einem pH-Meter und Aufzeichnung der tatsächlichen pH-Wert der Lösungen. </li><li> Montieren Sie eine peristaltische Pumpe an der Bodenschale Glas vor der Bildaufnahme und führen Sie Live-Videomikroskopie, wie oben (Abschnitt 2) beschrieben. </li><li> Am Ende der 30 Minuten Erfassungsperiode schalten Sie die Pumpe auf, um die Lösung in der Schale zu entfernen, fügen Sie 1 ml der erste Kalibrierungslösung und die Pumpe stoppen. </li><li> Warten Sie, bis das Signal stabilisiert, in der Regel 5 min. Wiederholen Sie mit die Eichlösungen. <ol><li> Zuführen mindestens eine Kalibrierung pro Versuchstag und kalibrieren, beginnend mit dem höchsten pH-Wert und arbeiten sequentiell auf den niedrigsten, sowie ausgehend von dem niedrigsten pH-Wert und arbeiten sequentiell in Richtung der Höhe. </li></ol></li><li> Als Kontrolle wurden 100 ul 100 uM NADPH-Oxidase-Hemmer diphenyl propionium Iodid (DPI) in HBSS, um Zellen in der Bodenschale Glas verdünnt in 900 &amp; mgr; l HBSS, undInkubation für 10 min. </li><li> Starten Akquisition und fügen Zymosan wie oben (Schritt 2.7). Nach 15 min der Phagozytose, mit 10 ul 10 uM V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A (ConcA) in HBSS verdünnt und weiter Bildgebung für weitere 15 min. </li></ol> 4. Analyse <ol><li> Analyse von Zeitraffer-Filmen und Phagosom Snapshots. Hinweis: Die folgenden Anweisungen spezifisch für ImageJ sind. Schritt-für-Schritt-Anleitungen können in Abhängigkeit von der verwendeten Software unterschiedlich sein, aber die in diesem Abschnitt beschriebenen Funktionen sind in den meisten professionellen Bildanalyse-Software. <ol><li> Öffnen Sie die Bilder mit professionellen Bildanalyse-Software. Subtrahieren Sie den Hintergrund in der 490-Kanal, indem ein kleines Quadrat ROI mit dem Quadrat Polygon Auswahl-Werkzeug in einem Bereich, wo es keine Zellen, und klicken Sie auf Plugins&gt; BG Subtraktion von ROI. Dann laden Sie die gleiche ROI auf der 440-Kanal, indem Sie auf Bearbeiten&gt; Auswahl&gt; Auswahl wiederherstellen und wiederholen. </li><li>Machen Sie eine 32-Bit-Verhältnis Bild des 490 Kanal geteilt durch die 440-Kanal, indem Sie Prozess&gt; Bild Calculator ..., eine entsprechende Bilder in den Image1 und Image2 Dropdown-Menüs, wählen Sie dann &#39;Teilen&#39; im Dropdown-Menü Bedienung und die Überprüfung der 32-bit (float) Ergebnis Kontrollkästchen. </li><li> Ändern Sie die Farbcodierung Verweistabelle auf ein Verhältnis-kompatiblen Farbcodierung, indem Sie auf Bild&gt; Lookup Tables&gt; Rainbow RGB. Threshold das Verhältnis Bild, um es durch Anklicken zu beseitigen Bild 0 und unendlich Pixel&gt; Anpassen&gt; Schwellenwert .... Passen Sie die Bildlaufleisten, so dass Zymosan in rot angezeigt wird, und klicken Sie auf Anwenden, sicherstellen, dass die Set Hintergrundpixel Kontrollkästchen NaN, um ausgewählt. </li><li> Kombinieren Sie dieses Verhältnis Stapel mit der Hellfeld-Kanal in einem Mehrkanal-Verbund indem Sie auf Bild&gt; Farbe&gt; Merge Kanäle, und die Auswahl der Hellfeldbild in der grauen Kanal Dropdown-Menü und das Verhältnis Bild im Grünkanal im Dropdown-Menü, und Auswählen desHalten Sie Quellbilder Check-Box. Scannen Sie die Zeitraffer-Filme oder Snapshots, um festzustellen, die Phagosomen analysiert werden sollen. Die Hellfeldkanal ist sinnvoll, für diese. </li><li> Zeichnen Sie Bereiche von Interesse (ROI) mit dem ovalen Polygon-Auswahl-Werkzeug in der Umgebung von Phagosomen und fügen Sie sie der ROI-Manager, indem Sie auf Analysieren&gt; Tools&gt; ROI Manager&gt; hinzufügen. Messen Sie ihren Zymosan Intensitätsverhältnis, indem Sie auf Mehr&gt; Multi-Measure und Abwahl der eine Zeile pro Stück Kontrollkästchen. </li><li> Für Zeitraffer-Filme, Phagosomen Spur ein zu einer Zeit, indem eine ROI, tippen Sie Strg + M zu jedem Zeitpunkt zu messen, und das Bewegen des ROI, wenn notwendig, um Intensitätswerte über die Zeit zu verfolgen. Kopieren Sie die Messungen aus dem Ergebnisfenster in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Anmerkung: Analyse von 15 (5 Zeitverläufe pro Experiment x 3) unabhängigen Experimenten ist ideal, aber in Abhängigkeit von der beobachteten Variabilität kann mehr oder weniger erforderlich sein. Speichern der ROIs wird immer empfohlen. Einige Softwarepakete ermöglichen Bild registration und dynamische Aktualisierung von ROIs, diesen Teil der Analyse zu erleichtern. </li></ol></li><li> Umwandlung von Fluoreszenz auf pH-Werte <ol><li> Messen Sie das Verhältnis 490/440 für Phagosomen in den Kalibrierungs Zeitraffer-Filme, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben. </li><li> In einer Tabellenkalkulation, zeichnen die Verhältniswerte über die Zeit und berechnet die Durchschnittsverhältniswerte von allen Phagosomen innerhalb des Sichtfeldes (gewöhnlich 5-20) 5 Zeitpunkten innerhalb der Mitte der Zeitperiode entsprechend jedem pH-Kalibrierung Lösung. (Siehe auch die roten Kästen in 5A.) </li><li> Zeichnen Sie diese durchschnittlich 490/440 Ratio-Werte gegenüber dem tatsächlich gemessenen pH-Wert. Kombinieren Sie mindestens 3 unabhängigen Kalibrierungen in einem einzigen Graphen. Verwenden Sie einen statistischen oder numerische Software-Paket, um eine nichtlineare Regression (Best-Fit-Kurve) durchführen, in der Regel an einen sigmoidalen Gleichung. Hinweis: Zum Beispiel in 5B die Gleichung verwendet wurde, war eine Boltzmann sigmoidal [Y = Bottom + ((Oben-Unten)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], wobei Y-Werte sind die 490/440-Verhältnisse, X sind die pH-Werte und die Oben, Unten, sind V50 und Steigungsparameter von der Software berechnet. </li><li> Verwenden Sie die erhaltene Gleichung zur Verhältniswerte um pH zu verwandeln. Hinweis: Zum Beispiel in 5B die für die Eichkurve in Gegenwart von Natriumazid erhalten Gleichung 490/440 Verhältnis = 1,103 + [(2,89 bis 1,103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Die Auflösung nach pH ergibt die folgende Gleichung: pH = 6,993 - 0,9291 * [LN ((1,178 / (Ratio-1.103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Obwohl zeitaufwendiger als alternative Verfahren, wie Spektroskopie und FACS, die eine ähnliche Strategie unter Verwendung eines pH-empfindlichen Farbstoff, Ziele gekoppelt einzusetzen, sondern messen die durchschnittliche pH-Wert einer Population von Phagosomen, bietet mikroskopische mehrere Vorteile. Erste ist, dass innere und äußere gebunden, aber nicht internalisierten Partikel können leicht unterschieden werden, ohne andere Chemikalien, wie Trypan-Blau oder Antikörper hinzuzufügen, Abschreckhärtung oder Etikett ext...

Phagozytose, der Prozess, durch den angeborene Immunzellen große Partikel verschlingen, hat sich aus dem Fressmechanismus einzelliger Organismen entwickelt und beinhaltet die Bindung an ein Ziel, das Umhüllen mit einer Membran und das Einklemmen der Membran, um eine Vakuole innerhalb des Zytosols zu bilden, die als Phagosom bezeichnet wird. Während die phagosomale Membran von der Plasmamembran abgeleitet ist, verwandeln aktive Protein- und Lipidsortierung sowie die Fusion mit Endomembranen während der Phagosomenbildung das Phagosom in ein eigenständiges Organell innerhalb der Zelle mit abbauenden Eigenschaften, die die Abtötung, Neutralisierung und den Abbau des aufgenommenen Materials ermöglichen1-3. Dieser Prozess, der als phagosomale Reifung bezeichnet wird, beruht auf der Abgabe einer Vielzahl von proteolytischen und mikrobiziden Enzymen, einschließlich der Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH)-Oxidase, die Elektronen in Phagosomen überträgt und das starke Oxidationsmittel O2- und seine abgeleitete reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 2,4 produziert. 
Der luminale pH-Wert von Phagosomen hat einen tiefgreifenden Einfluss auf mehrere Ereignisse, die für die Funktion der Phagosomen erforderlich sind. Erstens beeinflusst der pH-Wert den Transport von Endomembranen im Allgemeinen, da pH-abhängige Konformationsänderungen von Transmembran-Transportregulatoren die Rekrutierung von Transportdeterminanten wie Arfs, Rabs und vesikulären Hüllproteinen verändern, die wiederum definieren, welche Vesikel mit den Phagosomen 5-8 fusionieren können. Zweitens wird auch die ionische Zusammensetzung des phagosomalen Lumens mit zunehmender Reife der Phagosomen verändert, und einige Ionentransporter, wie der Na+/H+-Austauscher oder die ClC-Familie Cl-/H+-Antiporter, die die phagozytäre Funktion fördern, beruhen auf der H+-Translokation 9,10. In ähnlicher Weise ist die ROS-Produktion eng mit dem phagosomalen pH-Wert verbunden. ROS und seine toxischen oxidativen Nebenprodukte sind seit langem als entscheidend für die phagosomale Abtötung von Neutrophilen anerkannt 4,11,12 und es wurde gezeigt, dass sie eine entscheidende Rolle in anderen Phagozyten spielen, einschließlich Makrophagen, dendritischen Zellen (DCs) und Amöben 13-16. Die NADPH-Oxidase ist ein elektrogenes Enzym, das H+ im Zytosol freisetzt, wenn NADPH verbraucht wird, und das den gleichzeitigen Transfer von H+ über begleitende HVCN1-Kanäle neben den transportierten Elektronen in das phagosomale Lumen erfordert, um die massive Depolarisation zu mildern, die sonst zu einer Selbsthemmung des Enzyms 17-21 führen würde. Schließlich haben mehrere proteolytische Enzyme eine optimale Aktivität bei unterschiedlichem pH-Wert, so dass zeitabhängige phagosomale pH-Änderungen beeinflussen können, welche Enzyme wann aktiv sind. Die Bedeutung des phagosomalen pH-Werts wird durch Organismen wie Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis und Salmonella typherium unterstrichen, die die phagozytäre Abtötung zumindest teilweise untergraben, indem sie den phagosomalen pH-Wert von 22-24 verändern.
Bei Säugetieren sind die Hauptphagozyten Neutrophile, Makrophagen und dendritische Zellen, und je nach Zelltyp können zeitabhängige phagosomale pH-Änderungen stark variieren und scheinen unterschiedliche Rollen zu spielen. In Makrophagen ist eine starke und schnelle Ansäuerung, die durch die ATP-abhängige vakuoläre ATPase (V-ATPase) der Protonenpumpe vermittelt wird, einer der Schlüsselfaktoren für die Abtötung 25-27, ähnlich den Mechanismen in Amöben, die die Phagozytose als Fressmechanismus nutzen 28. In diesen Zellen wird vermutet, dass die Aktivierung von sauren Proteasen eine Schlüsselrolle spielt. Im Gegensatz dazu beruht die Abtötung von Neutrophilen mehr auf ROS sowie HOCl, die von der Myeloperoxidase (MPO)11 produziert werden, und der pH-Wert bleibt während der ersten 30 Minuten neutral oder alkalisch, um erst später anzusäuern 29,30. Es wird vorgeschlagen, dass ein neutraler pH-Wert die Aktivität oxidativer Proteasen wie bestimmter Cathepsine begünstigt. In DCs ist der phagosomale pH-Wert umstritten, wobei einige über eine Versauerung und andere über einen neutralen oder alkalischen pH-Wert berichten 31,32, aber ROS und pH können die Fähigkeit dieser Zellen, Antigene an T-Zellen zu präsentieren, eine ihrer Hauptfunktionen, tiefgreifend beeinflussen 33. 
Wichtig ist, dass Hormone, Chemokine und Zytokine Signalereignisse hervorrufen können, die die Reifung und Veränderungen im Verhalten der Phagozyten induzieren und wiederum den phagosomalen pH-Wert von 34,35 beeinflussen. In ähnlicher Weise können Medikamente, zum Beispiel das Malariamittel Chloroquin, das auch für Krebstherapien in Betracht gezogen wird 36, den phagosomalen pH-Wert und damit die Immunergebnisse beeinflussen. Daher könnte eine Vielzahl von Zellbiologen, Immunologen, Mikrobiologen und Arzneimittelentwicklern an der Messung des phagosomalen pH-Werts interessiert sein, wenn es darum geht, die Mechanismen zu verstehen, die den Auswirkungen einer bestimmten genetischen Störung, einer bioaktiven Verbindung oder eines Mikroorganismus auf die angeborene und adaptive Immunantwort zugrunde liegen. 
Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung des phagosomalen pH-Werts bei Neutrophilen, die es uns ermöglichte, die Bedeutung des HVCN1-Kanals bei der Regulierung des phagosomalen pH-Werts von 19 bei Neutrophilen zu zeigen. Das Verfahren basiert auf der ratiometrischen Eigenschaft von Fluoresceinisothiocyanat (FITC), dessen Fluoreszenzemission bei 535 nm pH-empfindlich ist, wenn es bei 490 nm angeregt wird, nicht aber bei 440 nm 37. Wenn dieser Farbstoff chemisch an ein Ziel, in diesem Fall Zymosan, gekoppelt ist, kann dies mit Hilfe der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie verfolgt werden, bei der Zellen während der Phagozytose abgebildet und phagosomale pH-Änderungen in Echtzeit gemessen werden, während das Phagosom reift. Der tatsächliche pH-Wert wird dann durch die Durchführung eines Kalibrierungsexperiments ermittelt, bei dem Zellen, die phagozytiert wurden, Lösungen mit unterschiedlichem pH-Wert ausgesetzt werden, die die Ionophore Nigericin und Monensin enthalten, die ein schnelles Gleichgewicht des pH-Werts innerhalb der Phagosomen mit der externen Lösung ermöglichen. Die Verhältniswerte werden dann mit dem bekannten pH-Wert von Lösungen verglichen, eine Kalibrierkurve wird durch nichtlineare Regression konstruiert und die resultierende Gleichung zur Berechnung des pH-Werts aus dem Verhältniswert verwendet.

<table><tbody><tr><td>Zymosan A Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4250</td><td>Es gibt verschiedene Anbieter</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Es gibt verschiedene Anbieter</td></tr><tr><td>Anti-Zymosan Antikörper (Zymosan A Bioparticles opsonisierendes Reagenz)</td><td>Life Technologies</td><td>Z2850</td><td>Sigma-Aldrich O6637 ist ein gleichwertiges Produkt. Alternativ kann 25% Serum als opsonisierendes Reagenz verwendet werden.</td></tr><tr><td>4-Aminobenzoehydrazid (4-ABH)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-204107</td><td>Giftig, Handschuhe verwenden, verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>Diphenyleniodoniumchlorid (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Giftig, Handschuhe verwenden, verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>Concanamycin A (ConcA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27689</td><td>Giftig, Handschuhe verwenden, verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Giftig, verwenden Sie Handschuhe, verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-026-G001</td><td>Giftig, verwenden Sie Handschuhe, verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14200-075</td><td>Giftig, verwenden Sie Handschuhe, verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>Hank's Balance Salzlösung</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Ringer's balanced salt solution oder andere klare physiologische Puffer können ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Natriumcarbonat (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td>Verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td>Es existieren verschiedene Anbieter</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glukamin (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td>Es existieren verschiedene Anbieter</td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3777</td><td>Verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&nbsp;</td><td>Es existieren verschiedene Anbieter</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Verschiedene Anbieter existieren</td></tr><tr><td>Petrischalen mit Glasboden 35 mm (Fluorodish)</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Ibidi & micro;-klare Schalen oder Deckgläser mit entsprechenden Bildgebungskammern können verwendet werden</td></tr><tr><td>Beschallungswasserbad</td><td>O. Kleiner AG</td><td></td><td>Es kann ein Ultraschallgerät verwendet werden, es gibt verschiedene Geräteanbieter</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Marienfeld GmbH</td><td></td><td>Es gibt</td></tr> <tr><td>verschiedene GeräteanbieterWeitfeld-Live-Imaging-Mikroskop</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Es gibt verschiedene Geräteanbieter, aber das Mikroskop muss in der Lage sein, 440/535 bzw. 490/535 Anregung/Emission abzubilden. Konfokale Spinnscheiben-Setups mit Hellfeldfunktionen können ersetzt werden, aber Zymosan neigen dazu, häufiger unscharf zu werden. &nbsp;</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe (Dynamax RP-1)</td><td>Rainin</td><td></td><td>Es gibt verschiedene Anbieter von Instrumenten</td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Schott Gerät GmbH</td><td></td><td>Verschiedene Anbieter von Instrumenten Manual</td></tr><tr><td>Counter</td><td>Milian SA</td><td></td><td>Verschiedene Anbieter von Instrumenten</td></tr></tbody></table>

mess phagosomen ph durch ratiometrische fluoreszenzmikroskopie

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagozytose ist ein grundlegender Prozess, durch den angeborenen Immunzellen zu verschlingen Bakterien, apoptotischen Zellen oder andere Fremdkörper, um zu töten oder zu neutralisieren, die verschluckt Material oder um sie als Antigene zu präsentieren und zu initiieren adaptiven Immunantwort. Der pH der Phagosomen ist ein kritischer Parameter zur Regelung Spaltung oder Fusion mit Endomembranen und Aktivierung der proteolytischen Enzyme, Ereignisse, die phagozytischen Vakuolen in eine abbau Organell ausreifen. Zusätzlich wird die Translokation von H + zur Herstellung hoher Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die für eine effiziente Töten und Signalisierung zu anderen Wirtsgeweben erforderlich. Viele intrazelluläre Pathogene zu untergraben phagocytic Tötung durch Begrenzung phagosomalen Versauerung, der die Bedeutung der pH-Wert im Phagosom Biologie. Hier beschreiben wir eine ratiometrische Verfahren zur Messung phagosomalen pH in Neutrophilen mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -markiertem Zymosan als phagozytischen targets, und Live-Cell-Imaging. Der Test basiert auf der Fluoreszenzeigenschaften von FITC, die durch saure pH abgeschreckt wird, wenn bei 490 nm angeregt wird, aber nicht, wenn sie bei 440 nm angeregt wird, so dass die Quantifizierung von einer pH-abhängigen Verhältnis statt der absoluten Fluoreszenz eines einzelnen Farbstoffs. Ein detailliertes Protokoll zur Durchführung einer in situ-Farbstoff Kalibrierung und Umwandlung des Verhältnisses realen pH-Werten ist ebenfalls vorgesehen. Single-Farbstoff ratiometrische Verfahren werden im Allgemeinen als überlegen einzigen Wellenlänge oder Dual-Farbstoff pseudo-ratiometrische Protokolle, da sie weniger empfindlich auf Störungen, wie beispielsweise Bleich sind, konzentrieren sich ändert, Laser-Variationen und unebene Kennzeichnung, die das Messsignal verfälschen. Dieses Verfahren kann leicht modifiziert werden, um in anderen pH phagozytischen Zelltypen zu messen und Zymosan durch jede andere aminhaltige Teilchen ersetzt werden, von inerten Kügelchen zu lebenden Mikroorganismen. Schließlich kann dieses Verfahren angepaßt werden, um die Verwendung von anderen fluoreszierenden Sonden empfindlich auf unterschiedliche pH-Bereiche oder andere phagosom machenal-Aktivitäten, so dass es eine allgemeine Protokoll für die funktionelle Bildgebung des Phagosomen.

Die folgenden sind repräsentative Ergebnisse für ein Experiment, wo die phagosomalen pH-Wert der primären Maus Neutrophile aus dem Knochenmark von Wildtyp oder isoliert Hvcn1 - / - Mäuse wurden verglichen. Für ein erfolgreiches Experiment ist es wichtig, genug Phagosomen im Sichtfeld während der gesamten Dauer des Zeitraffer-Film zu erhalten, bei gleichzeitiger Vermeidung zu viele Phagosomen, die später sein wird schwieriger Segment während der Bildanalyse. 1 schema Beispi...

Der phagosomale pH-Wert beeinflusst die Phagosomenreifung, die Produktion von Oxidationsmitteln, die phagosomale Abtötung sowie die Antigenpräsentation. In dieser Arbeit beschreiben wir eine ratiometrische Methode zur Messung von Zeitverlaufs- und Endpunkt-pH-Veränderungen in einzelnen Phagosomen in lebenden Fresszellen mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Das übergeordnete Ziel dieser Versuchsreihe besteht darin, den pH-Wert in Phagosomen lebender Zellen mittels ratiometrischer Fluoreszenzmikroskopie zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Phagozytenbiologie zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung wichtiger Moleküle bei der Interaktion mit Pathogenen oder die Auswirkungen genetischer Störungen beziehungsweise von Wirkstoffen auf die Phagozytose. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass im Gegensatz zu populationsbasierten Methoden wie FACS oder Spektroskopie Effekte wie Veränderungen in der Partikelbindung, Migration oder die Heterogenität einzelner Phagosomen erfasst werden können.Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf unsere Therapien gegen pathogene chemische Organismen, da viele dieser Mikroorganismen den pH-Wert in Fragosen verändern können, um eine Zerstörung in Phagosomen zu vermeiden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie 20 Milligramm getrocknetes Xan zu 10 Millilitern steriler PBS hinzufügen, vortexen und 10 Minuten lang in einem siedenden Wasserbad erhitzen. Anschließend abkühlen lassen und fünf Minuten bei 2000 Gs zentrifugieren.Danach entfernen Sie den Übersta

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt eine hochauflösende Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskopietechnik (TIRF) zur Echtzeit-Visualisierung der Phagosomenbildung und des Verschlusses während der Makrophagen-vermittelten Phagozytose von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen (RBCs), die an der Oberfläche einer Glasbodenschale befestigt sind. Die Makrophagen dehnen Pseudopodien um die Erythrozyten aus und umhüllen sie in den Phagosomen, wodurch sie sich von der Glasoberfläche lösen.

TIRF-Mikroskopie-basierte Visualisierung der Phagosomenbildung und des Phagosomenverschlusses

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Es stehen mehrere Methoden zur Messung des intrazellulären pH-Werts zur Verfügung, aber nur sehr wenige davon ermöglichen die gleichzeitige Messung des zytoplasmatischen und organellären pH-Werts. Hier beschreiben wir detailliert eine schnelle und genaue Methode zur gleichzeitigen Messung des zytoplasmatischen und vesikulären pH-Werts durch ratiometrische Bildgebung lebender Zellen.

Gleichzeitige pH-Messung in endozytischen und Cytosolic Fächer in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagozytose von fluoreszierenden Partikeln durch adhärente Makrophagenzelllinien mit einer fluorometrischen Methode. Diese Methode ermöglicht eine Hochdurchsatz-Quantifizierung der Partikelinternalisierung sowie der daraus resultierenden Aktinpolymerisation.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau, um die Bildung und den Verschluss von Phagosomen in lebenden Makrophagen mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie in drei Dimensionen zu visualisieren. Es ermöglicht die Überwachung der Basis des phagozytischen Bechers, der sich ausdehnenden Pseudopoden sowie der genauen Stelle der Phagosomenspaltung.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Diese Handschrift beschreibt eine einfache Methode, um die phagosomalen und pH-Bereich sowie die cytoplasmatische pH von menschlichen und Maus-Neutrophilen unter Verwendung des ratiometrischen Indikatoren seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, oder S-1 zu messen. Dies wird in lebenden Zellen konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse erreicht werden.

Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Neurodegenerative Erkrankungen sind mit dysregulierten Mikrogliafunktionen verbunden. Dieser Artikel beschreibt einen In-vitro-Assay der Phagozytose von Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen. Quantitative Mikroskopie-Auslesungen werden sowohl für die Zeitraffer-Bildgebung mit lebenden Zellen als auch für die High-Content-Bildgebung mit festen Zellen beschrieben.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung und Erzeugung dynamischer Bilder der mesenchymalen Stammzell (MSC) vermittelten Regulation der Makrophagen (MΦ) Phagozytose von nicht opsonisierten Hefepartikeln (Zymosan) vorgestellt, die zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind.

Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

Wir beschreiben Protokolle zur Messung von pH-Wert, oxidativen Ereignissen und Proteinverdauung in einzelnen Makropinosomen in lebenden Zellen. Ein Schwerpunkt liegt auf der dualen fluorophoren ratiometrischen Mikroskopie und den Vorteilen, die sie gegenüber populationsbasierten Techniken bietet.

Messung des pH-Werts, der Redoxchemie und der abbauenden Kapazität von Makropinosomen mit Hilfe der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Mikroskopie

Lernen Sie die ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie zur Messung des Phagosomen-pH in lebenden Phagozyten. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von pH-Änderungen und liefert Einblicke in die Phagosomenreifung sowie Pathogen-Interaktionen.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

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